Resumo Biotecnologia e Bioinformática AV1

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Resumo Biotecnologia e Bioinformática AV1
INTRODUÇÃO À BIOTECNOLOGIA
Biotecnologia é o conjunto de procedimentos envolvendo manipulação de organismos vivos para fabricar ou modificar produtos.
As suas principais aplicações são na agricultura, mineração/meio ambiente, pecuária, processos fermentativos/alimentação, saúde e industrial.
DNA RECOMBINANTE
São moléculas de DNA produzidas a partir da combinação de sequências de DNA proveniente de diferentes fontes. Conjunto de técnicas que visam o isolamento de genes e a introdução de genoma exógeno em outros organismos.
Algumas de suas aplicações são: contribuição para estudos genômicos, transgênicos, farmacologia, criação de vacinas sintéticas, bactérias especializadas e setor produtivo agropecuário.
Etapas da Tecnologia do DNA Recombinante
· O gene de interesse é inserido no DNA do vetor;
· O DNA do vetor recombinante é introduzido em uma célula como uma bactéria (replicação do DNA recombinante);
· A célula contendo o vetor recombinante é então multiplicada em cultura para formar um clone de muitas células geneticamente idênticas;
· Cada uma delas levando uma cópia do vetor;
· Os clones do DNA de interesse são isolados.
Enzimas de Restrição
Funcionam como tesouras moleculares.
Cada enzima reconhece um ou mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto delas.
DNA Ligase
Funciona como uma cola.
Detecta locais onde a cadeia de açúcar e fosfato é quebrada e reconstrói a ligação, conectando os grupos de açúcar e fosfato em uma ligação forte.
Vetores
Molécula de DNA em que o fragmento de DNA a ser clonado é ligado ao DNA de uma célula.
Plasmídeos → Costumam ser utilizados como vetores porque constituem moléculas de DNA dupla-fita, de fácil manipulação e de ocorrência natural em procariotos.
PCR E SEQUENCIAMENTO GÊNICO
A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que participa da replicação do material genético nas células.
Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (indicador ou primer) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese.
Os indicadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequência DNA com bilhões de cópias.
O equipamento utilizado é o termociclador. Esse equipamento aumenta e diminui a temperatura de acordo com a programação que foi feita pelo utilizador. 
Na ciclagem, geralmente a PCR consiste em uma série de 20 a 40 ciclos de mudanças na temperatura
Etapas do ciclo:
Desnaturação → a temperatura elevada (geralmente acima de 90ºC) separa a cadeia dupla de DNA, devido ao rompimento das pontes de hidrogênio. As ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose (ligações covalentes e mais fortes) permanecem intactas.
Anelamento/Hibridização → a temperatura normalmente encontra-se entre 50ºC e 65ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. Os iniciadores (primers) ligam-se às extremidades da sequência alvo, marcando onde deverá ocorrer a amplificação do DNA. Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação.
Extensão/Polimerização → após a ligação dos primers (anelamento) às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72ºC e a enzima Taq DNA Polimerase inicia a replicação das novas fitas de DNA. O processo de síntese é iniciado no local onde estão ligados os primers. A Taq Polimerase encorpa os nucleotídeos complementares à sequência alvo utilizando os dnTPs que foram adicionados no preparo da reação.
Eletroforese
Técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga.
qPCR (PCR quantitativo em tempo real)
- A qPCR é o método baseado na PCR convencional (presença de fluoróforos);
- Monitoramento contínuo de um sinal fluorescente ao longo dos ciclos;
- Permite análise de dados durante todo o processo (Real-Time);
- Conversão do sinal fluorescente em valor numérico para cada amostra.
MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO DE DNA
Sequenciamento genômico
Técnica que permite identificar, na ordem correta, a sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA ou RNA, visando conhecer a informação genética contida nesta estrutura.
Sequência nucleotídica → base para o conhecimento de um gene ou genoma -contém as informações sobre as propriedades hereditárias e bioquímicas da vida.
O sequenciamento consiste em identificar a ordem exata dos pares de bases (A,T,G e C) em um segmento de DNA.
Através de uma pequena sequência de DNA, posso identificar a proteína expressa por aquele gene – a estrutura, a função, prever a localização celular.
Sequenciamento químico de Maxam-Gilbert
Método de Degradação Química → consiste em marcar com agentes reativos em uma extremidade, seguido de um processo de purificação.
Consiste na clivagem do DNA alvo marcado, através da utilização de compostos químicos, em posições específicas.
Método de Sanger 
Método Enzimático, Método de Término de Cadeia ou Método Dideóxi → Utilizava marcação radioativa, marcando os fragmentos de DNA sintetizados a partir da fita molde.
Técnica só foi possível graças ao desenvolvimento da técnica de PCR.
Permitiu inicialmente separar de 200 a 300 nucleotídeos por corrida, sendo considerada uma revolução na época em que foi descoberta.
Aprimoramento do método Sanger
Método semiautomatizado → principal modificação foi a adição aos didesoxinucleotídeos, de corantes capazes de emitir fluorescência quando excitados em comprimento de onda específico.
Método aprimorado → utilização de fluoróforos diferentes para cada um dos 4 didesoxinucleotídeos.
Método automatizado
Anos90 → substituição dos géis de difícil manuseio por finíssimos capilares preenchidos com gel onde os fragmentos de DNA são separados em altíssima velocidade;
Sequenciadores → 2x + rápidos do que os semi-automatizados;
As amostras são aplicadas através de um sistema de eletroinjeção diretamente nos capilares, diminuindo consideravelmente o trabalho do analista.
MICROARRANJOS DE DNA
Coleção de sequências de DNA ligadas a uma superfície sólida.
Cada pedaço de DNA representa uma sequência complementar a um gene específico.
Objetivo → estudo comparativo da expressão de certos genes de interesse.
Arranjos de DNA (sondas) → fragmentos gênicos conhecidos que estão imobilizados em uma matriz sólida → as sequências correspondentes aos genes de interesse.
Técnicas de Microarray
Isolamento de RNA → isolamento e a purificação de moléculas de RNA.
Produção e rotulagem de CDNA → RNA é submetido a um processo de transcrição reversa na presença de nucleotídeos marcados → obtenção do cDNA com fluoróforos.
Hibridização → cDNAs são misturados e o microarranjo de DNA é incubado → ocorre a ligação do cDNA de ambas as amostras com a porção de DNA imobilizada na superfície sólida do microarray.
Leitura do sistema → sistema leitor atribui um código de cores à quantidade de fluorescência emitida por cada cDNA.
Aplicações
· Análise de expressão gênica;
· Análise de mutações pontuais;
· Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas;
· Farmacogenômica.
CÉLULAS TRONCO
· Grande capacidade de auto-renovação;
· Capacidade de responder à estímulos externos e ingressar numa via de proliferação diferenciação progressiva, dando origem aos diversos tipos celulares que compõem o indivíduo.
Limitações do uso das CTE
· Necessidade de protocolos bem estabelecidos de diferenciação (evitar diferenciação desorganizada e teratomas);
· Incompatibilidade entre as CTs embrionárias e o paciente -Possível Solução → banco de células tronco embrionárias derivadas de embriões diferentes, aumentando as chances de encontrar um compatível com o paciente;
· Questões éticas/religiosas: a obtenção das CTEs envolve obrigatoriamente a destruição do blastocisto – embrião pré implantado de 5 dias.
Células Tronco Adultas (CTA)
→ Zigoto/Embrião de 3 dias
Células Tronco Totipotentes.
→ Embrião de 4-5dias
Células Tronco Embrionárias Pluripotentes.
→ Embrião de 4-6 semanas/Criança/Adulto/Cordão umbilical
Células Tronco Adultas Multipotentes (podem dar origem a uma variedade de tipos celulares).
Encontram-se principalmente na medula óssea e no sangue do cordão umbilical.
Também podem ser encontradas em alguns tecidos para poder renovar as células ao longo da vida.
Na pele → residem na camada basal epitélio;
No epitélio do trato digestivo → dão origem a muitos tipos celulares: células absortivas, secretoras (de muco), de Paneth (relacionadas à imunidade) e enteroendócrinas;
No cérebro → a indução da diferenciação dessas células em neurônios funcionais ainda não foi estabelecida → acredita-se na possibilidade de pesquisadores descobrirem fatores que induzam à diferenciação e migração de células tronco do SNC para áreas lesadas (roedores);
Novas fontes de CTA → material lipoaspirado e a polpa do dente de leite.
Célula Tronco Pluripotente induzida (iPSC)
Células tronco pluripotentes artificiais derivadas de uma célula somática adulta pela indução de uma manifestação "forçada" de 4 genes.
BIBLIOTECA GENÔMICA
Uma biblioteca de genes é uma coleção de fragmentos de DNA/Cdna de uma determinada espécie de organismo, obtidos a partir da ação de endonucleases de restrição, ligados aos vetores apropriados e clonados após terem sido inseridos num hospedeiro.
Bibliotecas de DNA e cDNA
As bibliotecas genômicas são especialmente úteis na determinação de sequências de nucleotídeos de um genoma inteiro.
Muitas vezes é conveniente dividir o genoma em fragmentos menores e clonar cada fragmento separadamente → trabalhar com segmentos menores de um genoma em vez dos cromossomos inteiros.
Clivagem do DNA genômico em pequenos pedaços utilizando uma enzima nuclease de restrição (ou corte mecânico do DNA). 
Ligação da coleção inteira dos fragmentos de DNA em vetores → um único fragmento de DNA em cada molécula vetorial.
Escolha do vetor de clonagem
De acordo com o tamanho do gene e competência.
Biblioteca de DNA ou genômica
Como os fragmentos de DNA são derivados diretamente do DNA cromossômico do organismo de interesse, a coleção resultante – chamada biblioteca genômica –representará o genoma inteiro daquele organismo, dividida em dezenas de milhares de colônias bacterianas individuais.