Relatório Abuta panurensis

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
Instituto de Ciências Exatas - ICE
Departamento de Química - DQ
	
IEQ655 – FITOQUÍMICA EXPERIMENTAL
Manaus, Amazonas
2018
	
	UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
Instituto de Ciências Exatas - ICE
Departamento de Química - DQ
IEQ655 – FITOQUÍMICA EXPERIMENTAL
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA E ESPECTROMÉTRICA DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE ABUTA PANURENSIS 
Prof. Dra. Rita de Cassia Saraiva Nunomura 
Guilherme Braule Pinto Lopes – 21453581
Kleber Augusto Costa Brandão – 21203720
Nathália Lamenha Lopes – 21457037
Samuel Ferreira Guedes – 21457310
Yuri Gabriel Gomes Figueiredo – 21453580
Manaus, Amazonas
2018
RESUMO
O uso de plantas para medicina popular gera um grande crescimento na descoberta de novos fármacos. A utilização popular dessas plantas desperta a curiosidade acerca da composição química e os potenciais bioativos presentes nestas plantas utilizadas popularmente. Plantas do gênero Abuta são comumente encontradas em regiões subtropicais, são quimicamente conhecidas por serem ricas em alcaloides com grande potencial para produtos bioativos, como a Abuta panurensis que apresentam alcaloides do tipo benzilizoquinolinico. As partes das plantas podem ser úteis para diferentes finalidades. Tendo em vista o grande potencial deste gênero e espécie relatados, este experimento tem como objetivo sugerir a composição química estudada a partir do perfil cromatográfico e espectrométrico da espécie Abuta panurensis, de seus extratos obtidos por diferentes metodologias e frações de diferentes polaridades obtidas por partição líquido-líquido e alcaloídica. Com este objetivo, os extratos foram obtidos variando a metodologia de extração entre ultrassom e soxhlet tendo seus resultados comparados, comprovando melhor rendimento para soxhlet. Os extratos obtidos foram particionados com hexano, clorofórmio e acetato, apresentando melhores rendimentos para as frações em clorofórmio. Os extratos e frações foram analisados por cromatografia em camada delgada e apresentaram bom perfil de separação, mostrando resultado positivo para alcaloides e flavonoides nas frações de média e média/alta polaridade (clorofórmio e acetato). A partir do material vegetal de folhas e galhos foi realizada uma marcha alcaloídica que também foi analisada cromatograficamente. Seguinte a isso, todas as frações foram analisadas por espectrometria de massas e pôde-se sugerir a presença da palmatina e dicentrina como dois dos picos majoritários presentes nas amostras. 
Palavras-chave: Abuta panurensis, alcaloides, palmatina, cromatografia.
SUMÁRIO
RESUMO	3
SUMÁRIO	4
INTRODUÇÃO	5
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA	6
•	ABUTA PANURENSIS	6
•	COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS ESPÉCIES	6
•	MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS	7
•	EXTRAÇÃO POR ULTRASSOM	7
•	EXTRAÇÃO COM SOXHLET	9
•	EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO	10
	MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS E ESPECTROMÉTRICOS	11
•	CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA	11
•	ESPECTROMETRIA DE MASSAS	12
OBJETIVO	14
MATERIAIS E MÉTODOS	15
MATERIAIS E REAGENTES	15
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL	16
	MATERIAL VEGETAL	16
	OBTENÇÃO DOS EXTRATOS	16
	OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES DE DIFERENTES POLARIDADES	17
	OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES ALCALOÍDICAS	17
	ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)	17
	ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM)	17
RESULTADOS E DISCUSSÃO	19
•	OBTENÇÃO DOS EXTRATOS E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA	19
•	OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES DE PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA	22
•	OBTENÇÃO DA FRAÇÃO ALCALOÍDICA POR MARCHA ALCALOIDICA E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA	26
•	ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DAS FRAÇÕES	28
CONCLUSÃO	31
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	32
INTRODUÇÃO
A demanda cada vez maior do desenvolvimento e descoberta de novo fármacos sempre foi auxiliada pela medicina popular. Fundamentada, principalmente, no uso de plantas medicinais para cura de enfermidades, alívio de dores, melhora no funcionamento de diversas funções do organismo e entre outros. Essas plantas são de extrema relevância para comunidades mais afastadas dos grandes centros e de baixa renda, principalmente.1
A utilização popular dessas plantas, desperta cada vez mais a curiosidade de se conhecer a composição química e os potencias bioativos presentes nelas.2 Confirmando benefício e viabilidade de utilização desses fitoterápicos, podem promover o maior acesso da população carente a medicamentos seguros, de baixo custo, alta disponibilidade, baixa toxicidade, e efeitos colaterais reduzidos.1,3 
As plantas do gênero botânico Abuta, que são pertencentes a família Menispermadeae, ocorrem em grande parte das florestas tropicas, sendo encontrado em países como México, Bolívia, Guiana, Suriname e, claro, Brasil. Mesmo sendo um gênero bastante amplo e complexo é bem pouco estudado no Brasil.3
Grande parte das espécies desse gênero são conhecidas por serem ricas em alcaloides com grande potencial para produtos bioativos, como a Abuta panurensis que apresenta alcaloides do tipo benzilizoquinolinico.4 Suas folhas e galhos e raízes tambem podem ter utilidade para diferentes tipos de enfermidades, como cólicas, tuberculose e malária. Da mesma forma para a preparação do curare, útil para pesca e caça, onde é utilizado nas pontas de flechas e lanças.5
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
ABUTA PANURENSIS
A Abuta panurensis é uma espécie do gênero Abuta, pertencente à família Menispermaceae, presente com grande expressividade na região amazônica. A família Menispermaceae, descrita por Antoine Laurent de Jussieu, abrange cerca de 72 gêneros e aproximadamente 520 espécies, com distribuição essencialmente pantropical.6,7
Filogeneticamente, pertence à ordem Rhanunculales, cujas espécies se distribuem predominantemente nas regiões tropicais e subtropicais8. O gênero Abuta foi descrito por Jean Baptiste Christophore Fuseé Aublet e apresenta cerca de 35 espécies tropicais9. Ocorre desde o sul do México até a Bolívia, passando pelo Brasil e tendo maior diversidade na Amazônia, Guiana, Guiana Francesa e Suriname10.
É o gênero mais amplo da família Menispermaceae e muitas de suas espécies possuem grande valor medicinal. Várias espécies são utilizadas no preparo de medicamentos tradicionais como anticoncepcionais, antiinflamatórios e cicatrizantes, além de serem utilizados no combate a cólicas, tuberculose, malária e outras doenças. 11,12 Algumas espécies, tais como a A. rufescens e A. imene são consideradas tóxicas e utilizadas como veneno, chamado de curare, que é aplicado nas pontas das flechas de caça.13
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS ESPÉCIES 
O gênero Abuta, bem como a família Menispermaceae, é rico em alcaloides. Os tipos alcaloídicos presentes em Menispermaceae são todos derivados da fenilalanina ou tirosina e são de natureza muito diversa, indo desde os mais simples benziltetrahidroisoquinolínicos, até os mais complexos alcaloides do tipo acutumínico.8 De A. sabdwithiana foram isolados, além dos alcaloides palmitina e xylopina14, o sitosterol e ésteres alifáticos15. De A. pahni, foram isolados e caracterizados o 2-N-metil-lindoldamina, 2-N-nordalrisolina e o 2’-N-metil-lindoldamina, além de outros alcaloides como coclaurina, daurisolina, lindoldamina, di-metil-lindoldamina, esteparina e talifolina.16
De A. grisebachii, já foram identificados os alcaloides grisabina, grisabutina, peinamina, 7-O-di-metil-peinamina, N-metil-7-O-di-metil-peinamina, macolidina e macolina17, 18. A esplendina foi isolada de A. rufescens19. Os esteróides abutasterona, os triterpenóides taraxerol e taraxerona, além dos alcaloides imerubina e imelutina foram extraídos de A. velutina. 20 De A. panurensis, foi identificada a presença dos alcalóides panurensina e norpanurensina.21 Algumas estruturas químicas de alguns tipos de alcalóides presentes em espécies do gênero Abuta são mostrados a seguir.
 			
 Figura 1: Tipo Azafluorantênico.	 Figura 2: Tipo Benziltetrahidroisoquinolina
			 
 Figura 3: Tipo OxoaprofínicoFigura 4: Tipo Tropolonaisoquinolínico
MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS
Os diferentes compostos presentes na matéria orgânica podem ser extraídos ou separados utilizando diferentes técnicas, de acordo com a necessidade e viabilidade. Estas técnicas são uma forte ferramenta no auxílio do isolamento e caracterização destes compostos.
EXTRAÇÃO POR ULTRASSOM
A extração por ultrassom é uma técnica que utiliza a energia de ondas sonoras e que cria uma vibração no fluido, causando uma variação de pressão neste e gerando cavitação. A cavitação ocorre quando, sob o efeito das ondas ultrassônicas, houver uma diminuição de pressão suficiente para que a distância entre as moléculas ultrapasse a distância molecular crítica que mantém a matéria intacta.22 As oscilações sofridas pelas moléculas com a passagem do som através do meio, juntamente com os processos de cavitação gerados e o aumento de temperatura, contribuem para a degradação de estruturas e compostos, permitindo sua extração.
O uso do ultrassom é subdividido em dois principais tipos: alta potência e baixa potência, onde o ultrassom de alta potência é caracterizado pela utilização de ondas de alta frequência, na faixa de 20 KHz à 100 KHz, enquanto que o de baixa potência utiliza ondas tipicamente na faixa de 1 MHz à 10MHz.23 Algumas aplicações de ondas ultrassônicas de alta potência em diferentes áreas da ciência podem ser vistas na tabela a seguir.24
Tabela 1: Aplicações de ondas ultrassônicas de alta potência.
	Área
	Aplicações
	Biologia
	Rompimento de células, esterilização.
	Engenharia
	Limpeza de metal, soldagem, refinamento de metal em pedaços, perfuração.
	Geologia
	Localização de minerais e depósitos de óleo, estabelecimento de profundidade.
	Química
	Extração em plantas, homogeneização.
	Industrial
	Filtração, cristalização, dispersão de sólidos, crescimento de cristais, desgaseificação, emulsificação.
	Medicina
	Esterilização, fisioterapia, inalações.
	Física
	Cavitação, fenômeno de ondas acústicas, velocidade do som.
	Polímeros
	Polimerização, despolimerização, degradação de peso molecular.
Em um banho ultrassônico, frequentemente utilizado em laboratórios, o transdutor – dispositivo que gera a vibração – é preso ao fundo da cuba do aparelho e a energia vibracional das ondas ultrassônicas é transmitida através de um líquido – geralmente água – ao frasco reacional.23 O ultrassom pode ser utilizado como técnica de extração alternativa ao Soxhlet, na extração de compostos orgânicos, apresentando eficiência de extração igual ou superior.25 A extração utilizando o ultrassom ainda apresenta como vantagens de utilização o baixo custo, a rapidez no processo de extração, bem como a alta reprodutibilidade.
EXTRAÇÃO COM SOXHLET
O método de extração com Soxhlet é um dos mais antigos e utilizados em laboratórios, sendo criado em 1879 por Franz Von Soxhlet. O processo consiste na transferência do analito de um sistema sólido para uma fase líquida, através do tratamento sucessivo e intermitente de uma amostra imersa em um solvente puro, geralmente éter de petróleo, éter dietílico ou n-hexano, e subsequente condensação do solvente aquecido dentro do balão que é aquecido, na base do aparelho.26 Um esquema do sistema pode ser visto abaixo.
Figura 5: Esquema de um sistema de extração utilizando Soxhlet.
Um solvente puro é aquecido no balão até sua ebulição. O vapor resultante é conduzido por um tubo lateral até o condensador, onde é condensado e goteja no extrator.
No extrator, o solvente condensado se acumula e termina por cobrir o cartucho contendo a amostra sólida. Ao atingir o nível do sifão, o excedente é evacuado até o balão, carregando as substâncias solúveis. Ao retornar ao balão, o solvente sofre aquecimento novamente, repetindo o ciclo.
Uma das vantagems do Soxhlet é sua grande eficiência na extração de compostos orgânicos. Entretanto, oferece como desvantagens um alto fator de degradação de alguns compostos, inviabilizando seu uso27, além de uma grande quantidade de solvente e um longo período de tempo necessários para a extração.28
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
A extração líquido-líquido, também chamada de partição, é uma das técnicas mais tradicionais de separação, que consiste em extrair componentes específicos de uma mistura em diferentes fases imiscíveis – tradicionalmente, um solvente orgânico e água, de acordo com sua solubilidade. A eficiência da partição depende da afinidade do soluto com o solvente de extração e da quantidade de extrações realizadas.29 Em sua configuração mais simples, a extração líquido-líquido pode ser realizada com o auxílio de um funil de separação ou tubos de centrífuga.
A partição de um soluto entre duas fases líquidas imiscíveis é um fenômeno de equilíbrio governado pela lei de distribuição. Se o soluto da espécie A distribui-se entre a água e uma fase orgânica, o equilíbrio resultante pode ser escrito como mostrado abaixo, onde as letras entre parênteses referem-se às fases aquosa e orgânica.30
A(aq) ↔ A(org)
Idealmente, a razão das atividades para A nas duas fases será uma constante e independente da quantidade de A. Assim, dada uma temperatura, temos a equação 1, mostrada a seguir, onde (aA)org e (aA)aq são as atividades de A em cada fase e os termos entre colchetes são as concentrações em mol/L de A.30
		(Eq. 1)
A constante de equilíbrio K é conhecida como constante de distribuição e nos permite calcular a concentração do analito que permanece em solução após um número i de extrações. A constante também fornece orientação sobre a forma mais eficiente de se realizar uma partição. Dessa forma, a concentração de A que permanece na fase aquosa após i extrações com um solvente orgânico ([A]i) pode ser calculada pela equação 2, vista a seguir, onde [A]i é a concentração de A que permanece na solução aquosa após Vaq mL da solução de concentração original [A]0 com i porções do solvente orgânico, cada um com volume de Vorg.30
	(Eq. 2)
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS E ESPECTROMÉTRICOS
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) é uma técnica que se baseia na separação dos componentes de uma mistura por meio da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. O processo de separação ocorre, principalmente, por meio da adsorção, entretanto, podem ocorrer, também, por partição ou troca iônica, ao se utilizar fases estacionárias tratadas, o que permite a separação tanto de substâncias hidrofóbicas quanto hidrofílicas.31
Os adsorventes mais utilizados na CCD são a sílica, alumina, celulose e a poliamida. De modo geral, os adsorventes utilizados na cromatografia em coluna podem, também, serem utilizados na CCD. Adsorventes com aplicações mais restritas também são utilizados, como a uréia e o polietileno na separação de ácidos graxos; silicatos de cálcio ou de magnésio na separação de açúcares; gel de dextrana na separação de aminoácidos e proteínas, além de carvão ativado para a separação de fenóis, além de vários outros adsorventes com a incorporação de reagentes diversos, de acordo com a necessidade.31 As placas cromatográficas podem ser preparadas manualmente, com o auxílio de placas de vidro ou adquiridas comercialmente – estas, geralmente confeccionadas por uma camada de adsorvente depositada sobre uma lâmina de material plástico ou alumínio. A fase móvel pode ser composta por um solvente específico ou por uma mistura, de acordo com a necessidade. A figura 6, a seguir, mostra o esquema de uma placa cromatográfica com a aplicação da amostra, bem como a equação utilizada para o cálculo do fator de retenção (Rf), que é a razão entre a distância percorrida pela substância (ds) e a distância percorrida pela fase móvel (dm).
Figura 6. Esquema de placa cromatográfica e equação de fator de retenção.
Após o desenvolvimento do cromatograma, as placas passam por um processo de revelação, no qual tornam-se visíveis as substâncias incolores presentes na amostra. O processopode ser de natureza química, com o uso de diversas substâncias químicas, de acordo com a necessidade; de natureza física, com o uso de lâmpadas ultravioletas ou aquecimento, bem como natureza biológica, fazendo uso de reações enzimáticas ou bacterianas. 31
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A espectrometria de massas é uma técnica analítica que consiste na conversão do analito em íons em fase gasosa, que são subsequentemente separados em função de sua razão massa/carga, m/z. Os íons de massas atômicas diferentes são separados por um dispositivo chamado analisador de massas para produzir um espectro de massas. Este é um gráfico do número de íons produzidos versus a razão massa/carga ou, para os íons monocarregados, versus a massa.32
Os analisadores de massas podem separar os íons pelo uso de campos magnéticos ou elétricos. É possível, ainda, com um analisador de massas por tempo de voo, medir o tempo que os íons de diferentes massas levam para migrar distâncias conhecidas. 33
Quaisquer matérias que possam ser ionizados e cujos íons possam ser transferidos à fase gasosa podem ser analisados por espectrometria de massas. A ionização da amostra é feita, geralmente, de duas maneiras, podendo ser por eletrospray (electrospray ionization, ESI), onde são criadas gotículas de uma solução contendo o analito através de um processo de nebulização; ou por ionização/desorção a laser assistida por matriz (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI), onde são produzidos íons protonados em fase gasosa pela excitação do analito, que recebe energia oriunda da absorção da energia do laser pelo componente presente em uma matriz, que é misturada junto à amostra e é composta por um composto orgânico capaz de absorver energia na região do comprimento de onda do laser.33 Os íons podem ser produzidos a partir de uma molécula ou átomo neutro pela remoção ou adição de um elétron ou próton. As análises de espectrometria de massas podem ser feitas no modo de análise de íons positivos ou negativos, de acordo com a necessidade. Um esquema de um espectrômetro de massas é visto abaixo.
Figura 7: Esquema de um espectrômetro de massas.
A amostra, ao ser injetada no equipamento, é aquecida e vaporizada (1). Em seguida, o vapor resultante é ionizado (2) e segue através de um campo elétrico para ser acelerada (3). Ao chegar no analisador de massas, um campo magnético separa as partículas de acordo com sua razão massa/carga (4). Íons com razões massa/carga menores são mais defletidas (5), enquanto que íons com razões carga/massa maiores são mais defletidas (6). Os íons atingem, então o detector, onde é gerado um espectro de massas.
OBJETIVO
Esta prática teve como objetivo descrever a composição química, o perfil cromatográfico e espectrométrico da espécie Abuta panurensis através de extratos obtidos por diferentes metodologias e frações de diferentes polaridades obtidas por partição líquido-líquido e alcaloídica. 
 
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E REAGENTES
Material vegetal folhas e galhos;
Erlenmeyers; 
Manta aquecedora; 
Balão de fundo redondo; 
Extrator de Soxhlet. 
Balança analítica; 
Espátulas; 
Ultrassom;
Água destilada; 
Pedras de cerâmica; 
Papel alumínio; 
Frascos pequenos de vidro; 
Etiquetas;
Pipeta de Pasteur;
Placa cromatográfica; 
Aplicador de amostra; 
Béqueres; 
Vidro de relógio; 
Diclorometano;
Hexano;
Acetato de Etila; 
Clorofórmio;
Metanol;
Solução de Hidróxido de Amônio 10%; 
Soluçao de Ácido Acético 10%;
Vials; 
Vanilina sulfúrica;
Dragendorff;
NPPEG;
Cloreto Férrico; 
Espectrômetro de massas.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Figura 8 – Fluxograma da metodologia utilizada no experimento.
MATERIAL VEGETAL 
As folhas e galhos da A. panurensis foram cedidas por uma aluna de doutourado da professora Dra. Rita Nunomura para realização dos experimentos. 
OBTENÇÃO DOS EXTRATOS
ULTRASSOM – SONICAÇÃO
As folhas foram submetidas a três extrações sucessivas, sendo feito o uso do ultrassom por 20 minutos, em Metanol previamente destilado. Então, os extratos obtidos foram concentradas em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, até eliminação do solvente.
SOXHLET
As folhas foram submetidas a três extrações sucessivas, sendo feito o uso do aparelho de soxhlet por 6 horas cada extração, em metanol previamente destilado. Então, os extratos obtidos foram concentradas em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, até eliminação do solvente.
OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES DE DIFERENTES POLARIDADES
Foram realizadas partições líquido-líquido para obtenção de frações de diferentes polaridades. A massa do extrato metanólico foi toda a obtida, tendo sido solubilizado em MeOH/H2O (9:1 para cada 1 grama do extrato). O extrato foi, então, particionado sequencialmente por 3 lavagens com cada solvente – 50 mL de hexano (HEX), clorofórmio (CHCl3) e acetato de etila (AcOEt), sendo retirada a parte metanólica ao finalizar. As frações obtidas foram concentradas em evaporador rotatório.
OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES ALCALOÍDICAS
Para obtenção das frações alcaloídicas foi utilizada a metodologia da marcha alcaloídica. Onde a partir de 2 gramas de material vegetal de folhas e galhos (separadamente) adicionou-se uma solução de 10 mL de hidróxido de amônio 10% e 10 mL de diclorometano. Agitou-se em Vortex, após um minuto a fase superior foi transferida para um funil de partição, onde foi adicionado 10 mL de ácido acético 10%, onde agitou-se e obteve-se a formação de duas fases. A fase inferior foi retirada e na fase superior tratou-se com gotas de NH4OH concentrado até ter atingido pH 10, em seguida adicionou-se 10 mL de diclorometano, onde após agitação a fase superior (aquosa básica) foi descartada e a fração inferior (alcaloídica) foi mantida para posteriores análises.
ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Os extratos e frações das partições foram analisadas em placas de CCD com sílica normal, a foto documentação foi realizada em celulares smartphones. O volume de aplicação foi definido na hora da análise e o sistema de eluição determinado foram proporções variadas entre os gradientes de Hexano/Acetato de Etila e Clorofórmio/Metanol para os extratos e frações, e Diclorometano/Metanol para as frações alcaloídicas. As placas foram reveladas nos reveladores vanilina sulfúrica, dragendorff, cloreto férrico, NPPEG, luz ultravioleta 254 e 366 nm.
ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM)
As análises dos extratos e frações foram realizadas no Laboratório de Espectrometria de Massas na central analítica da UFAM. Foi utilizado um espectrômetro de massas LQC Fleet (Thermo Scientific®), usando fonte de ionização eletrospray (ESI). A faixa de detecção foi de 100-1000 Da. As amostras foram preparadas na concentração de 1 mg/mL em metanol e 20µL foram retirados e diluídos em 980 µL de metanol. Os dados obtidos das injeções foram processados através de um programa chamado Xcalibur 2.0.7.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
OBTENÇÃO DOS EXTRATOS E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
A obtenção dos extratos foram realizadas de duas maneiras distintas para comparação de resultados obtidos, e determinação do melhor método de extração baseado no rendimento, os métodos foram por soxhlet e ultrassom – sonicação. Ao extrair por soxhlet a amostra fica em contato direto por um longo período de tempo de extração e utiliza uma quantidade grande de solvente, além de sofrer o risco de degradação de alguns compostos. Na extração por ultrassom a amostra utiliza as ondas sonoras produzidas pelo aparelho para extração, as amostras são extraídas mais rapidamente, o custo é baixo e possui alta reprodutibilidade. Observa-se primeiramente a partir do tempo de extração realizado: para o ultrassom 3 vezes de 20 minutos, enquanto que no soxhlet foram realizadas 3 extrações de 6 horas. 
A partir de 40 gramas de material vegetal, pelo método de extração por soxhlet obteve-se 1,2889 gramas de extrato. O cálculo para obtenção do rendimento do extratopode ser observado abaixo. Onde 40 gramas é a massa de material vegetal utilizado na extração, assim como 1,2889 g a quantidade de extrato obtida. 
40 g ––––––– 100 %
 1,2889 g ––––––– r
Rendimento (r) = 3,22% 
Agora, pelo método de extração por ultrassom a partir de 40 gramas de material vegetal obteve-se 0,6365 gramas de extrato. O cálculo para obtenção do rendimento do extrato pode ser observado abaixo. Onde 40 gramas é a massa de material vegetal utilizado na extração, assim como 0,6365 g a quantidade de extrato obtida. 
40 g ––––––– 100 %
 0,6365 g ––––––– r
Rendimento (r) = 1,59% 
Dessa forma, pode-se concluir que, apesar do método de ultrassom ser um método mais rápido, proporciona menos quantidade de massa obtida ao final do procedimento. Logo, o melhor método de extração obtido a partir da maior massa obtida foi o de soxhlet, que apresentou um pouco mais de 2 vezes a quantidade obtida de extrato por ultrassom.
Posterior as extrações, os extratos foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD), onde foram testados dois sistemas de eluentes: CHCl3:MeOH 8:2 (eluente 1) e HEX:AcOEt 8:2 (eluente 2) para análise da melhor separação possível das substâncias. O eluente 1 possui uma polaridade maior que a do eluente 2, sendo bom para visualizar separação de substâncias tanto polares quanto apolares. 
Figura 9: CCDs dos extratos solubilizados em acetato em diferentes eluentes – a esquerda clorofórmio/metanol, a direita hexano/acetato de etila.
Primeiramente foram analisados os extratos ao solubiliza-los em acetato de etila, porém as amostras não foram totalmente solubilizadas, dessa forma não pode-se afirmar que todas as substâncias estariam presentes na placa. As CCDs obtidas ao serem solubilizadas em acetato podem ser observadas na figura acima (figura 9). Observa-se que apenas na luz ultravioleta 366 nm foi possível observar a presença de substâncias, mudando seus fatores de retenção (RF) devido a diferença de polaridade nos eluentes utilizados. No eluente 1 nota-se a presença de uma substância amarela não aparente no eluente 2. No relevador NPPEG não houve grandes mudanças aparente, mostrando resultado negativo para flavonoides. Porém esperava-se resultado positivo no revelador dragendorff para os dois eluentes, tendo dado negativo para alcaloides. Esse resultado negativo pode estar relacionado com a concentração da amostra aplicada na placa e ao fato da amostra não ter solubilizado totalmente. 
Figura 10: CCDs dos extratos solubilizados em metanol em diferentes eluentes – a esquerda clorofórmio/metanol, a direita hexano/acetato de etila.
	Posterior a análise por CCD solubilizando em acetato de etila, as amostras foram solubilizadas em metanol e analisadas novamente com os mesmos eluentes e reveladores. O resultado obtido pode ser observado na figura acima (figura 10). Nota-se ao olhar para as placas reveladas na luz ultravioleta 254 nm que a coloração da placa é branca, indicando que as placas que estão sendo analisadas são placas de fase reversa, e não normal. Dessa forma, em placas de fase reversa a premícia é ao contrário da fase normal: na fase normal a sílica é polar e substâncias polares interagem mais com a placa, ficando retidas na base de aplicação quando utiliza-se solventes mais apolares. Já na fase reversa a fase estacionária (sílica) tem característica apolar, retendo na base substâncias mais apolares, quando utiliza-se solventes mais polares. 
	Dessa forma a comparação entre as placas obtidas a partir dos dois solventes utilizados para solubilizar as amostras não é tão eficaz por possuírem fases estacionárias diferentes. Porém, olhando apenas para a figura 10 observa-se que também não houve revelação positiva para alcaloides no revelador dragendorff, podendo também ser devido a concentração da amostra aplicada na placa. 
OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES DE PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
A partir dos extratos obtidos anteriormente (1,2889 g por soxhlet e 0,6365 g por ultrassom) foram realizadas partições líquido-líquido para obtenção de frações de diferente polaridades. As partições foram realizadas com todo o extrato obtido, sendo obtidas frações em hexano, clorofórmio, acetato e metanólica. É possível observar os rendimentos obtidos para a partição do extrato de soxhlet na tabela abaixo (tabela 2). 
Tabela 2: Rendimentos obtidos das partições líquido-líquido.
	
	F. HEX
	F. CHCl3
	F. AcOEt
	Soxhlet
	11,48 %
	28 %
	12,33 %
	Ultrassom
	10,05 %
	28,43 %
	4,24 %
	Nota-se que na tabela 2 não há os dados de rendimento obtidos das frações hidroalcóolicas. Isto se deve ao fato que as amostras metanólicas fungaram enquanto secavam, não sendo possível dar continuidade ao estudo com essas frações. Dessa forma foram pesadas e calculadas os rendimentos para as outras três frações. Observa-se que para cada método houve perda de material, não tendo sido obtido os 100% de massa ao somar os rendimentos obtidos. O método de soxhlet recuperou 51,81% da amostra, enquanto que por ultrassom recuperou 4,72% do material. 
Verifica-se que a fração clorofórmica apresentou maior rendimento para os dois métodos de extração. Seguinte a essas frações, por soxhlet a fração em acetato ainda foi um pouco maior que a fração em hexano, enquanto que por ultrassom a fração em hexano apresentou rendimento muito maior que a fração em acetato.
Após a obtenção das frações, as amostras foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando as mesmas proporções e gradientes de eluentes já utilizados anteriormente. Primeiramente as frações obtidas a partir do extrato de soxhlet e eluidas em hexano/acetato de etila podem ser observadas abaixo (figura 11).
Figura 11: CCDs das frações obtidas a partir do extrato por soxhlet eluídas em hexano/acetato de etila revelados em diferentes reveladores.
Nota-se que houve uma boa separação das substâncias na fração em hexano e clorofórmio, e o eluente proporcionou uma boa visualização das substâncias. Ao ser revelada em dragendorff apontou presença de alcaloides retidos na base do extrato, da fração em clorofórmio e acetato. Em cloreto férrico aparenta a presença de fenólicos, e em NPPEG não houve mudanças relevantes, sendo negativa a presença de flavonoides. 
Já na figura abaixo (figura 12) as placas foram eluídas em clorofórmio/metanol. É possível examinar que as substâncias eluíram bem mais na placa, por serem mais polares e entrarem em contato com uma fase móvel mais polar. A eluição pode ser considerada forte, e as substâncias “subiram” demais, mas nota-se a presença de substâncias que não puderam ser notadas ao ser eluído com hexano/acetato de etila. As placas utilizadas para análise foram placas de fase reversa, tornando inviável a comparação entre os eluentes devido a polaridade da fase estacionária das placas. Porém vê-se que no extrato e nas cfrações em clorofórmio, acetato e metanólica a presença de uma substância amarelada (luz ultravioleta 254 e 366 nm). 
Ao ser revelada em dragendorff, a fração clorofórmica apresentou resultado positivo para a presença de alcaloides, assim como possível resultado positivo para fenólicos ao ser revelado em cloreto férrico. Em NPPEG ressaltaram-se um pouco as colorações das substâncias, porém talvez não o suficiente para considerar a presença de flavonoides nas frações.
Figura 12: CCDs das frações obtidas a partir do extrato por soxhlet eluídas em clorofórmio/metanol revelados em diferentes reveladores.
Após análise das frações obtidas a partir do extrato por soxhlet, as frações obtidas do extrato por ultrassom foram analisadas (figura 13). Na figura abaixo as frações foram analisadas pelo primeiro eluente menos polar, uma proporção de hexano/acetato de etila. Observa-se boa separação de substâncias presentes na fração em hexano, a presença de uma substância amarelada retida na base da fração em clorofórmio, e um resultado positivo para alcaloides na fração emclorofórmio. 
Comparando com as placas obtidas pelo extrato por soxhlet no mesmo eluente (figura 11) nota-se um perfil bastante semelhante, mostrando que há a similaridade na composição química das frações, apesar da variação do método de extração.
Figura 13: CCDs das frações obtidas a partir do extrato por ultrassom eluídas em hexano/acetato de etila revelados em diferentes reveladores.
Seguinte a análise com um eluente mais apolar, realizou-se a eluição com o eluente clorofórmio/metanol (mais polar). É possível reparar as placas obtidas na figura abaixo (figura 14). As frações analisadas apresentaram uma boa separação, e assim como na figura 12, houve uma eluição maior das substâncias ao interagirem com um solvente mais polar, e também como na figura 12, as placas utilizadas para aplicação das amostras possuem a fase estacionária reversa, com caráter apolar, fazendo com que as substâncias “corram” mais.
 Esperava-se que na placa revelada em dragendorff houvesse apresentado resultado positivo para alcaloides assim como na figura 12, porém não há presença de alcaloides, o que pode ser devido a concentração da amostra aplicada, porque sabe-se que há sim a presença de alcaloides nessa fração. A revelação em NPPEG apresentou leve intensidade nas substâncias, assim como na análise das frações por soxhlet. 
Figura 14: CCDs das frações obtidas a partir do extrato por ultrassom eluídas em clorofórmio/metanol revelados em diferentes reveladores.
OBTENÇÃO DA FRAÇÃO ALCALOÍDICA POR MARCHA ALCALOIDICA E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
A partir de 2 gramas de material vegetal da A. panurensis de folhas e galhos foram realizadas marchas alcaloídicas para obtenção das frações alcaloídicas. As partições alcaloídicas foram realizadas seguindo a metodologia descrita no tópico do procedimento experimental, primeiramente basificando a amostra para solubilizar substâncias como por exemplo alcaloidicas para a fase de interesse, seguinte a acidificação para retirar de ácidos não interessantes para o estudo e retirada de impurezas. O cálculo do rendimento da marcha para as folhas pode ser observado abaixo. Onde 2 gramas é a massa de material vegetal utilzado na metodologia, assim como 491 miligramas é a quantidade de fração obtida. 
2 g ––––––– 100 %
 0,4910 g ––––––– r
Rendimento (r) = 24,55% 
Já para os galhos, verifica-se o cálculo do rendimento da marcha abaixo. Onde 2 gramas é a massa de material vegetal utilzado na metodologia, assim como 34 miligramas é a quantidade de fração obtida. 
2 g ––––––– 100 %
 0,0340 g ––––––– r
Rendimento (r) = 1,7 %
Nota-se que a fração alcaloídica das folhas apresentou maior e melhor rendimento quando comparado ao rendimento da fração dos galhos. Isso pode ter ocorrido devido a perda de material na hora do procedimento experimental, assim como outros fatores. A massa das folhas é mais de 10 vezes maior do que a massa dos galhos.
Após obtenção das frações foi feita a análise cromatográfica utilizando um outro sistema de eluentes divergente dos utilizados para análise dos extratos e frações (diclorometano/metanol) e pode-se constatar o resultado na figura abaixo (figura 15). Percebe-se que a substância vermelha que foi observada em frações em hexano das partições tanto por soxhlet quando por ultrassom está presente na fração alcaloidica das folhas, assim como há a presença de mais substâncias, e a substância amarela presente nas frações em clorofórmio observadas nas frações das partições por soxhlet e por ultrassom está presente na fração alcaloidica dos galhos. Em dragendorff não houve resultado positivo para alcaloides porém esperava-se que o resultado desse positivo. O motivo do resultado negativo, assim como das outras análises, pode ser relacionado a concentração das amostras aplicadas na placa.
Figura 15: CCDs das frações alcaloídicas obtidas a partir do material vegetal das folhas e galhos da A. panurensis eluídas em diclorometano/metanol revelados em diferentes reveladores.
ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DAS FRAÇÕES 
Seguinte à análise do perfil cromatográfico das amostras obtidas por cromatografia em camada delgada (CCD), as frações foram analisadas por espectrometria de massas (EM) utilizando como fonte eletrospray no modo positivo e negativo. Os espectros obtidos podem ser observados nas figuras abaixo.
Figura 16: Espectros de massas das frações em clorofórmio das partições obtidas dos extratos por soxhlet e ultrassom.
Na figura 16 observa-se os espectros obtidos das frações de média polaridade obtidas por métodos de extração diferentes. No espectro da fração por soxhlet verifica-se que o íon de maior abundância obtida foi o íon m/z 352, seguido do íon de m/z 368 e íons m/z 340, 420 e 324. Já no espectro da fração por ultrassom o pico do íon de maior abundância também foi o íon m/z 352 seguido do 368, assim como os íons m/z 340, 420 e 324. Dessa forma pode-se concluir que para as duas frações em clorofórmio, não importando a variação do método, apresentam íons de m/z extremamente semelhantes. 
Figura 17: Espectros de massas das frações em acetato de etila das partições obtidas dos extratos por soxhlet e ultrassom.
Já para a figura 17 verifica-se os espectros de massas obtidos das frações em acetato de etila das partições realizadas dos dois extratos. O espectro da fração obtida por soxhlet apresenta como íon majoritário m/z 274 seguido do íon m/z 775, assim como também íons de m/z 301 e 979. A fração obtida por ultrassom apresenta como íons mais abundantes os íons de m/z 979, seguido dos íons de m/z 980, 775 e 300, apresentando também com boa abundância o íon m/z 274. Assim, observa-se que estes espectros possuem maior quantidade de picos, sendo os íons majoritários do soxhlet diferentes dos íons do ultrassom. Assim como nas frações clorofórmicas, as frações em acetato apresentam íons semelhantes entre si.
Figura 18: Espectros de massas das frações alcaloídicas obtidas de folhas e galhos de A. panurensis.
Para as frações alcaloídicas das folhas e galhos de A. panurensis os espectros podem ser observados na figura acima (figura 18). O espectro das folhas apresenta muitos picos de íons de m/z variados, sendo os mais intensos 101, 425 e 893; seguidos dos íons m/z 274, 284, 300, 352, 529, 872 e 909. Já o espectro dos galhos apresentou poucos picos. Os íons mais abundantes possuem m/z 352 e 274. Comparando os espectros das frações de folhas e galhos é possível concluir que a fração alcaloidica de galhos é mais eficiente para um perfil melhor espectral por apresentar poucos íons e com boa abundância. 
As substâncias das frações podem ser determinadas a partir da comparação dos íons m/z com trabalhos já publicados e de acordo com a literatura. Dessa forma, pode-se indicar os constituintes majoritários da espécie. Ao analisar os picos com maior abundância apresentados em todos os espectros, é possível sugerir a presença das seguintes substâncias na espécie (figura 19). Essas duas substâncias de m/z 352 e 340 são constantemente visualizadas nos espectros de massas das frações de média e alta polaridade, assim como das frações alcaloidicas. Além dessas substâncias outras substâncias são também descritas como parte da espécie/família, como: m/z 325 (-)-amurina, m/z 351 imerubrina e imenina, m/z 594 norpanurensina alcaloide. m/z 608 alcaloide panurensina, m/z 819 saponina, entre outras substâncias.
Figura 19: Substâncias presentes nas frações de A. panurensis.
CONCLUSÃO
O uso de diferentes técnicas de extração proporcionou bons dados para comparação de rendimentos dos extratos de A. panurensis, mostrando maior eficiência para o método de soxhlet. As partições realizadas a partir dos extratos apresentaram bons rendimentos, tendo as frações em clorofórmio apresentado maior rendimento para os dois métodos, o que é considerado ótimo, tendo em vista que sabe-se que os alcaloides estão presentes nestas frações. As marchas alcaloidicas realizadasa partir do material vegetal apresentaram bons rendimentos, tendo os galhos se destacado com relação as folhas. 
As análises cromatográficas se mostraram eficientes para análise de substâncias alcaloídicas, flavonoídicas, fenólicas, entre outras. Foi possível observar a presença de alcaloides e flavonoides nas frações obtidas, apesar de em algumas placas não ser possível observar a mancha característica. A caracterização espectrométrica das frações corroborou com os dados encontrados na literatura, mostrando a presença de íons com m/z citados na mesma, determinando assim, sucesso na metodologia utilizada para realização do experimento.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BESSA, N. G. F. d. (2013). Prospecção fitoquímica preliminar de plantas nativas do cerrado de uso popular medicinal pela comunidade rural do assentamento vale verde – Tocantins, 692–707.
Silva, N. L. A., & Conceição, G. M. (2010). Triagem Fitoquímica de Plantas de Cerrado , da Área de Proteção Ambiental Municipal do Inhamum , Caxias , Maranhão, 6, 1–17.
Oliveira, C. De, Ferreira, J. A., & Toma, A. (2010). ANÁLISE FITOQUÍMICA PRELIMINAR DO EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO A PARTIR DO RIZOMA DA TYPHA DOMINGENSIS PERS, 2(2), 17–19.
Sousa, S., Nazaré, M. De, Simone, E., Gurgel, C., Paula, A., & Cruz, O. (2014). Taxonomia do gênero Abuta Aubl . ( Menispermaceae ) no Estado de Rondônia , Brasil, (1984), 62–72.
Sousa, J. dos S. de. (2018). Estudo taxonômico de Abuta ( Menispermaceae ) no estado do Acre , Brasil Resumo Um tratamento taxonômico de Abuta para o estado do Acre é apresentado . A metodologia abrangeu a análise do material proveniente de 17 coletas e amostras de exsicatas de herbá, 69(2), 477–488. https://doi.org/10.1590/2175-7860201869217
JACQUES, F.M.B.; GALLUT, C.; VIGNES-LEBBE, R.; BAGILS, R.Z. Resolving phylogenetic reconstruction in Menispermaceae (Ranunculales) using fossils and a novel statistical test. Taxon 56, p.379-392, 2007.
WEFFERLING, K.; HOOT, S.B.; NEVES, S.S. Phylogeny and fruit evolution in Menispermaceae. American Journal of Botany, 100, p.1-23, 2013.
ROCHA, A.I.; LUZ, A.I.R.; SILVA, M.F. A presença de alcalóides em espécies botânicas da Amazônia – Menispermaceae. Acta Amazônica, v.14, n.1-2, p.244-254, 1984.
DI STASI, L.C.; HIRUMA-LIMA, C.A. Plantas medicinais na Amazônia e na mata Atlântica. São Paulo: UNESP, 2002. 64p.
BARNEBY, R.C. Menispermaceae. In: BERRY, P.; HOLST, B.; YATSKIEVYCH, K. Flora of the Venezuelan Guayana: Liliaceae-Myrsinaceae, v.6. St. Louis, USA: Missouri Botanical Garden Press, 2001. p. 554-578.
MABBERLEY, D.J. The Plant Book. A portable dictionary of the vascular plants. 2. ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1997. 858p.
SOTHERS, C.A.; BRITO, J.M.; ORTIZ-GENTRY, R.; OTT, C. Menispermaceae, In: RIBEIRO, J.E.L.S. et al. Flora da Reserva Ducke: Guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia central. Manaus, Amazonas: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 1999.
HOEHNE, E.C. Plantas e substâncias vegetais tóxicas e medicinais. Coletânea de aulas. São Paulo: Instituto de Botânica do Estado de São Paulo, 1939. 355p.
NAGEM, T.J. et al. Anais da 16ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, PN-86, 1993.
CORRÊA, D.B. et al. Anais da 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira Para o Progresso da Ciência, 439, 1977.
DUTE, P. et al. Phytochemistry (Oxford), v.26, n.7, p.2136-7, 1987.
AHMAD, R., CAVA, M.P.J. Organic Chemistry, v.42, n.13, p.2271-3, 1977.
GALEFFI, C. et al. Farmaco (Sci), v.32, n.12, p.853-65, 1977.
SKILES, J.W.Y. et al. Canadian Journal of Chemistry, v.57, n.13, p.1642-6, 1979.
PINHEIRO, M.L.B. et al. Anais da 36ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira Para o Progresso da Ciência, 547, 1984.
CAVA, M.R. et al. Organic Chemistry, v.40, n.18, p.2647-9, 1975.
LUZ, L.P. Estudo do ultra-som como técnica de extração de carvões e caracterização dos hidrocarbonetos poliaromáticos. Dissertação (Mestrado em Química). Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 1998.
BARBOZA, J.C.S.; SERRA, A.A. Química Nova, v.15, n.4, p.302, 1992.
BLANCO, C.G.; PRADO, J.G.; BORREGO, A.G. Organic Chemistry, v.18, n.3, p.313, 1992.
BRUM, A.A.S. Métodos de extração e qualidade da fração lipídica. Dissertação (Mestrado em Ciências – área de concentração Ciência e Tecnologia de Alimentos). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2004.
BIMARK, M.; RAHMAN, R.A.; TAIP, F.S.; ADZAHAN, N.M.; SARKER, M.Z.I.; GANJLOO, A. Optimization of ultrasound-assisted extraction of crude oil from winter melon (benincasa hispida) seed using response surface methodology and evaluation of its antioxidant activity, total phenolic content and fatty acid composition. Molecules, v.17, p.11748-11762, 2012.
LUQUE DE CASTRO, M.D.; GARCÍA-AYUSO, L.E. Soxhlet extraction of solid materials: an outdated technique with promising innovative future. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.369, n.1-2, p.1-10, 1998.
QUEIROZ, S.C.N.; COLLINS, C.H.; JARDIM, C.S.F. Métodos de extração e/ou concentração de compostos encontrados em fluidos biológicos para posterior determinação cromatográfica. Química Nova, v.24, n.1, p.68-76, 2001.
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Química Analítica, Tradução da 8ª Edição norte-americana, cap. 30: Introdução às Separações Analíticas, Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Introdução à métodos cromatográficos. 7ª ed. Campinas, SP: Editora da UNICAMP, p. 45-56, 1997.
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Química Analítica, Tradução da 8ª Edição norte-americana, cap. 28: Espectroscopia Atômica, Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.
WILSON, K.; WALKER, J. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7a ed., p.352, 2009.