Aula 8 Tecnologia do DNA recombinante e técnicas de hibridização de ácidos nucleicos

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UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
BASES DA BIOLOGIA MOLECULAR
 Prof. William Volino 
 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE E TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 
 
 
						
Tecnologia do DNA Recombinante
 
 
	Técnicas que visam o isolamento de genes e a introdução de genoma exógeno em outros organismos.
Envolve:
 
Organismo doador
Vetor
DNA Recombinante
Organismo receptor
 
						
Tipos de vetores
 
Fagos 
Plasmídeos 
Cosmídeos 
Cromossomos artificiais
 
 
 
						
 
 
 
						
Etapas:
 
A – Isolamento do DNA
 
	DNA genômico nuclear (células eucariontes)
 
	DNA genômico principal (bactérias)
 
	DNA do vetor (plasmidiano)
 
Cada qual requer uma técnica em especial
 
 
 
						
B – Corte do DNA
 
	Enzimas de restrição
 
Origem – produzidas por bactérias
Corta especificamente a sequência do DNA
Os sítios de corte possuem 4 a 6 bases (Palíndromo)
 
Ex. EcoRI 5’ – G/AATTC – 3’
 3’ – CTTAA/G – 5’
 
Formam-se pontas adesivas que favorece a formação de quimeras de DNA (doador e vetor)
 
 
 
						
 
 
 
						
 
 
C – União do DNA
 
Doador e vetor são digeridos com a mesma enzima
As pontas adesivas iguais se unem
 
						
 
 
 
						
D – Amplificação do DNA Recombinante
 
	Produção de clones de DNA
 
1 - Transformação de bactérias
	
	Origem da variabilidade genética em bactérias:
 
Conjugação
Transdução
Transformação
 
Obs. A transformação é rara na natureza.
 
 
 
						
 
 
 
						
 
 
Requer DNA livre num meio de cultura
Depende da Competência: capacidade de receber DNA exógeno
Presença de receptores de DNA na membrana
Capacidade de incorporar o DNA ao genoma
 
Métodos:
 
Indução da competência – cátions
Criação de poros na membrana – eletroporação
Biobalística – micropartículas aceleradas de ouro ou tungstênio.
 
O DNA introduzido se autoreplica e dá origem a várias cópias
A seleção pode ser feita através do uso de antibióticos.
 
						
 
 
 
						
 
 
 
						
 
 
 
						
Aplicações da Tecnologia do DNA Recombinante
A - Produção de Bibliotecas Genômicas
 
Coleção de clones de moléculas de DNA
O tipo de biblioteca depende do tipo de vetor utilizado na produção do DNA recombinante
	De vírus – quando o vetor é um fago
	De bactérias – quando o vetor é um plasmídeo ou cosmídeo
 
 
 
						
 
 
 
						
B - Transgênese de bactérias
 
Inserção de genes eucariontes em bactérias para que estas sintetizem proteínas de difícil obtenção
Utilizada na produção de insulina e hormônio de crescimento humano
 
 
 
							
 
 
 
							
C - Transgênese de eucariontes
 
O genoma de eucariontes é muito maior, requerendo modificações das técnicas
Os genes são introduzidos por transformação, injeção, infecção viral ou por biobalística
O DNA exógeno quase sempre faz integração, pois são raros os plasmídeos de replicação autônoma em eucariontes
 
 
 
 
							
 
 
 
							
D - Engenharia genética de leveduras
 
	Saccharomyces cerevisiae
Levedura de grande interesse econômico em diversos segmentos da indústria
São criados cromossomos artificiais chamados de YAC
 
Adiciona um centrômero em um plasmídeo, para que ele seja dividido entre as células filhas
Adiciona telômeros nas extremidades para que se torne linear
 
Os cromossomos artificiais são usados como vetor para grandes segmentos de DNA em células eucariontes
 
 
 
							
 
 
 
Técnicas de Hibridização
 
 
 
Utilizadas para detecção de ácidos nucléicos DNA ou RNA 
A hibridização de ácidos nucléicos consiste das seguintes etapas:
O ácido nucléico de cadeia dupla é desnaturado para a separação das cadeias. 
As cadeias simples do ácido nucléico são imobilizadas em um suporte sólido, geralmente uma membrana de nylon ou nitrocelulose, para impedir que as cadeias se reassociem. 
 
 
 
Uma sonda (DNA de fita simples ou RNA; de origem conhecida – contendo a sequência de nucleotídeos específica àquela alvo – conjugada com um isótopo radioativo ou enzima) é incubada com a membrana. 
Ocorre a formação de pontes de hidrogênio entre as bases complementares. As sondas que não se ligaram são removidas por lavagem e a hibridização é detectada através de um método de detecção da sonda. 
 
 
 
 
			
	
 
 
Vários tipos de hibridização em suporte sólido são utilizados:
Hibridização Southern. Técnica utilizada para a detecção de um fragmento de DNA específico.
Hibridização Northern. Utilizada para detectar sequências específicas de RNA.
 
			
	
 
 
 
 
Hibridização de Proteínas
 
	Western Blot 
	 
Detecta pequenas quantidades de proteínas adsorvidas numa membrana de nitrocelulose
Usa-se um anticorpo anti-anticorpo ligado a uma enzima e um substrato, para detectar o anticorpo aderido na membrana.
 
 
Marcadores moleculares
 
 
São características do DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdados geneticamente.
Responsáveis pela variabilidade genética e pelo polimorfismo de DNA.
 
 
RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Polimorfismo no comprimento de fragmentos
Utiliza-se de enzimas de restrição (endonucleases)
Variação na presença ou ausência de sequências específicas de 4 a 8 pb
 Análise dos fragmentos feita por eletroforese em gel e separação dos fragmentos
Também por transferência de Southern e hidridação com sondas especificas
 
 
 
 
DNA Fingerprinting (minisatélites)  
 
É o padrão de características únicas do DNA de cada indivíduo em uma população
Deve-se a presença de sequências repetitivas simples dispersas no genoma
A análise é feita utilizando enzimas de restrição:
 
As enzimas reconhecem sítios adjacentes às sequências repetidas e resulta em fragmentos de diferentes tamanhos, proporcionais ao número de unidades repetitivas numa região do genoma
 
 
Devido ao alto número de regiões genômicas que contém estas sequências e a variabilidade das mesmas, o padrão de fragmentos resultante e característico de cada indivíduo
 
Esta característica de um indivíduo é herdada dos seus progenitores, por isso muito se aplica a estudos de parentesco