Espectrofotometria: Medição de Luz

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Fotometria
Fotometria
Originalmente surgiu como um processo de determinação da intensidade da luz independente do comprimento de onda
NATUREZA DA LUZ
LUZ: É o termo usado para descrever energia radiante com comprimentos de onda visíveis e aqueles não visíveis ao olho humano
COMPRIMENTO DE ONDA DA LUZ: É a distância entre dois picos, pois a luz se propaga na forma de uma onda. Esta distância é medida em nanômetros (nm)
NATUREZA DA LUZ
Bioquímica Clínica
FAIXA VISÍVEL (VIS): 380 (400) - 750 nm (ao olho humano)
FAIXA ULTRAVILOLETA (UV): abaixo de 380 nm (180-400)
FAIXA DO INFRAVERMELHO (IV): acima de 750 nm
Bioquímica Clínica
Fundamental
Soluções ou objetos absorvem em maior intensidade determinadas faixas de  do espectro eletromagnético 
Curva de absorção espectral
Demonstra através de um gráfico em qual comprimento de onda a solução em estudo apresenta absorção máxima
Equipamentos
FOTÔMETROS DE FILTRO (fotocolorímetros) Realizam medidas da intensidade de luz, utilizando filtros que permitem análises numa faixa estreita de comprimento de onda
 
ESPECTROFOTÔMETROS: Realizam medidas da intensidade de luz, utilizando prismas ou grades de difração que permitem análises num determinado comprimento de onda (mais sensíveis)
Quando uma radiação monocromática passa
através de uma solução, uma parte da energia é
absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida
transmitida.
	A espectrofotometria  podem ser  conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).
	A Lei de Lambert-Beer: a absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre  absorbância ou densidade ótica  e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.
Lei de Lambert-Beer
Transmitância (T) - Quando um feixe de luz incide por uma cubeta contendo uma solução de um composto que absorve luz de um certo comprimento de onda (), podemos calcular a transmitância como sendo:
 T = IA / IO
IA- Intensidade do feixe de luz transmitido através da amostra 
Io- Intensidade do feixe de luz incidente 
Parte da luz incidente pode ser refletida pela superfície da cubeta ou absorvida pela sua parede ou pelo solvente. Por isso é necessário preparar uma cubeta chamada de branco da reação 
 
Cubeta do branco: geralmente, não contêm a amostra que será analisada, apenas os solventes. Esta cubeta é inserida e o aparelho ajustado para uma leitura de escala arbitrária de 100 (corresponde 100% de transmitância) e a seguir é lida a transmitância da amostra 
Conc. do teste = Conc. do Padrão x Abs do Teste 
 Abs do Padrão
Ou pelo fator de calibração (F):
	 F = Concentração do Padrão
		 Abs do Padrão
Concentração do teste = F x Abs do Teste 
PRATICANDO
1-Determine o Fator de Proporcionalidade de uma amostra, sabendo:
[padrão] = 12,4 g/dL
abs. padrão = 0,52
2- Sabendo que o Fator de Proporcionalidade de uma amostra é 22,4. Qual o valor da [padrão] se a abs. padrão for de 0,33?
Componentes
Fonte de Luz- Lâmpadas:
visível e infra vermelho - tungstênio é a mais utilizada. Não fornece energia suficiente para medidas abaixo de 320 nm. Também são utilizadas lâmpadas de quarzto-halogênio
ultravioleta- (UV) - hidrogênio, deutério, mercúrio em alta pressão 
Fendas de entrada - Isolam um feixe de luz e melhoram sua pureza cromática
Monocromador- fornece a seleção do espectro de luz a ser usada durante as medidas
	Filtro de vidro
	prisma
	grade de difração
Cubetas
A mais popular das cubetas tem caminho óptico de 1cm
Podem ser: 
Para leituras no visível- vidro de borossilicato ou plástico (marca – lente)
Para leituras no ultravioleta- Cubetas de quartzo (evitar riscos, gorduras)
Detector- Qualquer luz que não seja absorvida é transmitida a um detector que transforma a energia luminosa em elétrica
	
Medidor ou registrador- registra a energia elétrica
Tipos de Espectrofotômetros para a Região Visível e Ultravioleta
Espectrofotômetro mono-feixe :
 
	
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Etapas:
 1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico e mede-se a intensidade da energia radiante, que atinge o detector
 2º) Substitui-se o recipiente com o solvente (branco) pelo recipiente com a amostra e faz- se a determinação propriamente dita da absorbância
 
Espectrofotômetro duplo-feixe	
 Dois feixes de radiação são formados no espaço, por um espelho que divide o feixe vindo do monocromador em dois. Um feixe passa através da solução referencia (branco) até o transdutor e outro, ao mesmo tempo, passa através da amostra até o segundo transdutor.
As duas correntes serão determinadas e mostradas no indicador de sinal. Com o auxílio de um dispositivo apropriado, calcula-se a diferença de transmitância entre os dois feixes, essa diferença será mostrada no indicador de sinal como absorvância
Calibração do espectrofotômetro
1-Colocar um bloco opaco no lugar da cubeta para que nenhuma luz alcance o medidor, cuja saída é ajustada para 0 % de transmitância
2-Inserir a cubeta que contém um branco do reagente sendo o medidor ajustado para 100 % de transmitância
3- Ler o padrão
4- Ler a amostra