COPROLOGIA E METODOS PARASITOLOGICO UFPE

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EXAMES PARASITOLÓGICOS
A maioria dos parasitos intestinais pode ser diagnosticada pelo exame das fezes, embora outros materiais como urina, escarro, secreções, tecidos e conteúdo duodenal, podem ser utilizados para identificação de algumas espécies de parasitas. 
No diagnóstico parasitológico podemos identificar mais frequentemente ovos e larvas de helmintos e os cistos, oocistos e trofozoítos de protozoários. A identificação correta dos parasitos vai depender principalmente das condições das amostras. Portanto, é fundamental a colheita adequada do material. 
No material fecal normalmente encontramos elementos como resíduos alimentares, células vegetais, grão de pólen, leucócitos e outros artefatos que podem facilmente ser confundidos com parasitos.
Adultos de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, proglotes de Taenia spp e de Dipylidium caninum podem ser encontrados no bolo fecal, sem que a presença de ovos seja identificada. Desta forma é importante a realização do exame macroscópico. 
A detecção e a identificação dos parasitos intestinais depende, portanto, da qualidade da amostra entregue ao laboratório. Na colheita deve-se observar o tipo de recipiente, volume, tempo da amostra, utilização de algumas drogas pelo pacientes, compostos químicos. Estes fatores podem interferir na realização do exame. 
O recipiente deve estar seco e limpo. Amostras secas nas bordas e na superfície devem ser rejeitadas. O pote deve estar livre de anti-sépticos, agentes germicidas, gotas de óleo e de urina para evitar a destruição de formas vegetativas. 
Fezes excretadas no solo não devem ser utilizadas para evitar a contaminação com larvas de vida livre. O material não pode ser obtido de privadas, pois a água e a urina poderiam destruir trofozoítos. Os medicamentos como antibiótico, antidiarréicos, antiácidos, derivados de bismuto e do bário, vaselina e óleos minerais podem interferir nos resultados levando a resultado falso negativo. A utilização de antibióticos pode afetar a flora intestinal normal causando diminuição ou ausência temporária dos organismos, visto que muitos parasitos se alimentam de bactérias intestinais. 
De um modo geral as amostras devem ser colhidas em dias separados, uma série de três amostras em não mais de 10 dias. Este procedimento propicia uma maior positividade, uma vez que a eliminação de ovos e cistos nem sempre ocorre continuamente. 
O tempo de colheita do material também influencia no resultado. Os trofozoítos de protozoários não se multiplicam nem encistam fora do organismo humano, e geralmente se degeneram após a excreção. Desta forma recomenda-se a leitura 30 minutos após a colheita de fezes líquidas, as fezes pastosas devem ser processadas até uma hora após evacuação. Pelo curto tempo nestes casos, este material deve ser colhido com substâncias conservantes como formalina, MIF, SAF, etc. Quando se trata de fezes sólidas este material pode ser observado até 24 horas ou preservados. 
SOLUÇÕES CONSERVADORAS DE MATERIAL FECAL 
Formalina a 10% 
MIF (mertiolato iodo formaldeído) 
SAF: 
TAF: utilizada na conservação de helmintos (larvas e vermes adultos). 
EXAME MACROSCÓPICO 
As amostras fecais não preservadas devem ser examinadas macroscopicamente para determinar consistência, odor, cor, presença ou ausência de sangue, muco, proglotes e vermes adultos. 
NORMAS TÉCNCAS DE SEGURANÇA LABORATORIAL 
Utilizar uniforme adequado nos trabalhos de laboratório. 
Manusear o material biológico devidamente protegido 
Evitar aspirar ou inalar produtos químicos ou biológicos. 
Identificar os produtos ou soluções antes de usar.
Encaminhar ao lixo a vidraria danificada. 
Desprezar todas soluções sem identificações. 
Manter em soluções conservadoras o material diagnosticado para demonstração futura. 
O transporte de substâncias voláteis, ácidos ou bases fortes, deverá ser realizado com cuidados especiais de segurança. 
CONTROLE DE QUALIDADE 
Não utilizar soluções, reagentes e corantes com a data vencida. 
Observar a adequada calibração de equipamentos (alça de platina) 
Manter o equipamento óptico (microscópio, lupa) em bom estado de conservação. 
Controle diário da temperatura de banho-maria e estufa. 
Não submeter vidraria e equipamentos calibrados à alta temperatura. 
Conservar adequadamente amostras padrões de parasitos e material de ensino. 
Estabelecer controle de qualidade externo mantendo intercâmbio com outros profissionais (instituições de referência). 
COPROLOGIA 
RESÍDUOS ALIMENTARES E ELEMENTOS ANORMAIS 
Introdução: 
Devido a uma grande variedade de elementos que o exame microscópio pode revelar nas fezes, nem mesmo os coprologistas mais experimentados são capazes de identificar tudo que é visto nas preparações de lâminas fecais. 
A coprologia tem como objetivo estudar as mais diversas funções digestivas, que direta ou indiretamente, estejam ligadas a formação de massa fecalógica final. A presença de estruturas como polimorfonucleares, eritrócitos, piócitos, grão de amido, fios e pêlos vegetais, cristais de Charcot Leyden, macrófagos, Blastocystis, etc., muitas vezes confundem os técnicos em microscopia com estruturas outras, tais como: trofozoítos, cistos, larvas e ovos. 
OBS: Os cristais de Charcot Leyden (CCL) possuem forma de duas pirâmides sextavadas unidas em suas bases e são constituídos pela desintegração de produtos dos eosinófilos e dos basófilos, sendo frequentemente observados em indivíduos com parasitoses intestinais e/ou em qualquer tipo de infiltrado inflamatório com grande número dessas células. 
A presença de CCL é indicativa de resposta imune, persistindo nas fezes de pacientes com processos inflamatórios eosinofílicos. Neste contexto, a correta identificação e o relato destes cristais são de extrema importância no diagnóstico clínico das enteroparasitoses, uma vez que sua ocorrência pode estar relacionada a um quadro de infecção por parasito mesmo na ausência de helmintos e protozoários ao exame microscópico.
O referido tema possuí grande relevância no que diz respeito, principalmente aos chamados diagnósticos diferenciais dos esfregaços fecais, dando condições técnicas ao laboratório, para fornecer resultados que induzam ao medico o diagnóstico, facilitando a formulação das requisições direcionadas para cada caso específico. 
Ex.: requisição direcional para coprocultura ou para exame parasitológico. 
FINALIDADES GERAIS DA COPROLOGIA: 
Estudo das funções digestivas. 
Pesquisa do sangue oculto. 
Pesquisa bacteriológica 
Pesquisa parasitológica 
Na avaliação coprológica deve-se proceder de forma científica desde a avaliação com orientação médica ao paciente, até o tipo de dieta, coleta e manuseio até chegar aos resultados coprológicos finais. Normalmente o paciente é orientado, de acordo com o tipo de exame que se pretende fazer. 
Ex. na pesquisa de sangue oculto fecal, não podemos permitir que o doente ingira carnes ou medicamentos ferrosos, que certamente iriam mascarar os resultados. 
Para o exame parasitológico de rotina, não se deve prescrever qualquer tipo de regime alimentar especial. Para os exames coprológicos especiais como dosagem de gordura fecal e/ou das funções digestivas, recomenda-se o Regime misto ou seja, o paciente conserva os seus hábitos alimentares, acrescentando as substâncias alimentares específicas em qualidade e quantidade estipuladas pelo médico requisitante.
 DIETA DE GAUTIER para estudo dos elementos residuais das fezes: 
Carne de bovino-------------------------------------------------- 60 g 
Leite ---------------------------------------------------------------300 mL 
Manteiga --------------------------------------------------------- 30 g 
Pão -----------------------------------------------------------------100 g 
Batata --------------------------------------------------------------100 g 
OBS.: nestas quantidades prescritas, basta 1 única refeição de prova, não havendo necessidade de dieta por período de 3 dias, como manda as dietas em geral. 
Ingerir uma cápsulade Carmim 0,3 g ao iniciar a dieta, a fim de facilitar o reconhecimento das fezes. 
Deve-se coletar todo o material da evacuação normal ( a mais próxima da prova) em frasco de boca larga limpo e seco remetendo imediatamente para o laboratório, ou colocar em geladeira 4°C para exame posterior. 
A maioria dos autores critica a utilização de purgantes para acelerar as evacuações. 
PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES 
PROCEDIMENTO: 
Espalhar pequena quantidade de fezes sobre o papel de filtro limpo e colocar duas gotas de água oxigenada sobre o esfregaço. Adicionar duas gotas de solução de benzidina. 
Observar imediatamente a cor. 
Leitura: 
A reação de benzidina é sensível, mas as gorduras podem torná-la positiva. 
Nenhuma mudança de cor: Negativo 
Cor esverdeada: Traços 
Cor verde claro: + 
Cor vede escuro: ++ 
Cor verde azulado: +++ 
Azul intenso: ++++ 
OBS: Existe testes rápidos no mercado, para pesquisa de Sangue oculto nas fezes, que não há necessidade de regime alimentar ou medicamentoso. Alem de ser de bem fácil execução
ASPECTOS GERAIS DA MATÉRIA FECAL: 
Aspectos do material fecal como, consistência, forma, cor, odor, viscosidade e pH, são fatores de grande relevância para o diagnóstico coprológico, como um todo, sendo considerados desde uma simples indução diagnóstica, até mesmo a alterações de caracteres patológicos de malignidade. 
Ex.: 
Fezes em formato típico de fita pode ser indício de algum estreitamento do reto sigmóide. 
Fezes com odor típico de cola de carpinteiro, fala a favor de infecção por ameba. 
Fezes com presença de sangue podem induzir as diagnósticos de processos hemorroidários ou câncer. 
EXAME MICROSCÓPICO 
Resíduos alimentares de origem animal 
Tecido conjuntivo, fibras musculares, gorduras e sabões. 
RESÍDUOS ALIMENTARES DE ORIGEM VEGETAL 
Amido intracelular, amido extracelular (amido amorfo), amido cru, celuloses, fibras e pêlos vegetais, vasos espiralados e células vegetais. 
ELEMENTOS DE ORIGEM INTESTINAL DE NATUREZA NÃO PARASITÁRIA: 
Muco, eritrócitos, leucócitos, piócitos, células epiteliais, cristais. 
ELEMENTOS DE ORIGEM INTESTINAL DE NATUREZA PARASITÁRIA E/OU PUROS COMENSAIS 
Protozoários, helmintos, artrópodes, Blastocystis, Meloidogyne e leveduras. 
CONCLUSÃO DE ESTUDO COPROLÓGICO COM DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS LÂMINAS 
L1: leucócitos + eritrócitos + piócitos (raros/ausentes) + cristal de Charcot Leyden = diagnóstico sugestivo de Amebíase (Disenteria amebiana). 
L2: leucócitos + eritrócitos + piócitos (inúmeros) + ausência de cristal de Charcot Leyden = diagnóstico sugestivo de um processo bacilar (disenteria bacilar). 
Nestes casos em particular, o cristal e os piócitos foram elementos diferenciadores do diagnóstico laboratorial em lâmina. 
O diagnóstico diferencial em lâmina fecal é muito importante quando o médico necessita intervir com urgência, seja com relação ao tipo específico de exame que deva se requisitar ou mesmo com relação à terapêutica, principalmente quando se trata de paciente de baixa idade ou idosos. 
EXAME PARASITOLÓGICO DAS FEZES 
O exame parasitológico de fezes constitui na prática médica providência de fundamental importância para o diagnóstico das parasitoses intestinais. Sua execução envolve a utilização de vários métodos que objetivaram a pesquisa de protozoários intestinais nas suas formas císticas e vegetativas, como também de ovos, larvas e por vezes vermes adultos de helmintos. 
Além da possível presença de formas infectantes ou infestantes, de enteroparasitos, há também a possibilidade de que o material em exame contenha bactérias e vírus patogênicos. Portanto, deve ser observada uma série de cuidados não só na manipulação, como também na limpeza da vidraria e na destinação da amostra examinada. O emprego de substâncias desinfetantes se faz necessário. 
COLETA DE MATERIAL: 
Geralmente a colheita do material é feita em casa, portanto são necessárias algumas recomendações, uma vez que sua coleta adequada é de fundamental importância. 
As amostras não devem ser colhidas durante uma semana depois que o paciente tenha tomado substâncias que deixam resíduos cristalinos, tais como compostos antidiarréicos, antiácidos, bismuto e bário. Além disso, laxativos oleosos tais como óleo mineral pode interferir no exame. 
Antibióticos e meios de contraste reduzem os números de organismos, particularmente protozoários, nas fezes durante 2 a 3 semanas. As amostras devem ser isentas de urina e não devem estar contaminadas por água do vaso sanitário ou pelo solo, pois estes podem conter protozoários e helmintos livres ou podem destruir trofozoítos. Água armazenada no laboratório também podem tornar-se contaminadas com estes organismos. 
Como os números de formas diagnosticados de alguns parasitos podem variar, é aconselhável examinar os espécimes obtidos em dias alternados ou de 3 em 3 dias, com um total de três espécimes sendo o mínimo para assegurar ausência de infecção. 
As fezes para exame coprológico devem ser colhidas em recipientes de boca larga cuidadosamente limpos, sem necessidade de esterilização. Colher o material correspondente à parte intermediária da evacuação, que é em geral de maior uniformidade. 
Quando o exame seriado obtido normalmente é examinado e não identifica parasito, podem ser conseguidos espécimes purgados, particularmente quando se suspeitam de infecções por protozoários. Deve-se usar purgativos salinos, como sulfato ou fosfasoda tamponada em vez de compostos de óleo mineral ou de magnésia, que podem interferir com o exame por causa dos glóbulos de óleo ou detritos cristalinos. 
ASPECTO MACROSCÓPICO DO MATERIAL FECAL 
Deve-se fazer um exame macroscópico das fezes, porque permite observar: 
a) Consistência: moldada, pastosa, diarréica. 
b) Presença de sangue e muco 
c) cor 
d) Helmintos adultos ou partes dos mesmos 
Quando se tratar de material moldado, ou mesmo pastoso, são indicados os métodos de concentração, ao passo que em se tratando de material diarréico, liquefeito ou com muco ou sangue, impõe-se os exames diretos a fresco ou após fixação pela hematoxilina férrica. 
Esta conduta é explicada pelo fato de que, geralmente, nas enteroprotozooses, as formas vegetativas são encontradas no material diarréico, enquanto cistos estão presentes em fezes pastosas e moldadas. Evidentemente, as formas vegetativas muito frágeis não resistem aos trâmites dos métodos de concentração. 
Todavia, também estes devem ser aplicados ao material liquefeito, portanto nas helmintoses intestinais podem sobrevir, muitas vezes, crises diarréicas. 
PROTOZOÁRIOS DE VIDA LIVRE 
TIPOS DE MOVIMENTO 
Movimento Amebóide: 
Processa-se por meio da emissão de prolongamentos do protoplasma, que são os pseudópodes. É o movimento das amebas, pode ser lento ou rápido. (amebídeos de vida livre) 
Movimento Flagelar: 
Processa-se as custas de flagelos, são filamentos longos, delgados e flexíveis. O número de flagelos nos animais varia de 01 a 08. É um movimento tipo saltitante, helicoidal, chicoteando o meio líquido (Euglena). 
Movimento Ciliar: 
Processa-se por meio de cílios, que são filamentos curtos e numerosos, envolvendo todo corpo do animal. É um movimento ondulante, oscilatório (Paramecium, Opalina, etc.) 
Algumas formas que são de vida livre ou saprozóicas no interior de animais: 
Rhizopoda 
Amoeba proteus 
Mastigophora 
Trichomonas, Chilomastix, Euglena 
Ciliophora - Paramecium, Opalina, Zeleriella, Nyctotherus 
OBSERVAÇÃO DO MATERIAL 
Exame Direto 
1. colocar uma gota do material a ser examinado numa lâmina, cobrindo com uma lamínula. 
2. Usando a objetiva de 45X, observar a presença de formas móveis dos protozoários (trofozoítos) 
3. Procurar focalizar o protozoário, que é facilmente reconhecido pelo seu movimento típico 
OBSERVAÇÃO DE FLAGELADOS E CILIADOS 
1. Preparar a lâmina com o material a observar 
2. Levar ao microscópio usando a objetiva de 45X e observar os movimentos da forma pesquisada. 
3. Retirar com papel de filtro, parte da águaexistente entre a lâmina e lamínula, com cuidado, até conseguir uma diminuição do movimento do flagelado ou ciliado e verificar as características morfológicas 
MÉTODOS LABORATORIAIS APLICADOS NA IDENTIFICAÇÃO DE PARASITOS DO APARELHO DIGESTIVO 
QUALITATIVOS 
Preparação à fresco: 
Este método é indicado para o material fecal emitido recentemente (menos de 20 minutos), de consistência líquida ou pastosa e que se admite que contenham trofozoítos de protozoários. 
Exame Pelo Método Direto 
Este método foi utilizado pela primeira vez por Leeuwenhoek quando identificou a Giardia lamblia no século XVII. Tem sido empregado quando há carência de recursos ou a infestação parasitária é reconhecidamente intensa. Pode ser empregado em fezes de consistência variada, recentemente emitidas ou não. 
MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA (HOFFMAN, PONS & JANER) 
FUNDAMENTO: 
Precipitação de partículas, inclusive de cistos, ovos e larvas de parasitos ao fundo do cálice de sedimentação, devido a força de gravidade. 
INDICAÇÃO: 
Utilizado na pesquisa de ovos de S. mansoni, é atualmente usado na rotina diária dos laboratórios, na detecção de cistos de protozoários, de ovos e larvas de helmintos. Adolf Lutz, eminente pesquisador brasileiro, empregou o modelo pela primeira vez, no entanto, foi a partir dos trabalhos de Hoffman, Pons e Janer, que a técnica passou a ser conhecida mundialmente. 
A vantagem deste método é a economia dispensando o uso de reagentes e centrífugas. A desvantagem é a grande quantidade de detritos fecais, dificultando, com freqüência a preparação e o exame da lâmina. 
PROCEDIMENTO: 
1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em copo graduado ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de água corrente e misturar vigorosamente. 
2. Preparar a suspensão juntando 100 ml de água corrente. 
3. Filtrar essa suspensão através de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em copo de sedimentação de capacidade de 125 ml. 
4. Se necessário, adicionar água corrente, até completar aproximadamente ¾ do volume do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas. Se necessário decantar o sobrenadante após no mínimo 30 minutos, com a finalidade de diminuir os detritos alimentares e facilitar a leitura no microscópio 
5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena porção do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente. Colher amostra adicional do centro e do fundo do sedimento. 
6. Examinar ao microscópio, a presença de ovos, larvas e cistos. 
CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO PELO SULFATO DE ZINCO (FAUST & Cols.) 
FUNDAMENTO: 
Flutuação de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos em solução de sulfato de zinco. 
INDICAÇÃO: 
Indicado na pesquisa de protozoários e de ovol leves de helmintos (Ancilostomídeos, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura). 
Esta técnica é imprópria para espécimes que contenham grande quantidade de gorduras. A técnica pode ser utilizada com fezes preservadas em formaldeído, SAF e outros fixadores, no entanto a densidade específica deverá se ajustada em 1.2 g/mL. O aumento de densidade poderá resultar em uma distorção dos organismos. 
Obs.: 
1. ovos de trematódeos e de cestóides podem estar presentes, portanto um exame completo deve-se examinar também o sedimento. 
2. uma permanência prolongada da suspensão em sulfato de zinco, pode resultar em distorção dos cistos e ovos de nematódeos. A preparação deve ser examinada até 20 minutos. Deve-se utilizar tubos com fundo 
PROCEDIMENTO: 
1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 ml de água. Filtrar a suspensão através de gazes dobradas em quatro vezes , e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 
2. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar ( 650x g (2500rpm) por 1 minuto ). 
3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ao sedimento , antes de ressuspendê-lo. Completar com água 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar. 
4. Repetir a etapa 3, até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. 
5. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 ml do reagente , e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco 33% até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g( 2500rpm) por 1 min 
6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação colocá-lo em uma estante em posição vertical. 
7. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana formada na superfície, transferido várias alçadas para uma lâmina de microscopia. Examinar ovos larvas e cistos. 
8. Depois de concluída a etapa 4, com auxílio de pipeta, encher o tubo até a borda com solução de sulfato de zinco. Colocar uma lamínula (22 x 22 mm) na superfície do tubo. Deixando-a em contato com o líquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo a sua posição, e colocar a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar para larvas e cistos. 
MÉTODO DE WILLIS 
FUNDAMENTO: 
Baseia-se na capacidade da solução saturada de cloreto de sódio ou açucar em fazer flutuar ovos de helmintos considerados leves. 
INDICAÇÃO: 
1. Recomendado para a pesquisa de ovos de helmintos de baixo peso específico como ancilostomídeos e Trichuris trichiura ou ainda de ovos férteis de Ascaris lumbricoides. Não é recomendado para protozoários, ovos inférteis de A. lumbricoides e ovos de tremaódeos ou E. vermicularis.. Este método é bastante eficiente na identificação de ovos de ancilostomídeos, sobretudo nos casos em que há baixa infestação. Pode-se usar açucar ao invés do sal no preparo da solução (Sheather). 
PROCEDIMENTO 
1. Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g. coletada de várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de diâmetro com capacidade aproximada de 20 ml. Completar ¼ da capacidade do recipiente com solução saturada de cloreto de sódio. 
2. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total homogeneização. 
3. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; não deverá haver formação de bolhas de ar entra a lamínula e a superfície do líquido. A gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula . 
4. Remover a lamínula e inverter rapidamente a sua posição sobre uma lâmina. 
5. Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento. 
CENTRÍFUGO-SEDIMENTAÇÃO POR FORMOL ACETATO DE ETILA 
FUNDAMENTO: 
Fornece o diagnóstico para ovos, larvas e cistos de todas as espécies de parasitos intestinais detectáveis, além de separar dos detritos, deixando o sedimento limpo. 
INDICAÇÃO: 
Destina-se à pesquisa de protozoários e helmintos nas fezes 
PROCEDIMENTO: 
1. Diluir aproximadamente 2 g de fezes em 5 mL de solução de formalina a 10% e filtrar por meio de gaze dobrada. 
2. colocar em tubo de centrifuga e acrescente 1 ou 2 gotas de detergente comercial. 
3. acrescentar 3 mL de acetato de etila comercial; 
4. tampe o tubo e agite por 10 segundos 
5. destampar e centrifugar por 2 minutos a 2000rpm . Observar a formação de quatro camadas distintas 1a camada - sedimento no fundo do tubo 2a camada formalina 3a camada detritos 4a camada acetato de etila 
6. despreze a camadas sobrenadantes com um movimento rápido 
7. ressuspender o sobrenadante com 7 ml de água. Tampe o tubo e agite 
8. centrifugar 2000 rpm por 2 minutos. Desprezar o sobrenadante 
9. deixar o tubo emborcado sobre gaze por 2 minutos 
10. ressuspender o sedimento com lugol. Colocar uma gota do sedimento sobre lâmina e procedera leitura. 
FUNÇÃO DO FORMOL: fixar e manter íntegras as estruturas de ovos, larvas e cistos por períodos prolongados. Tem função também de diluente. 
FUNÇÃO DO ACETATO DE ETILA: o acetato de etila remove as substâncias graxas e possibilita a flutuação dos detritos. É um eficiente solvente paraobjetos de plástico (tubo, pipetas, estantes, empregá-los sempre com objetos de vidro) 
FUNÇÃO DO DETERGENTE: o detergente se destina a aumentar a positividade para ovos de A. lumbricoides. Os ovos inférteis de ascaris têm a superfície acentuadamente mamilonada, permitindo que muitas gotículas de acetato de etila se alonguem na sua face voltada para o fundo do tubo. Em consequência alguns desses ovos seriam retidos junto ao sobrenadante. Em presença de detergente, que tem a propriedade de baixar a tensão superficial, as gotículas de acetato confluem umas em relação as outras com maior facilidade, reduzindo a possibilidade delas alongarem debaixo de estruturas como os ovos inférteis de Ascaris. 
CENTRÍFUGO-SEDIMENTAÇÃO POR FORMOL ÉTER (MÉTODO DE RITCHIE) 
UNDAMENTO: 
Fornece o diagnóstico para ovos, larvas e cistos de todas as espécies de parasitos intestinais detectáveis, além de separar dos detritos e gorduras fecais. 
INDICAÇÃO: 
Destina-se à pesquisa de protozoários e helmintos nas fezes 
FUNÇÃO DO ÉTER: 
O éter tem a mesma função do acetato de etila, isto é, ele dissolve as substâncias graxas e faz flutuar os detritos, porém ele é mais volátil, explosivo e inflamável. 
PROCEDIMENTO: 
1. Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10ml de água corrente ou solução salina a 0,85%; 
2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada duas ou quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 
3. Centrifugar 2000 rpm por minuto); 
4. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ou solução salina a 0,85% ao sedimento antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente (ou solução salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar 2000rpm por 1 min). 
5. Repita a etapa 4, até que o sobrenadante se apresente relativamente claro. 
6. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2 ml de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a 10% , pH. Neutro). Completar o volume da suspensão em 10 ml com formalina a 10%. Deixar em repouso em repouso durante 5 minutos. 
7. Adicionar 3ml de éter ou acetado de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado. 
8. Centrifugar 2000rpm 1 min. Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície. 
9. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete fino,e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes. 
10. Uma pequena quantidade de líquido que permanece nas paredes do tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento, preparando as lâminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos. 
MÉTODO DE BAERMANN-MORAES 
FUNDAMENTO: 
Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas e na tendência destas de sedimentar, espontaneamente, quando se encontram na água. 
INDICAÇÃO: 
Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de ancilostomídeos e por vezes até adultos de nematódeos pequenos como E. vermiculares. 
Ao serem examinadas fezes que permaneceram, antes do exame, em temperatura ambiente por período superior a 24 horas, ou ainda de indivíduos que sofrem de constipação intestinal, ocorre a possibilidade de que as larvas encontradas sejam rabditóides ou filarióides de ancilostomídeos e não de Strongyloides stercoralis 
PROCEDIMENTO: 
1. Encher o funil com água corrente, aquecida a 40-45ºC. 
2. Abrir a pinça de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de água para evitar a formação de bolhas de ar na haste e no tubo de látex. 
3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada quatro vezes e, se necessário, juntar mais água, até que as fezes fiquem submersas. 
4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 
5. Abrir a pinça e coletar parte do líquido em vidro de reógio; examinar ao microscópio estereoscópio (aumentos 20 a 30 x). Deixar em repouso durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migrarão para o centro do vidro de relógio, ou proceder de acordo com o item 6. 
6. Coletar em tubo cônico de centrífuga. Centrifugar (500 x g por 1 min), e examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de Lugol, para a identificação das características morfológicas das larvas, e examinar ao microscópio com aumento de 20x. 
MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA 
FUNDAMENTO: 
Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas de S. stercoralis contidas no material fecal. 
INDICAÇÃO: 
Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de Ancilostomídeos, notadamente em pacientes portadores de constipação intestinal. 
A observação microscópica deve ser cuidadosa e toda larva visualizada deverá ser identificada segundo a chave de classificação proposta por AMATO NETO & cols. 
PROCEDIMENTO: 
1. Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás; 
2. Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de água corrente aquecida a 40-45°C, um copo cônico de 
sedimentação (capacidade de 125ml); 
3. Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cônico de sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para não formar bolhas de ar; 
4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 
5. Colher o sedimento, no fundo do copo cônico, com pipeta capilar longa. Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo Cônico antes da colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente, para evitar o revolvimento do líquido; 
6. Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de lugol. 
MÉTODO DE HARADA-MORI 
FUNDAMENTO 
O método visa o cultivo de larvas em papel de filtro. 
INDICAÇÃO 
Empregado no cultivo de larvas de ancilostomídeos e Strongyloides stercoralis presentes no material fecal. 
PROCEDIMENTO: 
1. Distribuir 0,5 g de fezes em tira de papel de filtro (3 x 15 cm), deixando as extremidades livres. 
2. colocar a tira em um tubo de ensaio (18 cm), com água destilada, de modo q1ue a extremidade inferior toque na água; 
3. tampar o tubo de ensaio, deixar 7 a 14 dias na temperatura ambiente 
4. examinar com lupa o fundo do tubo 
5. adicionar formalina 10% de piperazina a 5% e colocar o tubo de ensaio em banho-maria a 50oC por 15 minutos a fim de matar as larvas; 
6. retirar as larvas e coloca-las entre lâmina e lamínula para identificação. 
MÉTODO DE TAMISAÇÃO (pesquisa e identificação de proglotes) 
FUNDAMENTO: 
Este método fundamenta-se na tamisação do material fecal, como meio de captura de anéis (proglotes) de tenídeos. 
INDICAÇÃO: 
É indicado para a retirada de anéis de escólex de tenídeos das fezes para fins de diagnóstico para controle de cura; como também são encontrados vermes adultos de A. lumbricoides, E. vermicularis, T. trichiura, Ancilostomídeos e H. nana. Estes parasitas são encontrados no bolo fecal durante o início do tratamento. recomenda-se realizar o método com o material fecal excretado durante o dia. Para melhor conservação, as fezes devem ser colocadas em formalina 10% 
PROCEDIMENTO: 
Emulsionar as fezes com água. Coar a emulsão através de peneira metálica. Este procedimento deve ser realizado em uma pia, servindo-se de um jato de água corrente. Vermes adultos como o Ascaris lumbricoides e Enterobius vermicularis são encontrados freqüentemente misturados ou na superfície das fezes, como também as proglotes de tenias. 
Outros helmintos como o Trichuris trichiura, ancilostomídeos e Hymenolepis nana são depositados no bolo fecal após o início do tratamento. 
Freqüentemente poderão ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausência dos ovos.Esses processos macroscópicos são vantajosos para a demonstração e coleta de pequenos helmintos, de proglotes e de escólex. 
Identificação de Proglotes de Taenia 
Dois métodos são indicados para a identificação de proglotes de Taenia: o ácido acético e o de CAMPOS (AMATO NETO & CORREA, 1980). 
Método do Ácido Acético Glacial: 
1. Colocar em uma placa de Petri, contendo ácido acético glacial, a proglote a ser identificada, durante 15 a 20 minutos. 
2. Após o período, comprimi-la entre lâminas. 
3. Examinar sob iluminação intensa. 
Método de CAMPOS: 
1. Dissolver três comprimidos de metoquina em 5 ml de água destilada-deionizada. 
2. Mergulhar nesta solução, durante 15 minutos, a proglote a ser identificada. 
3. Após este período, comprimi-la entre lâminas. 
4. Examinar sob iluminação intensa. 
MÉTODO DA FITA GOMADA (GRAHAM) 
FUNDAMENTO 
Baseia-se na utilização da fita gomada na apreensão de estágios evolutivos de parasitos, localizados na região perianal. 
INDICAÇÃO 
Este método é indicado para a pesquisa de todos os parasitos que prioritária ou ocasionalmente se deslocam até a região perianal. Assim sendo, poderemos detectar o Enterobius vermicularis, 
Taenia sp, e eventualmente ovos de Ascaris lumbricoides, Ancilostomídeos e Trichuris trichiura. 
PROCEDIMENTO 
1. Coleta do material deverá ser realizada pela manhã antes que o paciente realize sua higiene. Recomendar que o paciente não utilize pomada ou outro qualquer medicamento de uso tópico na região anal ou perianal na noite anterior ao exame. 
2. Tomar um pedaço de fita gomada com aproximadamente 10 cm, colar nas extremidades dois retângulos de papel "oficio", a fim de servirem para identificação dos pacientes e manuseio do técnico, sem risco de contaminação. 3. Montar em tubo de ensaio. (l5xI50) de modo que a parte adesiva permaneça livre, na parte externa do fundo do tubo. 
4. Recomendar que o paciente fique em decúbito ventral, e aplicar a fita gomada montada sobre a região perianal, tendo o cuidado de afastar os glúteos. 
5. Após a coleta, aplicar a fita gomada sobre a lâmina pressionando levemente do centro para a periferia a fim de evitar a apreensão de bolhas de ar. 
6. Preparar no mínimo duas lâminas. Em seguida levar a microscopia. 
7. As lâminas assim preparadas poderão ser encaminhadas até dois meses após, devido a capacidade de conservação da técnica 
TÉCNICA DE KINYOUN 
FUNDAMENTO 
Os coccídios coram-se pela fucsina básica , adquirindo coloração vermelha ou rosa brilhante intensa; e são álcool ácido resistente, destacando-se de outros resíduos, leveduras e bactérias. 
INDICAÇÃO 
Este método é indicado para pesquisa dos coccídios intestinais, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis e Isospora belli 
PROCEDIMENTO: 
1. Preparar o esfregaço com uma a duas gotas de fezes frescas ou preservadas. Deixar secar a temperatura ambiente. 
2. Fixar submetendo direto ao calor rapidamente. 
3. Cobrir com Fucsina 3 a 5 minutos 
4. Lavar rapidamente 
5. Diferenciar com álcool ácido até não sair mais corante. 
6. Lavar com água 
7. Contra corar com azul de metileno 30 segundos a 1 minuto. 
8. Deixar secar e examinar ao microscópio 
Obs.: a coloração de fundo da preparação depende do corante utilizado; azul de metileno concede a cor azul aos organismos que não se coram pela fucsina, enquanto o verde malaquita cora o fundo verde e o ácido pícrico em amarelo 
SOLUÇÃO DE FUCSINA CARBÓRICA 
Fucsina básica 4,0 g 
Fenollíquido 8,0 g 
Álcool a 95 % 20 mL 
Água destilada 100 mL 
Dissolver a fucsina no álcool e no fenol. 
Filtrar antes de usar. 
SOLUÇÃO DE ÁCOOL-ÁCIDO CLORÍDRICO A 0,1% 
HCl P.A 0,1 mL 
Álcool 99 mL 
SOLUÇÃO ESTOQUE DE AZUL DE METILENO 
Azul de metileno 1,4 g 
Álcool a 95% 100 mL 
SOLUÇÃO DE USO AZUL DE METILENO 
Solução estoque 10 mL 
Água destilada 90 mL 
MÉTODOS QUANTITATIVOS 
Estes métodos são empregados quando se deseja avaliar a intensidade da infestação parasitária, ou ainda quando se pretende comparar métodos laboratoriais. Descreveremos dois destes métodos; o de STOLL-HAUSHEER e o KATO-KATZ. 
Os únicos parasitos humanos para os quais é possível correlacionar a produção de ovos com a carga parasitária são Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, ancilostomídeos (Necator americanus e Ancylostoma duodenale) e Schistosoma mansoni.
O conhecimento da carga parasitária é útil para determinar a intensidade da infecção, decidir pela medicação e avaliar a eficácia dos medicamentos administrados. Não se deve esquecer que a estimativa da contagem dos ovos varia em relação direta com a acuidade do procedimento. Quando dois ou mais espécimes fecais são comparados, o mesmo microscopista deve excetuar a técnica de todas as amostras e realizar múltiplas contagens. A intensidade de uma infecção é determinada pelo número de ovos encontrados.
MÉTODO DE STOLL-HAUSHEER (contagem de ovos) 
FUNDAMENTO 
Baseia-se na diluição de quantidade conhecida de fezes e a contagem do número de ovos de uma amostra da diluição, de maneira a deduzir a intensidade parasitária. 
INDICAÇÃO 
Indicado na avaliação da carga parasitária e suas repercussões patogênicas. Ex. Ancilostomídeos. 
PROCEDIMENTO 
1. Preencher com NaOH 0,1 M, o frasco de Stoll até a marca que corresponde a 56 mL. 
2. Adicionar fezes até que o líquido (NaOH) alcance a marca de 60 mL. 
3. Introduzir no frasco pérolas de vidro (+ 12) e em seguida, obturá-lo com rolha de borracha. 
4. Agitar bem até a perfeita homogeneização logo após, retirar com pipeta aspiratória 0,1 mL da suspensão. Pipeta aspiratória ou pipeta automática. 
5. Colocar em lâmina, cobrir com lamínula e examinar em pequeno aumento. 
6. Contar o número total de ovos na lâmina. 
7. Calcular o número de ovos por grama de fezes, multiplicando o valor encontrado por 150 
8. Examinar sempre mais de uma lâmina e trabalhar com a média aritmética. O resultado encontrado é indicado por alguns autores como ovos/rnL 
OBS. O resultado deverá ser corrigido segundo a consistência das fezes. Fezes formadas, multiplicar o resultado por 1; fezes pastosas por 1,5; e fezes diarréicas por 3. Os resultados conseguidos em material fecal líquido não são confiáveis. 
A agitação recomendada no ítem 4 nunca deverá ser com movimentos circulares e sim de alto para baixo. 
A solução de hidróxido de sódio 0,1M saponifica as gorduras, libertando os ovos dos detritos fecais, mantendo a suspensão clara.
Reagentes:
Solução de Hidróxido de Sódio 0,1M
Hidróxido de sódio (NaOH) 4g
Água destilada-deionizada q.s.p. 1.000ml
MÉTODO DE KATO-KATZ 
FUNDAMENTO 
Fundamenta-se na contagem de ovos de helmintos em lâmina qpós o peneiramento e contato com substância conservadora. 
INDICAÇÃO 
Indicado para avaliação da carga parasitária no diagnóstico e controle de cura após o tratamento. 
Ex. Schistosoma mansoni. 
Contar os ovos encontrados em toda a lâmina e multiplicar por 23, a fim de ter o número de ovo por grama de fezes. 
OBS.:Apesar de ser recomendado para a pesquisa de helmintos, este método tem sido empregado com mais frequência na esquistossomose, devido às modificações que podem ocorrer na morfologia dos ovos de outros parasitas. 
A função da glicerina é a clarificação da matéria fecal, tornando-a transparente e permitindo melhor visualização dos ovos aí presentes. Os ovos de Ascaris e de Trichuris conservam-se bem por semanas ou meses, enquanto os ovos de Ancilostomídeos têm sua visualização comprometida por este método. 
PROCEDIMENTO: 
Material:
-Fezes frescas ou conservadas (M.I.F.). Não devem ser liqüefeitas.
-Tela de nylon para concentrar o material e reter detritos que dificultariam a visualização dos ovos.
            -Placa perfurada que faz com que sempre a mesma quantidade de fezes seja examinada, permitindo excelente padronização de amostra suficiente de material.
 -Lamínula de celofane embebida na solução Verde malaquita e glicerina, que permite a conservação dos ovos e forma o esfregado transparente).
-Placa de Petri.
            -Lâminade  vidro.
            -Espátula.
 -Microscópio óptico e tabela para leitura dos resultados.
1. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente. 
2. Comprimir a tela metálica ou de náilon sobre as fezes, fazendo com que parte passe através das malhas. 
3. Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício do cartão, colocado sobre a lâmina. 
4. Depois de encher o orifício central, remover com cuidado o cartão, deixando as fezes com a lamínula. 
5. Cobrir as fezes com a lamínula de celofane embebida na solução verde malaquita e glierina , invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente. 
6. Deixar a preparação em repouso (clarificação) durante 30 a 40 minutos à temperatura ambiente . Examinar a preparação ao microscópio 
MÉTODOS PARA EXAME DOS PARASITOS DO SANGUE 
O exame microscópico do sangue constitui valioso recurso para o diagnóstico das doenças parasitárias cujos agentes apresentam formas evolutivas sanguíneas. A preparação de bons esfregaços sanguíneos é importante na diferenciação de parasitos, principalmente de protozoários. 
Coletar em horários que obedeçam o ciclo mais provável em que a espécie possa aparecer no sangue periférico. Geralmente ocorre entre as 22:00 as 24:00hs
COLHEITA DE SANGUE 
O sangue pode ser colhido por punção do lóbulo da orelha, da superfície palmar da ponta de um dedo da mão, no caso de lactentes da superfície plantar do grande artelho ou no calcanhar. No caso da orelha, é a margem livre do lóbulo e não a face lateral que deve ser puncionada. A picada deve ser feita com deliberação e lentamente, para não provocar dor. A picada deve ter profundidade de 3mm. Não se deve utilizar um local edemaciado ou congestionado. 
Em animais de laboratório a colheita de sangue é feita segundo o seu porte. 
EXAME A FRESCO 
Uma pequena gota de sangue, examinada entre lâmina e lamínula em médio aumento. Esta nos permite demonstrar de forma rápida microfilárias e Trypanosoma. 
EXAME SECO (PREPARAÇÃO CORADA) 
Pode ser realizado em gota espessa e/ou camada delgada ou esfregaço. 
GOTA ESPESSA 
Colher 3 a 4 gotas de sangue na lâmina, espalhar por mais ou menos 1 cm² e com a ponta de um estilete, desfibriná-la. Deixar secar ao abrigo de corrente de ar quente que podem causar esporos de fungos contaminantes, ou deixar secar em estufa a 37 C. o desfibramento impede a coagulação e consequentemente fendilhamento da preparação, garantindo a necessária aderência do sangue ao vidro durante a coloração. 
Realizar desemoglobinização antes da coloração. 
CAMADA DELGADA OU ESTIRAMENTO 
Colhida a gota de sangue na lâmina, imedatamente coloca-se a lâmina distensora na posição. Por capilaridade, o sangue espalha prontamente na zona de contato das lâminas. Num movimento rápido e contínuo, a lâmina distensora é deslocada para frente, obtendo-se assim a camada 
delgada. 
COLORAÇÃO DA CAMADA DELGADA 
MÉTODO DE GIEMSA 
FUNDAMENTOS 
Fixação do estiramento pelo metanol e coloração pela solução de Giemsa. 
MÉTODO DE LEISHMAN 
FUNDAMENTOS 
Fixação e coloração do estiramento pela solução de azul de metileno e eosina 
BIBLIOGRAFIA 
NEVES, D. P & Cols. Parasitologia humana. Ed. Atheneu, 11a ed, 2005. 
REY, L. Bases da Parasitologia Médica. Ed. Guanabara Koogan, 3a ed, 2010. 
REY, L. Parasitologia. Ed. Guanabara Koogan, 4a ed, 2008. 
CIMERMAN, B.; FRANCO, M.A. Atlas de parasitologia. São Paulo: Atheneu, 1999. 
COURA, J. R. Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Volumes I e II. Editora 
Guanabara Koogan. 2005