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3. Esfregaço e coloração sanguinea

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Esfregaços sanguíneos
Esfregaço sanguíneo
O esfregaço de sangue, também conhecido como distensão sanguínea ou ainda extensão sanguínea, é um teste realizado em hematologia para a contagem e a identificação de anormalidades nas células do sangue.
A confecção do esfregaço sanguíneo é, sem dúvida alguma, o ponto crucial para a realização de um hemograma confiável e por isso, a padronização do esfregaço sanguíneo deve ser uma das principais exigências de um bom laboratório de hematologia.
Seu objetivo principal é analisar a morfologia das células, fornecer informações sobre a estimativa do número de leucócitos e plaquetas, investigar problemas hematológicos, distúrbios encontrados no sangue e eventualmente parasitas, como o Plasmodium, causador da malária.
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Lâminas: novas, limpas e desengorduradas.
Lâmina extensora : borda lisa sem ranhuras ou imperfeições
Produzir uma distensão sanguínea de qualidade requer prática.
Esfregaço sanguíneo
**Esfregaços satisfatórios apresentam-se finos, homogêneos e margens livres condições importantes para manter as células sangüíneas sem deformações e convenientemente distribuídas
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Fatores que influenciam na qualidade
Velocidade - Quanto mais rápida a lâmina distensora for movida, maior e mais fina será a distensão. Quanto mais lenta a lâmina for movida, menor e mais grossa a distensão será.
Ângulo - Um ângulo maior que 30° deixa a distensão mais grossa; menor que 30° a distensão fica mais fina.
Tamanho da gota de sangue - Uma pequena gota de sangue (10-15 µL) é o suficiente para preparar uma distensão com comprimento adequado; uma gota grande pode fazer com que a distensão se estenda além do comprimento da lâmina.
Hematócrito - A viscosidade (hematócrito) do sangue, também irá afetar a distensão. O sangue de um paciente com anemia terá uma menor viscosidade e a distensão ficará muito fina se o ângulo não for aumentado. O oposto também é verdadeiro no caso de um paciente com policitemia.
Esfregaço sanguíneo
Erros na Confecção
Rapidez;
Ângulo;
Pressão;
Extensão;
Proporção da gota de sangue;
Lâminas extensoras;
Limpeza e conservação das lâminas.
 
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Materiais
Material para coleta de sangue (Ver prática de coleta de sangue)
Galerias para tubos de ensaio
Lâminas de microscopia (limpas e desengorduradas)
Lápis dermográfico
Solução de álcool-éter 50%
Lâminas distensoras
Gaze seca
Chumaços de algodão
Papel-toalha
Tubos com anticoagulante EDTA 10%
Esfregaço sanguíneo
Procedimento
Esfregaço sanguíneo
Distribuição celular
Células maiores (margens e cauda);
Células menores (central);
Composição
Porção inicial (cabeça);
Média (corpo);
Final (franja ou cauda);
Esfregaço sanguíneo
Coloração de Esfregaços sanguíneos
Principio da coloração
Coloração hematológica
O azul de metileno é um corante básico que reage com componentes ácidos das células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das proteínas. Estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas. São exemplos: heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. Cor: azul.
A eosina é um corante ácido que reage com componentes básicos das células e tecidos. Quando usada juntamente com corantes básicos como o azul de metileno, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.
Corante básico → cora estruturas ácidas, chamadas basófilas 
Corante ácido → cora estruturas básicas, chamadas acidófilas/eosinófilas
Corante ácido - eosina: – afinidade por substâncias alcalinas – citoplasma • Corante alcalino - azul de metileno – afinidade por substâncias ácidas – núcleo
Estruturas celulares que se coram em pelo Azul de Metileno são chamadas de basófilas (corando-se de azul) 
Estruturas celulares que se coram pela Eosina são chamadas de acidófilas (corando-se em rosa)
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Corantes do Tipo Romanovsky 
São misturas que contem eosina e azul de metileno dissolvidos em metanol.
A diferença entre os vários corantes derivados do corante primitivo de Romanowsky acha-se na proporção que se emprega de azul-de-metileno e de eosina, ou no método de tratamento do azul-de-metileno, antes de sua combinação com a eosina
Coloração hematológica
May-Grunwald-Giemsa, Leishman e Wright
O corante de May-Grunwald (1902) é uma mistura de eosina e azul de metileno (não oxidados), que quimicamente se transforma em eosinato de azul de metileno.
Giemsa (Alemanha) desenvolveu, no mesmo período, um corante que leva seu nome e que hoje se sabe ser uma mistura de azur II (mistura equimolar de azur 1 e azul de metileno) e eosinato de azur II (corante formado pela combinação equimolar de azur 1, azul de metileno e eosina amarelada).
Esses dois corantes são utilizados através de um método de coloração mais demorado, em que, após fixação e coloração pelo May Grunwald, se processa uma segunda coloração com solução de Giemsa, obtendo-se um resultado final melhor e mais detalhado.
A necessidade de um único corante, que pudesse corar globalmente os elementos celulares com os detalhes do MG-Giemsa, levou ao desenvolvimento de novos corantes: Leishman (Inglaterra,1901) e Wright (Inglaterra,1902). São corantes basicamente idênticos, compostos de eosina amarelada e produtos de oxidação do azul de metileno. A diferença entre ambos se restringe ao fato de que o processo de maturação é mais longo na feitura do corante Leishman (em pó).
Estes  corantes  são  dissolvidos  em  álcool  (em  geral  metanol).
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Característica da coloração
Macroscópica
Adequada: 
cor rosa-mate uniforme;
Inadequadas:
Vermelho intenso (eosina):  ácido ou  tempo;
Cinza ou cinza-azulado ou esverdeado:  alcalino ou  tempo;
Esfregaços espessos (bordas legíveis);
Esfregaços delgados (pálidos);
Microscópica
Adequada: 
plaquetas azuladas e finas granulações azurófilas;
Inadequadas
Coloração ácida ou insuficiente: plaquetas azul pálido;
Coloração alcalina ou excessiva: plaquetas púrpura escuro;
Coloração hematológica
Corante Wright
Pó corante de Wright (Eosina +Azul de metileno seg. Wright).......2,4 g
Álcool metílico puro .................................................................. 1000 mL
Pulverizar o pó do corante completamente, até se tornar bem fino. Adicionar o corante ao metanol no frasco. Homogeneizar de uma em uma hora por 12 horas. Deixar em processo de maturação por uma semana, ao abrigo da luz. Filtrar antes do uso. (validade do preparo - 01 ano)
Reagente higroscópico e volátil. Manter sempre bem tampado.
Coloração hematológica
TÉCNICA Colocar a lâmina no suporte de coloração. 1- Recobrir o esfregaço com 20 gotas do corante. Aguardar de um a três minutos. 2- Adicionar 20 gotas de água de torneira. Homogeneizar a mistura corante e água. Aguardar a coloração de três a cinco minutos. 3- Lavar a lâmina em água corrente. 4- Deixar secar em posição vertical. 5- Examinar com objetiva de imersão.
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Corante Wright
TÉCNICA 
Colocar a lâmina no suporte de coloração.
Recobrir o esfregaço com 20 gotas do corante. Aguardar 3 min. 
Adicionar 20 gotas de água de torneira. 
Homogeneizar a mistura corante e água. Aguardar a coloração de 5 a 11 minutos. 
Lavar a lâmina em água corrente. 
Deixar secar em posição vertical. 
Examinar com objetiva de imersão.
Coloração hematológica
TÉCNICA Colocar a lâmina no suporte de coloração. 1- Recobrir o esfregaço com 20 gotas do corante. Aguardar de um a três minutos. 2- Adicionar 20 gotas de água de torneira. Homogeneizar a mistura corante e água. Aguardar a coloração de três a cinco minutos. 3- Lavar a lâmina em água corrente. 4- Deixar secar em posição vertical. 5- Examinar com objetiva de imersão.
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Coloração hematológica
RESULTADOS 
Hemácias: Coloração rósea pardacento. 
Plaquetas: Coloração azulada. 
Linfócitos: Núcleo azul violeta e o citoplasma azul. 
Neutrófilos: Núcleo