Técnicas do DNA Recombinante

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Universidade Federal de Pernambuco 
Centro de Ciências Biológicas 
Departamento de Bioquímica 
Aula Teórica: 
Técnicas do DNA recombinante III 
Disciplina: Biologia Molecular 
Curso: Ciências Farmacêuticas 
 
Profa. Dra. Maira Galdino da Rocha Pitta 
Plano de aula 
 As etapas gerais na identificação de 
genes implicados na susceptibilidade 
e/ou resistência a uma determinada 
doença 
 
=> As etapas gerais para a descoberta de 
novos alvos terapêuticos 
 
 
Utilidade dos estudos de biologia molecular 
 Validar / testar os mecanismos de proteção e os 
mecanismos moleculares da doença 
 
 Identificar as vias metabólicas que estão alteradas em 
indivíduos / pacientes sensíveis 
 
 Oferecer marcadores de resistência / susceptibilidade 
 
 Descobrir alvos para o desenvolvimento de novas 
abordagens terapêuticas 
 
 
 
ALVO CONHECIDO
High throughput screening (HTS)
Ensaios in vitro e/ou in vivo
Pesquisa Clínia de Fase I, II, III, IV
Estudos PD: modelos experimentais da doença
Síntese orgânica ou Química
combinatoria
Seleção de compostos candidatos
Descoberta do alvo
Síntese orgânica
e química
combinatória
Modelagem molecular
Seleção do composto protótipo
Estudos PK: modelos de animais sadios
Seleção de um fármaco em potencial
Desenvolvimento da forma farmacêutica
Estudos Pré-clínicos de segurança
ALVO DESCONHECIDO
Extração
Bioguiada de 
produtos
naturais
Produto natural
bioativo
Molécula
sintética
Etapas gerais para o desenvolvimento de 
um novo fármaco 
A BM participa de várias etapas do 
processo de desenvolvimento de 
novos fármacos 
Etapas gerais na identificação de genes implicados na susceptibilidade 
e/ou resistência a uma determinada doença 
Cultura de Células: meios 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais 
ou normais 
Sobrenadante Suspenção celular 
Extração de RNA 
Transcrição reversa 
Avaliação da 
expressão gênica 
Extração de 
Proteínas 
Quantificação, 
identificação e 
separação de 
proteínas 
Quantificação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Quantificação do 
DNA 
PCR Genotipagem 
Seleção dos SNPs a 
serem estudados 
Determinação dos 
primer 
Precipitado celular 
Quantificação e 
Separação de 
proteínas 
Etapas gerais na identificação de genes implicados na 
susceptibilidade e/ou resistência a uma determinada doença 
Cultura de Células: meios 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais 
ou normais 
Sobrenadante Suspenção celular 
Extração de RNA 
Transcrição reversa 
Avaliação da 
expressão gênica 
Extração de 
Proteínas 
Quantificação, 
identificação e 
separação de 
proteínas 
Quantificação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Quantificação do 
DNA 
PCR Genotipagem 
Seleção dos SNPs a 
serem estudados 
Determinação dos 
primer 
Precipitado celular 
Quantificação e 
Separação de 
proteínas 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
 
 
 Meio de Base – Cultura primária 
 - MEM, DMEM, GMEM 
Meio complexos 
 - RPMI, Iscoveves, L-15 
Meio sem soro 
 - CHO 
 
Tipos de soro 
 Fetal bovino, Cavalo, Irradiado e aquecido 
Aditivos 
 - Vermelho de fenol, L-glutamina 
 - Piruvato de sódio e Antibióticos 
 
 
. 
 
 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais ou normais 
Etapas gerais na identificação de genes implicados na 
susceptibilidade e/ou resistência a uma determinada doença 
Cultura de Células: meios 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais 
ou normais 
Sobrenadante Suspenção celular 
Extração de RNA 
Transcrição reversa 
Avaliação da 
expressão gênica 
Extração de 
Proteínas 
Quantificação, 
identificação e 
separação de 
proteínas 
Quantificação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Quantificação do 
DNA 
PCR Genotipagem 
Seleção dos SNPs a 
serem estudados 
Determinação dos 
primer 
Precipitado celular 
Quantificação e 
Separação de 
proteínas 
 Detergente: Lise das membranas plasmáticas e nucleares 
 
 Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes 
orgânicas 
 
 Clorofórmio: retira resíduos de fenol 
 
 Isopropanol: para precipitar o RNA 
 
Obs: A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por 
ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários 
tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.) 
 
=> DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das soluções, 
equipamentos, vidrarias e reagentes; 
 
Extração de RNA 
Extração de RNA 
Quantificação das Amostras de RNA por espectrofotômetro 
 A leitura a 260nm permite calcular a concentração de RNA: 
OD=1 equivale a aproximadamente 40µg/ml de RNA fita 
simples. A pureza do RNA pode ser avaliada pela proporção 
260/280nm que deve ser entre 1.8/2.0. Se for abaixo deste 
valor, indica contaminação do RNA com proteína e fenol. 
 
 
 Problema: 
 
Sabendo-se que colocou-se 1µl de RNA para 79µl de água e a 
absorbência a 260nm da amostra foi de 0.298, qual a 
concentração de RNA no tubo, sabendo-se que o volume deste é 
de 10µl 
 
 
Quantificação das Amostras de RNA por espectrofotômetro 
 A leitura a 260nm permite calcular a concentração de RNA: OD=1 equivale a 
aproximadamente 40µg/ml de RNA simples fita. A pureza do RNA pode ser 
avaliada pela proporção 260/280nm que deve ser entre 1.8/2.0. Se for abaixo 
deste valor, indica contaminação do RNA com proteína e fenol. 
 
 
 Problema: 
Sabendo-se que colocou-se 1µl de RNA para 79µl de água e a absorbência a 260nm da 
amostra foi de 0,298, qual a concentração de RNA no tubo, sabendo-se que o volume 
deste é de 10µl 
 
- A amostra foi diluída na proporção 1:80 (1µl de RNA para 79µl de água) x80 
- Para calcular a concentração total do RNA no tubo: Multiplicar o valor da 
absorbência a 260nm pelo fator de diluição (X80) e divida por 1000 para encontrar 
o valor em µg/µl. 
- [RNA] = 0,298 x 0,040 μg/μl x fator de diluição 
- [RNA] = 0,298 x 0,040 μg/μl x 80 
- [RNA] = 0,9536 μg/μl 
- Como o volume é de 10μl, então [RNA] = 9,536 μg 
 
 
 
 
Análise do RNA (Agarose 1% Agarose com 2.2M de Formaldeído) 
Visualização de três bandas: rRNA 28S (maior), 18S (menor) e 5S 
(mais fraca); e suaves bandas referentes ao mRNA. 
Transcrição reversa 
 Transcrição reversa: conversão do RNAm em cDNA (DNA 
complementar) 
 
 A cauda poli(A) na extremidade 3’ do RNA fornece uma 
maneira coveniente para isolar mRNA do RNA celular total, 
constituído principalmente de RNA ribossomal e tRNA que 
não têm caudas poli(A) 
 
 A fração de RNAm contendo a cauda poli(A) é de 
aproximadamente 1 a 2% do RNA celular total 
 
 
 
 
 
Transcrição reversa 
 Oligonucleotídeos curtos contendo 12 a 20 desoxitimidinas 
(oligo [dT]) são misturados com o mRNA purificado e 
hibridizados com as caudas poli(A), onde atuam como 
iniciadores da transcriptase reversa 
 
 O produto da reação e um hibrido RNA-DNA 
 
 
 
 
 
Transcrição reversa 
 O uso de oligo(dT) como um iniciador representa uma 
desvantagem, pois a transcripase reversa deve começar pela 
extremidade 3’ do RNAm, e podenão alcançar a extremidade 
5’ da molécula. Este é um problema para os RNAs muito 
longos. 
 
 Para contornar este problema utiliza-se um segundo método, 
a síntese de cDNA com iniciadores degenerados (ramdomly 
primed cDNA syntesis): fragmento de oligonucleotídeos com 6 
a 10 nucleotídeos produzidos com as mais diferentes 
sequências possíveis são usados como iniciadores da síntese 
de cDNA => A iniciação ocorre apartir de muitas posições 
 
 
 
 
Transcrição reversa 
Isolamento de RNAm poli(A) 
Etapas gerais na identificação de genes implicados na 
susceptibilidade e/ou resistência a uma determinada doença 
Cultura de Células: meios 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais 
ou normais 
Sobrenadante Suspenção celular 
Extração de RNA 
Transcrição reversa 
Avaliação da 
expressão gênica 
Extração de 
Proteínas 
Quantificação, 
identificação e 
separação de 
proteínas 
Quantificação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Quantificação do 
DNA 
PCR Genotipagem 
Seleção dos SNPs a 
serem estudados 
Determinação dos 
primer 
Precipitado celular 
Quantificação e 
Separação de 
proteínas 
Técnicas para avaliação da expressão dos genes 
A PCR inclui, além dos primers, uma sonda conjugada com 
um fluorocromo “repórter” (emite fluorescência) e uma 
molécula “quencher” (absorve a fluorescência emitida pelo 
“repórter” quando a sonda está intacta; 
PCR quantitativo em tempo real 
(RT-qPCR): 
TaqMan ou SYBR® Green 
 
Probe Intacta 
A Probe intacta se liga ao determinada sequência de pares 
de bases entre a localização dos primers 
R 
Q 
Q R 
Técnicas para avaliação da expressão dos genes 
Polymerase colida com a TaqMan Probe 
R 
R 
Q 
Q 
Taq 
Pol 
Taq 
Pol 
Técnicas para avaliação da expressão dos genes 
Clivagem da TaqMan Probe 
Q 
Q 
R 
R 
Taq 
Pol 
Taq 
Pol 
Técnicas para avaliação da expressão dos genes 
Técnicas para avaliação da expressão dos genes 
Microarranjos de DNA ou DNA microarray ou DNA-chip 
 Determina simultaneamente os níveis de expressão de milhares de genes 
(RNAm na forma de cDNA ou DNA genômico) 
 
 Consiste num arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA 
genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma 
superfície sólida, usualmente lâminas de microscópio revestidas com 
compostos que conferem carga positiva. 
 
 Os cDNA provenientes de amostras biológicas, são postas para hibridar com o 
DNA fixado no array (hibridação por complementariedade de bases). 
 
 A detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos 
cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) 
Etapas gerais na identificação de genes implicados na 
susceptibilidade e/ou resistência a uma determinada doença 
Cultura de Células: meios 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais 
ou normais 
Sobrenadante Suspenção celular 
Extração de RNA 
Transcrição reversa 
Avaliação da 
expressão gênica 
Extração de 
Proteínas 
Quantificação, 
identificação e 
separação de 
proteínas 
Quantificação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Quantificação do 
DNA 
PCR Genotipagem 
Seleção dos SNPs a 
serem estudados 
Determinação dos 
primer 
Precipitado celular 
Quantificação e 
Separação de 
proteínas 
Quantificação e identificação de 
proteínas 
 Western Blot é um método semi-quantitativo altamente 
específico, para análise de proteínas insolúveis 
 
 Etapas principais: 
- Extração de proteínas 
- Separação eletroforética em condições desnaturantes 
- Eletrotransferência das proteínas 
- Reações imunoquímicas de detecção 
Quantificação e Separação de proteínas 
no sobrenadante 
Cromatografia de troca iônica (carga) 
1) Uma mistura de proteínas 
dissovida em um pequeno 
volume de tampão é aplicada 
no topo da matriz da coluna 
2) Conforme a eluição progride, 
as proteínas separam-se em 
bandas, como resultados das 
suas diferentes afinidades com 
o trocador 
2) 
Vermelho: 
1° proteína 
isolada 
3) Aumenta-se a concentração de sal no 
eluente para eluir as proteínas 
remanescentes 
4) Diagrama de eluição das 
proteína da coluna 
Cromatografia de afinidade (ligação 
especifica) 
Cromatografia de filtração em gel (tamanho) 
Esfera de gel: 
- Linhas sólidas curvas (Mariz 
de gel): possui um espaço 
interno para solvente 
- Pontos vermelhos (moléculas 
pequenas): podem entrar 
livremente na esfera de gel 
- Circulos azuis (moléculas 
grandes): não conseguem 
penetrar nos poros da esfera 
de gel 
1) Aplicação da 
amostra no 
topo da coluna 
2) As moléculas 
pequenas podem 
penetrar no interio da 
esfera de gel, e 
consequentemente 
migram mais 
lentamente 
3) As moléculas 
grandes eluem 
primeiro e são 
coletadas como 
frações 
4) Diagrama de eluição: 
indica a completa 
separação dos dois 
componentes 
Ultra-Centrifugação (tamanho) 
A amostra é depositada sobre a 
coluna da solução com gradiente de 
densidade de sacarose pré-formado. 
Durante a centrifugação, cada 
partícula sedimenta a uma taxa que 
depende da sua massa. Após a 
centrifugação, o tubo é perfurado e as 
partículas são separadas de acordo 
com suas zonas. 
Etapas gerais na identificação de genes implicados na susceptibilidade 
e/ou resistência a uma determinada doença 
Cultura de Células: meios 
Purificação celular 
E linhagens de células tumorais 
ou normais 
Sobrenadante Suspenção celular 
Extração de RNA 
Transcrição reversa 
Avaliação da 
expressão gênica 
Extração de 
Proteínas 
Quantificação, 
identificação e 
separação de 
proteínas 
Quantificação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Quantificação do 
DNA 
PCR Genotipagem 
Seleção dos SNPs a 
serem estudados 
Determinação dos 
primer 
Precipitado celular 
Quantificação e 
Separação de 
proteínas 
Extração de DNA 
Os protocolos de extração de DNA envolvem cinco etapas 
básicas: 
 
1. Algum tipo de maceração mecânica é utilizada para romper 
as paredes (bactéria) 
 
2. As células maceradas são ressuspendidas em um tampão de 
extração, contendo: 
detergente (SDS no caso da extração que utiliza fenol), 
antioxidantes, EDTA e agente tamponante 
 
visando a solubilização de membranas lipoproteícas e 
desnaturação das proteínas; enquanto o DNA é protegido da 
ação de enzimas de degradação. 
 
Os protocolos de extração de DNA envolvem cinco etapas 
básicas: 
 
3. A suspensão é submetida a uma extração com um solvente 
orgânico, clorofórmio-álcool isoamílico. 
 
As fases orgânica e aquosa são separadas através de 
centrifugação. 
 
Nesta extração, lipídios, proteínas e a maioria dos 
polissacarídeos são separados do DNA, RNA e alguns 
polissacarídeos. 
 
Extração de DNA 
Os protocolos de extração de DNA envolvem cinco etapas 
básicas: 
 
4. Um álcool (isopropanol ou etanol) e sal (NaCl) são 
adicionados à fase aquosa. O DNA na presença de sal e álcool 
forma um precipitado frequentemente visível que pode ser 
“pescado” ou “peletizado” por centrifugação. Após lavagens do 
precipitado com álcool 
 
5. O precipitado de DNA é resuspendido em um tampão Tris-
EDTA contendo DNase para degradar o DNA, restando apenas o 
DNA genômico desejado 
Extração de DNA 
Extração de DNA 
Ação das DNAses 
 Para manter o pH em um valor que impeça a 
ação das nucleases que degradam o DNA, 
utiliza-se um tampão específico (Tris-Cl) para 
manter o pH em torno de 8,0 
 
 Adição de EDTA inibe a ação das DNAses, pois 
esse composto é um quelante de cátions 
bivalentes, como Ma+2 e o Ca+2, que são 
cofatores das enzimas.Após finalizar os procedimentos de extração de ácidos 
nucléicos deve-se verificar a quantidade de DNA 
obtida. 
 
A quantidade de DNA pode ser determinada por dois 
métodos: 
 
- Espectrofotometria 
- Gel de agarose: leitura da intensidade de 
fluorescência do brometo de etídio. 
 A agarose é um polissacarídeo e forma uma rede que prende as 
moléculas durante a migração. 
Quantificação do DNA: gel de agarose 
Agarose 
Quantificação do DNA: gel de agarose 
 Preparação do gel de agarose: 
 
 
 Para preparar um gel de agarose, faz-se a mistura entre o pó de agarose 
e a solução Tampão TBE 
 
 Tampão TBE ou Tris/Borato/EDTA, é uma solução tampão contendo uma 
mistura de base T (Tris), ácido Bórico e EDTA. 
2-Amino-2-hydroxymethyl-
propane-1,3-diol (TRIS) 
ácido Bórico Ethylene diamine tetracetic acid 
(EDTA) 
Quantificação do DNA: gel de agarose 
 Os géis de agarose são dissolvidos 
na presença de tampão apropriado 
até se obter uma solução clara e 
transparente. Após a sua fusão em 
alta temperatura (ou em forno 
microondas) a solução ainda 
quente (500oC) é colocada em um 
suporte ou molde em geral, de 
acrílico. 
 
 Após ocorrer a solidificação da 
matriz, cuja densidade é 
determinada pela concentração da 
agarose, as amostras podem ser 
aplicadas. 
Quantificação do DNA: gel de agarose 
 Quando o campo elétrico é aplicado através do gel, o DNA, que 
é carregado negativamente em um pH neutro, migra para o 
ânodo. 
 
 A taxa de migração é determinada por uma série de parâmetros 
dentre os quais podem ser citados: 
 Concentração da agarose 
 Peso molecular do DNA 
 Conformação do DNA 
 Voltagem aplicada (para uma máxima resolução, a 
voltagem não deve ser maior que 5 V/cm – a medida em 
cm é a distância entre os eletrodos da cuba de 
eletroforese), 
 Direção do campo elétrico 
 Composição do tampão 
 Presença de agentes intercalantes 
 etc... 
Quantificação do DNA: gel de agarose 
 O brometo de etídio é um corante que se intercala 
nas moléculas dos ácidos nucléicos sendo que a luz 
ultravioleta induz sua fluorescência. 
 
 A quantidade observada sob UV é proporcional à 
massa total de DNA da amostra colocada no poço da 
eletroforese. Para quantificá-la, faz-se a foto em 
câmara polaróide ou digital e compara-se a 
fluorescência da amostra àquela de um padrão 
conhecido 
Eletroforese em gel de agarose, onde as diferentes amostras de DNA de 
leveduras evidenciam a presença e integridade do DNA, juntamente com 
os marcadores de peso molecular (primeira e ultima coluna) 
Quantificação do DNA: gel de agarose 
ESPECTRO DE ABSORÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS DEFINE-SE 
NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA - (λ de absorção máxima a 260 
nm, dependendo das bases que entram na sua constituição) 
 
Quantificação do DNA: Espectrofotometria 
 
 Colocada em cuba de quartzo e submetida a leitura da 
densidade óptica a 260 nm (DO260), para avaliar a 
quantidade de DNA, e a 280 nm (DO280) para estimar a 
contaminação com proteínas 
 
 O quociente entre DO260/DO280 deve situar-se entre 1,5 e 
2, para se considerar que estamos perante uma amostra de 
DNA com pureza adequada para análise posterior. 
 
 Um valor inferior sugere contaminação com proteínas e um 
valor superior indica contaminação RNA. 
 
 
 
A concentração de DNA total foi estimada, de acordo com a Equação : 
 
 
 
 
Sabendo-se: uma unidade de DO corresponde à concentração de 0,050 μg/μl de DNA 
de dupla cadeia (dsDNA) 
 
Quantificação do DNA: Espectrofotometria 
 
[DNA] (μg/μl) = DO260 x 0,05 x factor diluição 
50µg/ml 
40µg/ml 
 
Quantificação do DNA: Espectrofotometria 
 
Problema: 
 
A260 = 1,097 
Grau de Pureza = 1,788 
Qual a concentração de DNA na amostra, sabendo-se que 
colocou-se 147µl de H2O MiliQ + 3 µl do DNA extraído na 
solução a ser quantificada e que o tubo estoque tem 30 µl 
 
 
Quantificação do DNA: Espectrofotometria 
 
Problema: 
 
A260 = 1,097 
Grau de Pureza = 1,788 
Qual a concentração de DNA na amostra, sabendo-se que colocou-se 147µl de 
H2O MiliQ + 3 µl do DNA extraído na solução a ser quantificada e que o tubo 
estoque tem 30 µl 
 
Fator de diluição: 50 
 
 
Sabe-se: uma unidade de DO corresponde à concentração de 0,050 μg/μl de DNA de 
dupla cadeia (dsDNA) 
 
Então: [DNA] = 1,097 x 0,050 μg/μl x fator de diluição 
 
[DNA] = 2,7425 μg/μl x volume da solução 30μl 
 
Então a quantidade de DNA total é de 82,275μg 
Seleção dos SNPs a serem estudados 
Seleção dos polimorfismos: 
 
 Frequencia do Alelo Menor (MAF) maior que 0,1 na 
população europeana CEU 
 Tag SNP do grupo de correlação r²˃0,8 
 SNPs presentes na região promotora e nos exons 
 
Seleção dos SNPs a serem estudados 
Negrito – Tag SNP 
Negrito – Tag 
SNP 
Seleção do primer 
Seleção do primer 
 
 Reação da Polimerase em Cadeia 
 Técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática 
in vitro de milhões de cópias de um segmento 
específico de DNA na presença da enzima DNA 
polimerase 
 
 Outubro de 1985 (idéia em 1983) 
 American Society of Human Genetics 
 criado por Kary B. Mullis 
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/ 
PCR 
Características do PCR 
 
 Amplificação de Seqüências 
 
 A reação de PCR se baseia no anelamento e extensão enzimática de um 
par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) 
utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a sequência de DNA 
de fita dupla alvo da amplificação. 
 
 Estes primers são sintetizados artificialmente de maneira que suas 
sequências de nucleotídeos sejam complementares às sequências 
específicas que flanqueiam a região alvo 
 
 Processo Cíclico 
 15 a 40 ciclos 
 realizado por mudança de temperatura 
PCR 
 Produção de 2 a 4 mg DNA em 1-3 hs 
 específico = amplifica sequência-alvo na presença de 
DNA genômico 
 sensível = detecta até apenas 1 sequência de molde 
 flexível = muitas variações da técnica básica de PCR 
 
=> Torna a técnica poderosa para estudos genéticos-
moleculales envolvendo grande número de indivíduos 
PCR 
Requerimentos Básicos da PCR: 
 
1. Molde - DNA ou RNA 
2. DNA polimerase 
3. dNTPs 
4. Iniciadores de Oligonucleotídeos 
(Primers) 
PCR 
Função dos Iniciadores Primers: 
 
 fornecer grupo 3’ OH para iniciação de síntese de 
DNA 
 definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser 
amplificado 
 estabelecer especificidade 
PCR 
PCR 
Oligos Iniciadores Primers 
 sintetizados quimicamente 
 tipicamente entre 15 a 25 bases 
 define limites de alvo a amplificar 
PCR 
Ciclos de Temperatura na PCR 
 
 Anelamento 
 do Primer 
 Tm 
 
Desnaturação Extensão 
 ~94oC do Primer 
 ~72oC 
PCR 
Desnaturação do DNA 
94 a 100°C 
 
 desnaturar DNA alvo 
 desnaturar produtos de ciclos prévios 
 4 a 10 min de desnaturação inicial 
 duração de 30 s a 1 min 
 
PCR 
Anelamento do Primer 
40 a 70°C 
 temperatura de “hibridização” 
 otimização da temperatura para cada par de 
primer 
 tipicamente 30 s a 2 min 
PCR 
Extensão do Primer 
72°C 
 
 Taq polimerase 
 faixa de atividade: 20oC a 85oC 
 
 Tempo de extensão varia de acordo com 
tamanho do produto desejado 
 
PCR 
Exponencialidade do PCR 
Caso ideal: 
 
N = No 2
n 
 
• N = número de moléculas amplificadas 
• No = número inicial de moléculas 
• n = número de ciclos de amplificação 
PCR 
Amplificação Geométrica 
 Ciclo Número Fita Duplas produzidas 
 1 0 
 58 
 10 256 
 15 8.192 
 20 262.144 
 25 8.388.608 
 30 268.435.456 
 35 8.589.934.589 
 40 274.877.906.800 
PCR 
Cinética do PCR 
Cinética da PCR: 
 
 Fase inicial (screening) 
– Primers procuram o DNA molde com sequências 
complementares (como sondas) 
– Primers em considerável excesso. 
 
 Fase exponencial 
– acúmulo exponencial do fragmento de DNA 
– várias cópias das sequências alvos 
 
 Fase tardia ou plateau 
– amplificação já é sub-ótima 
PCR 
PCR 
PCR 
Componentes da reação de PCR: 
 
- Água 
- Tampão 
- dNTP 
- Primers 
- Mg++: cofator da Taq polimerase 
- Taq polimerase 
- DNA molde 
Genotipagem 
 Feita a PCR eu vou ter milhões de cópias da minha sequência 
de estudo no meu tubo de ensaio 
 
 Deve-se então selecionar a enzima de restrição 
 
 O que é uma enzima de restrição??? 
Enzimas de Restrição 
 Enzima de restrição: são proteases que cortam em sítios 
específicos diferentes, fragmentos menores de diversos 
tamanhos (peptídeos) podem ser obtidos e suas sequências 
determinadas 
 
 A primeira nuclease de restrição que clivou um sítio específico 
do DNA foi descoberta em 1970 por Hamilton Smish 
 
 As enzimas de restrição que cortam sequências específicas 
têm sido isoladas de centenas de cepas bacterianas, e mais de 
150 sítios diferentes de clivagem específica foram 
identificadas 
 
 As enzima de restrição reconhecem 
sequências específicas de 4 a 8 pares 
de base (bp) 
 
 Um determinado sítio de quatro pb 
ocorre em média a cada 256pb, de 
modo que uma enzima cortando a 
sequência de quatro bases produzirá 
muito mais fragmentos pequenos de 
DNA do que uma enzima cortando uma 
sequência de oito pb, que ocorrerá em 
média a cada 65.536pb 
Enzimas de Restrição 
Enzimas de Restrição 
Enzimas de Restrição 
Algumas enzimas de restrição e suas sequências de clivagem 
Enzimas de Restrição 
Sequência 
CCTGGGGGCTATAAAAGCAGCAGCTTCTACCTTCCCCGTCACAAGCAGAATCTTCAGAACAGGTA
AGCGTTTCGGCAAACTTGGTA/GCAATTGGTTAGTTTGATGAAATACTTCTTGACTAATTTTGTTCC
TTCACGTTGTCTTCGACCAGGTTCTCCTTCCCCAGTCACCAGTTGCTCGAGTTAGAATTGTCTGCA
ATGGCC. N = 180 bases 
 
Polimorfismo: A/G 
 
Enzima: RsaI (A) 
Enzimas de Restrição 
N = 85 bases N = 117 bases 
A 
Enzimas de Restrição 
Observações: 
 
 No exemplo citado a sequência selecionada possui o polimorfismo A/G. 
 
 A enzima selecionada vai cortar a seqüência na base A. 
 
 Assim, na corrida eletroforética quando aparecer duas bandas com os pesos 
moleculares conhecidos significa que o individuo é homozigoto (possui os dois 
alelos AA). 
 
 Se a seqüência não possui a base A, a enzima não vai exercer sua função e irá 
aparecer um fragmento único GG, indicando um individuo homozigoto GG. 
 
 Aparecendo dois fragmentos A e G no gel significa que o individuo é 
heterozigoto, possuindo as duas bases. 
Enzimas de Restrição 
- Consiste em diferenças herdadas nos tamanhos dos 
fragmentos de DNA quando ele é digerido com uma 
endonuclease de restrição 
RFLP 
Análise de Fragmentos de Restrição de Tamanho 
Polimórficos de DNA 
Genotipagem 
 Gel de agarose: separar fragmentos grandes de DNA 
(≈500 pb a ≈20 kb) 
 
 Gel de poliacrilamida: separar fragmentos pequenos de 
DNA (1 nucleótido a ≈2 kb). 
 
 
Genotipagem 
Acrilamida: 
Genotipagem 
- É um método derivado da eletroforese convencional do 
DNA, em gel de agarose, sendo a principal diferença a 
mudança repetida da orientação do campo elétrico 
 
 
- Esta mudança provoca o re-arranjo da estrutura 
conformacional da molécula, permitindo a sua migração 
pelo gel 
 
 
PFGE: Eletroforese em Gel de Campo Pulsado 
Método de TaqMan 
 
Marcadores utilizados: 
Ex: Alelo A (CYP*2) - Reporter Dye: VIC 
 Alelo B (CYP*2) - Reporter Dye: FAM 
Genotipagem: Taq Man 
A PCR inclui, além dos primers, uma sonda conjugada com 
um fluorocromo “repórter” (emite fluorescência) e uma 
molécula “quencher” (absorve a fluorescência emitida pelo 
“repórter” quando a sonda está intacta); 
Genotipagem: Taq Man 
Genotipagem: Taq Man 
Genotipagem: Taq Man 
HAPLÓTIPOS rs168 rs42 rs107 
1 GG CT AA 
2 GG CT AG 
3 GG CT AA 
4 GG CT ND 
6 GG CT ND 
7 ND CC AA 
% DISTRIBUIÇÃO GENÓTIPOS n=42 
rs168 GG (15/35,71%) GT (1/2,38%) TT (3/7,14%) 
rs42 CC (8/19,04%) CT 
(16/38,09%) 
TT (9/21,42%) 
rs107 AA (17/40,47%) AG 
(8/19,04%) 
GG (4/9,52%) 
Como determinar a interação em o 
DNA e a proteína ? 
 
Determinando se o meu polimorfismo 
encontrado é funcional 
EMSA ou electrophoretic mobility shift assay 
ou Retração em gel 
 Técnica que permite detectar a interação entre a proteína e o DNA ou RNA 
 
 Permitindo determinar se o meu polimorfismo encontrado é funcional 
 
 Os fragmentos de DNA de cadeia dupla que se ligam fortemente à proteína 
reguladora do gene são separados dos fragmentos de DNA que não se ligam 
por retardação em gel. 
 
Então: 
 Realiza-se uma migração por eletroforese do fragmanento de DNA 
 
 Em uma outra coluna do gel faz-se migrar o mesmo fragmento, só que 
anteriormente o mesmo foi colocado em contato com uma proteína 
susceptível a se fixar no fragmento 
 
 Se a proteína se fixar de forma eficiente no fragmento, a migração deste será 
mais lenta 
DNA + FT 
DNA livre 
alelo 1 
alelo 2 
DNA + FT + Ac anti-FT 
alelo 1 
alelo 2 
Extrato nuclear 
(com FTs) 
DNA livre DNA livre 
alelo 2 alelo 2 
alelo 2 
alelo 2 
Ac anti-FT 
Compétition 
(sondas não-biotiniladas) 
Supershift 
(Ac anti-FT) 
DNA + FT 
Nada Extrato nuclear 
+ 
competidor 
Ac anti-FT 
alelo 1 
EMSA ou electrophoretic mobility shift assay ou Retração em gel 
Sequenciamento do DNA 
 Utilização ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente 
durante a eletroforese 
 
Bibliotecas de DNA genômico e 
bibliotecas de cDNA 
 
DE DNA 
Duvidas ???