Bioquímica clínica - Aparelhos de precisão no laboratório clínico

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Bioquímica clínica - Aparelhos de precisão no laboratório clínico
Introdução
Os profissionais da saúde que trabalham em um ambiente
laboral são totalmente dependentes de equipamentos,
principalmente laboratório farmacêutico. São utilizados
centrífuga, balança, espectrofotometro, pipetas
automáticas, equipamento de banho-Maria e etc. O que
mais se utiliza dentro do laboratório é uma metodologia
chamada de fotometria.
Fotometria: determinação da intensidade da luz
independente do comprimento de onda.
A maioria das determinações efetuadas em análises
clínicas finaliza com a medida da quantidade de luz
absorvida por uma solução. A luz absorvida refere-se à
absorbância e a luz que atravessa refere-se à
transmitância.
Fundamentos da Espectrofotometria
A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos
analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a
energia radiante. Uma boa maneira de “cutucar”
moléculas é com a radiação eletromagnética (luz).
Normalmente a luz incidente tem mais energia do que a
luz emergente, por tem absorção da luz pela substância
analisada. A espectrofotometria utiliza equipamentos
robustos e versáteis que podem ser utilizados para
analisar mais de uma área.
A luz policromática (luz branca) quando incide em um
prisma sofre o processo de difração e dispersão da luz,
decompondo em ordem crescente do comprimento de
onda (violeta - vermelho).
Essas cores são luz visíveis. Tem-se também as luzes
invisíveis: antes da luz violeta tem-se a luz ultravioleta
(UV). E depois da luz vermelha tem a luz infravermelha.
A luz UV tem um comprimento de onda muito pequeno,
porém uma energia muito grande (lesa a córnea). A luz
infravermelha tem um comprimento de onda muito
grande, porém energia baixa (não lesa a córnea).
Newton (1666): as cores não eram qualidades da luz,
todas existem na luz branca (policromática). As cores dos
objetos são resultados da absorção de todas as cores,
exceto a que está enxergando (reflexão). Os raios
luminosos incidem de forma reta.
As regiões da luz de diversos comprimentos de ondas,
interferem com diferentes pontos, sendo mostrado na
imagem abaixo.
Com relação ao espectro de absorção UV-visível, a Luz
UV tem o comprimento de onda até 380nm. Acima de
400 nm começa a enxergar a luz visível. A partir de 780
nm não é possível enxergar a luz.
Obs: a luz alaranjada é utilizada para ver se o
espectrofotômetro está calibrado. A Luz verde é aque se
utiliza mais no laboratório clínico. A luz amarela é
utilizada para visualizar proteínas. A luz vermelha se
utiliza muito pouco. A luz UV é muito utilizada nas
reações para fazer enzimas.
Dois requisitos devem ser observados para que uma
determinada radiação possa ser absorvida por uma
molécula:
● Frequência semelhante: A radiação incidente deve
ser de frequência equivalente aquela rotacional ou
vibracional, eletrônica ou nuclear da molécula;
● A molécula deve ter um dipolo permanente ou um
dipolo induzido, ou seja, deve haver algum
trabalho que a energia absorvida possa fazer.
As cores de radiação da região visível: Cor absorvida x
Cor transmitida:
Na reação da proteína total, a cor final é violeta, a leitura
será em 545 nm (520 a 550).
Toda reação química existe um pico de absorção. Existem
algumas reações químicas que existem mais de um pico
de absorção. Nas reações bioquímicas observa-se apenas
1 pico de absorção (1 leitura). Porém existem picos de
absorção que influenciaram no resultado final, por isso
isso às vezes é realizado duas leituras. Alguns
equipamentos automatizados realizam duas leituras.
As cores primárias (vermelha, verde e violeta/azul)
quando sobrepostas dão sensação de branco.
Leis da Absorção da Luz
Refere-se à passagem da luz em um dado sistema com
uma solução de concentração desconhecida absorvente de
energia, com um comprimento de onda fixo e com uma
determinada intensidade luminosa onde a intensidade do
raio incidente é maior do que o emergente, com duas
variáveis importantes:
● Concentração da solução;
● Espessura da cubeta.
Absorbância: É a energia luminosa que foi absorvida
pela solução.
Transmitância: É a luz emergente, ou seja, a fração da
luz emitida.
A partir dessas duas variáveis é possível medir a
concentração da substância.
Transmitância
Quando um raio de luz monocromática (I0) incide sobre
uma solução colorida, a intensidade de luz emergente (I1)
é menor que a luz incidente, ou seja, parte da luz foi
absorvida.
Obs: Os equipamentos atuais já dão o resultado em
absorbância.
Lei de Bouguer - Lambert
Mediram a relação da diminuição da intensidade da lua e
a espessura do meio absorvente sobre diversos sistemas
ópticos conhecidos.
Lei de Lambert-Beer
Quando a transmitância é mínima, a absorção é máxima.
Quando a absorbância é máxima, a transmitância é
mínima. Afirmam que a concentração de uma substância
é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida
ou inversamente proporcional ao logaritmo da luz
transmitida.
Dessa forma, para calcular a concentração da amostra,
usa-se a seguinte fórmula:
Consequências da lei de Beer - Lambert:
● Absorbância é uma reta;
● Transmitância é uma curva logarítmica;
● Quando a absorbância é zero, a transmitância é
100%;
● Quando a absorbância é máxima, a transmitância
é zero;
● A absorbância é calculada a partir da
transmitância.
Espectrofotometria
Fotocolorimetros: utilizam filtros que conseguem limitar
as faixas de comprimentos de onda ou bandas de
passagem superiores a 20 nm. São considerados aparelhos
inferiores.
Espectrofotômetros: utiliza-se de prisma ou de grades de
difusão que possibilita a passagem de comprimento de
onda inferiores a 20 nm, sendo considerado aparelhos
superiores.
Partes essenciais de um espectrofotômetro
● Fonte de radiação;
● Fenda de entrada;
● Monocromador (resinas): tem a função de isolar o
comprimento de onda desejado, excluir outros
comprimentos de ondas e deixar os raios paralelos
com uso de prismas, filtros e grades de difração.
● Fenda de saída;
● Cubeta;
● Detector;
● Medidor.
Espectrofotômetro de Feixe Simples
Essa classe do instrumento consiste em que toda a
radiação fornecida pela fonte de emissão atravesse a
amostra, ou seja, a intensidade relativa de luz é medida
antes e depois da amostra de teste ser inserida. Em um
espectrofotômetro convencional de feixe único, o branco
(referência) e a amostra são medidos consecutivamente,
com um intervalo de vários segundos para uma medição
de comprimento de onda único e até vários minutos para
uma medição de espectro total com um instrumento
convencional. O desvio de funcionamento da lâmpada
pode resultar em erros significativos durante longos
intervalos de tempo.
Espectrofotômetro de Feixe Duplo
O Espectrofotômetro duplo, ou de feixe duplo, foi
desenvolvido para compensar estas mudanças na
intensidade da lâmpada entre as medições no branco e nas
cubetas de amostra. Nesta configuração, uma fonte de luz
emite um feixe de luz único no qual é dividido por uma
espécie cortador de luz, criando dois feixes de igual
energia com caminhos ópticos iguais. Passando um feixe
através da referência enquanto o outro feixe passa através
da amostra. Comparando com espectrofotômetros de
feixe único, os instrumentos de feixe duplo contêm mais
componentes ópticos, o que reduz a taxa de transferência
e a sensitividade. Para alta sensitividade, medições mais
demoradas são necessárias. Além disso, um design
mecânico mais complexo de um espectrofotômetro pode
resultar em uma piora em sua confiabilidade.
Tipos de fonte de luz
1. Lâmpadas incandescentes: Tugstênio com vapor
de iodo ou bromo (não mede abaixo de 320 nn);
Quartzo-halogênio com invólucro de sílica (2000
a 5000 h).
2. Lâmpadas UV: De H, Deutério, Mercúrio em alta
pressão, xenônio.
3. Lâmpadas de Catódio Oco: As de Zinco
fornecem comprimento de onda de 214 nm
próximo à absorção da ligação peptídica, ideal
para estudar peptídeos e proteínas.
4. Fontes de Laser: fonte de luz com comprimentos
de ondas estreitos.
Fibras óticas
São feixes de fibras de vidro, quartzo ou plástico,
transparentes e finas,encapsulados por material de baixo
índice de refração que transmite a luz por reflexões
internas; oferece a vantagem de melhor direcionamento
do feixe de luz dentro do instrumento, permitindo a
confecção de sistemas ópticos em miniatura utilizado em
aparelhos automáticos.
Cubetas
● Formas: redondas, quadradas e retangulares;
● Material: vidro (borosilicato - faz leitura da luz
visível, preferencialmente), quartzo (comprimento
de onda inferior a 340 nm) ou plástico
(polipropileno-usado para leitura da luz UV);
● Limpeza: para limpeza de substâncias gordurosas:
HCl, H2O e etanol (1:3:4). Molho em detergente,
não usar escova.
Fotometria de Chama
A fotometria de emissão de chama é mais comumente
usada para a medida quantitativa de sódio e potássio, nos
líquidos corporais. O lítio, embora presente no soro em
concentrações muito baixas também podem ser medidos.
Detectam o fóton. Quanto mais energia tiver o fóton,
maior a concentração da amostra.
Princípio: determinados átomos e moléculas por ação de
energia térmica ou elétrica deslocam seus elétrons a uma
camada de maior energia trazendo modificação do estado
energético dos seus átomos (quantum). O processo
inverso dá lugar à emissão de energia luminosa (fóton).
Os espectros lineares são característicos para cada
elemento químico, que é usado para se determinar a
concentração do mesmo nas soluções:
● Lítio - vermelho fraco (671 nm)
● Sódio - laranja (589 nm)
● Potássio - vermelho escuro (789 nm)
● Magnésio - azul
Função do fotômetro de chama:
● atomizar a amostra líquida sobre a chama
(nebulização da amostra);
● separar o espectro de emissão característico;
● detectar e medir quantitativamente (concentração)
da amostra analisada.
Forma de desligar: primeiro o gás, equipamento e a
bomba por último. Para ligar, é o contrário.
Absorção atômica
A espectrofotometria de absorção atômica é o inverso da
fotometria de chama. Na espectrofotometria de absorção
atômica o elemento não é apreciavelmente excitado na
chama, mas é dissociado de suas ligações químicas e
colocado no estado basal (átomo neutro). Isto significa
que o átomo está preparado para absorver radiação em um
comprimento de onda de faixa muito estreita
correspondente - sua própria linha do espectro (depende
do elemento químico em questão).
Se o catódio fosse feito de sódio, seria emitido um
comprimento de onda a 589 nm pela lâmpada. A luz
vinda da lâmpada penetra na chama, parte dela é
absorvida pelos átomos no estado basal na chama,
resultando num balanço de diminuição da intensidade
luminosa vindo da lâmpada. Este método é 100 vezes
mais sensível do que os de emissão de chama.
A espectrofotometria de absorção atômica é um método
sensível, exato, preciso é de alta especificidade. Uma das
razões é que o método não requer a excitação do
elemento, assim é menos afetado pela temperatura e pela
transferência de energia de um átomo para outro e da luz
ser usada em uma faixa extremamente estreita (0,01 nm).
A única desvantagem é o problema de interferência.
Turbidimetria
Princípio: a turvação causa diminuição da intensidade do
raio incidente à medida que ela passa pelas partículas. A
medida do decréscimo da intensidade do feixe de luz
incidente causado pela dispersão, reflexão e absorção é
chamada de turbidimetria. A turvação é medida a 180° da
luz incidente como é realizada a medicação em um
espectrofotômetro, podendo ser realizado nestes
aparelhos.
Nefelometria
Princípio: É definida como a detecção da energia
luminosa dispersa refletida ou absorvida para um detector
que não esteja no caminho direto da luz transmitida. Os
nefelômetros convencionais medem a luz dispersa em um
ângulo reto (90°) ou menor em relação à luz incidente. O
detector do nefelômetro deve estar isento de qualquer
interferência de luz externa, ou seja, deve estar em um
campo escuro, fato de difícil obtenção. não pode ser lida
em espectrofotômetro.
Eletroforese
É a separação de misturas que se baseia na utilização de
um campo elétrico. Os íons deslocam-se em direção ao
pólo de sinal oposto, independente de outros íons
conservando sua estrutura e suas propriedades. Para que
uma partícula se mova em um campo elétrico é necessário
que os componentes da mistura possuam cargas elétricas
positivas ou negativas.
No caso das substâncias angoterar, como no caso das
proteínas que contém muitas amigas (NH2) e presença de
carboxila (COOH), formam cargas dependendo do pH do
meio, em pH ácido formam cargas positivas e migram
para o ânodo. Quando em pH alcalino, formam-se cargas
negativas e migram para o cátodo.
Velocidade de migração depende:
● Carga elétrica global da molécula;
● Tamanho e forma da molécula;
● Intensidade do campo elétrico;
● Propriedades do meio (viscosidade);
● Temperatura de operação.
Biossensores
São aparelhos na qual um componente bioquímico ou
biológico imobilizado interage com o analito, produzindo
através de um transdutor apropriado um sinal
proporcional à quantidade ou atividade do analito.