Manipulação in vitro de Ácidos Nucléicos

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BQI 631 – Engenharia Genética de Plantas
Módulo I:
Manipulação in vitro de Ácidos Nucléicos
Humberto Ramos
CONCEITOS:
- Tecnologia do DNA Recombinante: inserção e modificação de 
genes para produzir proteinas ou produtos (vetores) 
desejáveis;
- Clonagem Gênica: isolar genes de um organimos, manipular 
in vitro e o DNA purificado e transferir para um organismo 
hospedeiro: E. Coli (CLONE);
- Engenharia Genética: manipulação de genes ou DNA inserto em 
células de interesse: alteração do informação genética!
- Organismos Transgênicos: Possuem genes ou DNA adquiridos
de outros organismos de modo artificial.
- Biologia Molecular: Estudo da interação entre as macromoléculas 
na determinação da lógica de um sistema biológico.
Molecular biology chiefly concerns itself with understanding the interactions between the various 
systems of a cell, including the interactions between DNA, RNA and protein biosynthesis as well
as learning how these interactions are regulated.
http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_(biology)
http://en.wikipedia.org/wiki/DNA
http://en.wikipedia.org/wiki/RNA
http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_biosynthesis
• Obter proteínas purificadas:
– Insulina
– Fatores de Crescimento
– Interferon
• Gerar mais cópias de um gene em particular
“amplificar” ou alterar expressão
• Pesquisar a Regulação e Função Gênica
Importancia da Engenharia Genética
– Isolar o DNA (cDNA) em tubo de ensaio,
– Cortar o DNA em fragmentos de tamanhos 
manipuláveis,
– Amplificar os fragmentos para estocagem e 
análises subsequentes,
– Isolar e identificar sequencias específicas (Clonagem),
– Caracterizar a sequencia e alterar segmentos de DNA. 
Tecnologia do DNA 
Recombinante
Etapas da Engenharia Genética
Clonagem Gênica
Resultado ou Aplicação da Engenharia Genética
Engenharia Genética: Quais são as ferramentas 
necessária?
Clonagem Gênica
ENZIMAS!
Dogma Central 
Replication
Transcription
Translation
mRNA
non-coding RNA (rRNA, tRNA, siRNA, etc.)
Gene de Interesse: Na forma de DNA ou RNA?
Extração e Purificação de Ácidos Nucléicos
Bactérias: DNA cromossômico, Plasmidial e Viral
Plantas: DNA cromossômico, mitocondrial e platídico.
 DNA Genômico (Total) ou Plasmidial
Bactérias: DNA cromossômico, Plasmidial e Viral
Extração e Purificação de Ácidos Nucléicos
Métodos de Extração e Purificação
Objetivos e Finalidade: grau de pureza!
Tipos de moléculas de interesse: DNA ou RNA; Genômico ou Plasmdial!
Tolerância a presença de outras macromoléculas e sais contaminantes!
 Qualidade X Quantidade!
Métodos de Extração e Purificação
ETAPAS:
- Rompimento do envoltório celular (parede e/ou membrana);
- Inativação de enzimas que degradam DNA e RNA;
- Separação dos Ácidos Nucléicos de outros componentes celulares:
- Métodos baseados em Precipitação/Extração
- Métodos baseados em Adsorção Cromatográfica
 Centrifugação para concentração de material inicial
Preparo do Extrato Celular
Refrigerada ou não!
 Rompimento do Envoltório bacteriano:
- Mecânico ou quimico;
- Lisozima?
- EDTA: Quelar cátions e estabilidade da membrana (inibe proteases);
- SDS: solubilização de lipídeos de membrana.
Centrifugação para remoção do restos celulares (Ácidos nucléicos em 
suspensão: EXTRATO)
Preparo do Extrato Celular
Purificação do Extrato Celular
15
 Remoção dos Contaminantes
Purificação do Extrato Celular
16
Remoção dos Contaminantes
- Proteínas:
- Extração e precipitação com Fenol/Clorofórmio:
Várias extrações repetidas
- Eficiência aumenta com o uso de protease:
Proteínase K ou Pronase! 
Pequenos RNAs: clivagem
com RNAse!
Procedimento Típico
1 Lise Celular
– 0.5% SDS + proteinase 
K (55o várias horas).
2 Extração com Fenol
– Agitar lentamente!
3 Precipitar com Etanol 
4 RNAse e proteinase K
5 Repetir Extração Fenol e 
precipitação com Etanol!
Precipitação EtOH
• 2-2.5 volumes EtOH, -20oC
• Alta concentração de sal e pH 5-5.5
• Centrifugação ou bastão!
17
Purificação do Extrato Celular
After
Purificação do Extrato Celular
Duas Forças Iônicas:
1 – Eluir Proteínas e RNA
2 – Eluir DNA purificado!
Beads de Troca iônica:
Purificação: Interação Hidrofílica
Solid Phase Isolation:
► More rapid and effective
► Use solid matrix to bind the DNA.
► Wash away contaminants.
► Elute DNA from column
► Figure 4.3
Concetração do Extrato Purificado
 Precipitação:
- Etanol 2-2,5 volumes (-20 o C)
- Isopropanol 0,7 volumes
Quantificação
A260 de 1.0 corresponde a 50 ug de DNA dupla fita por mL!
- Relação 260 e 280 nm (A260/A280) maior que 1.8. 
- Menor que 1.8 pode ser uma indicação que a preparação está contaminada, com
Proteinas ou fenol.
[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)
[ssDNA] ≈ A260 x (33 µg/mL)
[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)
Qualidade
-Correr uma amostra em gel agarose.
-Verificar a extenção da quebra do DNA.
-Preparações de boa qualidade: Migração do 
DNA como uma banda de alto peso 
molecular, com pouca e nenhum arraste!
genomic
DNA
RNA
(degraded)
Checando a degradação do DNA
Métodos de Extração e Purificação
Outros Organismo (Não bacteriano)
- Etapas e procedimentos básicos
- Modificações em função de particularidades de
cada material biológico.
- Material Vegetal: uso de enzimas para degradação
de parede? Normalmente maceração em Nitrogênio
Líquido
- Presença de outros contaminantes não-protéicos:
ex: planta: carbohidratos e fenólicos não removidos
por fenol.
- CTAB (cetyltrimethylammonium bromide ): detergente
complexa com o DNA e facilita precipitação DNA!
- Uso de cromatografia de troca iônica: Kits!
Células das plantas contém três fontes de DNA : nuclear, 
plastídico e mitocondrial. 
Extração e Purificação de Ácidos Nucléicos
Métodos de Extração e Purificação
CTAB buffer 100ml
-2.0 g CTAB (Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide)
-10.0 ml 1 M Tris pH 8.0
-4.0 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 (EthylenediaminetetraAcetic 
acid Di-sodium salt)
-28.0 ml 5 M NaCl
-40.0 ml H2O
-1 g PVP 40 (polyvinyl pyrrolidone (vinylpyrrolidine 
homopolymer) Mw 40,000) ou PVPP?
-Adjust all to pH 5.0 with HCL and make up to 100 ml 
with H2O.
Métodos de 
Extração e 
Purificação
Purificação com guanidinium 
thiocyanate e silica:
(a) Na presença de guanidinium 
thiocyanate, DNA liga-se fortemente a 
silica. Outras moléculas são 
dissolvidas ou precipitadas!
(b) DNA pode ser purificado utilizando uma 
coluna (cartucho).
- Outros contaminates são precipitados e 
removidos na presença do Guanidinium
thiocyanate.
- Alto [sal]: adsorção a sílica!
Plant Genomic DNA Extraction using 
Qiagen plant mini kit
Purificação de DNA Plasmidial
Vetores plasmidiais mantidos em
E. coli
Preparo: muitas vezes sem
contaminação com DNA
cromossômico.
Métodos: 
- Separação por diferenças de tamanho
- Separação por diferenças de conformação
Purificação de DNA 
Plasmidial
Lise sem movimentos bruscos!
DNA cromossômico em pedaços 
de elevado MW!
Centrifugação elimnina DNA não 
plasmidial.
Ainda alguma contaminação: 
separar por conformação!
Purificação de DNA 
Plasmidial
Separação eficiente entre DNA 
super-enovelado e relaxado!
a) Desnaturação Alcalina:
- pH onde DNA relaxado é desnaturado
e Super-enovelado não!
NaOH pH 12,0 - 12,5: quebra das pontes de hidrogênio e 
separação da fita dupla.
Purificação de DNA 
Plasmidial
Separação eficiente por 
Densidade: Gradiente de Cloreto 
de Césio (CsCl)
- Diferencas de densidade entre 
DNA, RNA e Proteínas:
Purificação de DNA Plasmidial
Separação eficiente por Densidade: Gradiente 
de Cloreto de Césio (CsCl) na presença de 
Brometo de Etídio!
- Diferenças de densidade entre DNA linear, 
Super-enovelado, RNA e Proteínas:
Enzimas Para Manipular DNA e RNA
1 – Nuclease: Enzimas que cortam, reduzem o tamanho ou
degradam ácidos nucléicos.
2 – Ligase: enzimas que promovem ligações covalentes entre 
moleculas de ácidos nucléicos.
3 – Polimerases: Enzimas que adicionam nucleotídeos ou 
compiammoléculas molde.
4 – Enzimas modificadora: adicionam grupos químicos.
OBS: a) muitas enzimas possuem mais de uma atividade.
b) atividades podem ser observadas para DNA ou RNA!
Nucleases: quebra da ligação fosfodiester
A) Exonuclease: remove nucleotídeos
(um por vez) do terminal
B) Endonucleases: quebra da ligação 
interna. 
Exonucleases
A) Agem em ambas fitas de um DNA dupla fita: Bal31
B) Agem somente em uma fita: Exonuclease III remove nucleotídeos
somente do terminal 3’ OH 
Endonucleases
A) S1 Nuclease: cliva fita 
simples ou fita simples de 
DNA DS.
B) DNase I: cliva ambas fitas
simples e dupla e gera 
fragmentos pequenos.
C) Endonuclease de Restrição:
Cliva DNA dupla fita.
Engenharia Genética: Quais são as ferramentas 
necessária?
Clonagem Gênica
ENZIMAS!
Endonucleases de Restrição
A) Necessidades de Cortes 
precisos e reprodutíveis
B) Manipular o gene a partir
do menor fragmento 
possível (2-3 kb) 
Nobel 1978: Descoberta das Endonucleases 
de Restrição como ferramenta fundamental
na Tecnologia do DNA Recombinante!
Endonucleases de Restrição
 Estirpes bacterianas imune
a bacteriófagos: “restrição
controlada pelo hospedeiro” 
Endonucleases que degradam
DNA “estranho” ou “invasor”
2500 diferentes tipos e mais
de 300 enzimas são disponívels
para uso em laboratório!
Sistema de Restrição
 Bactérias desenvolveram sistema de defesa de dois 
componentes para defender contra DNA Invasor:
Componente 1: Enzimas que ligam-se e clivam o DNA em
sítios específicos
Sistema de Modificação
Componente II: 
- Garantir que somente DNA invasor seja
degradado 
- Modificar quimicamentes os sitios no DNA
que podem ser atacados por enzimas de
restrição.
Endonucleases de Restrição
 Tipo I:
- Sítio de reconhecimento Específico, porém clivagem aleatória
- Eco B e Eco K
 Tipo II:
- Reconhece e Cliva DNA em Sítios Específicos!
- Comumente usada em tecnologia do DNA Recombinante
- Clivagens: pontas cegas e coesivas.
- Variação do tamanho e da sequencia de reconhecimento
4 pb, 6pb, 8 pb e etc. 
( 1970) Hamilton Smith e colaboradores: Enzima de restrição de
Haemophilus influenzae strain Rd clivando em sequência específica:
HindII.
 Reconhece sequência com 6 pb DS DNA de 5‟ G–T–pirimidina–
purina–A–C 3‟:
Endonucleases de Restrição Tipo II
Sistema de Modificação e Restrição II
Figure 2.2. The structure of the HhaI 
methylase bound to DNA.
- Sequencias Palindrômicas: 
- Pode ter degenerado: 
Sistema de Modificação e Restrição II
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Palindrome_of_DNA_structure.PNG
 NOMENCLATURA DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO:
- primeira letra: nome do gênero do organismo de origem.
- Segunda e terceira letra: nomes de espécies.
- Quarta letra: indica a estirpe.
- Números: ordem de descobrimento.
ex: EcoR I
- E = genero Escherichia
- co = coli
- R = estirpe RY3
- I = primeira a ser isolada
Endonucleases de Restrição
Endonucleases de Restrição: fragmentos
5‟ coesivo
3‟ coesivo
“cego”
Endonucleases de Restrição: fragmentos
(e.g., GATC) should occur once every 44 = 
256 nucleotides
Endonucleases de Restrição: fragmentos
Restriction Site Sequence:
...GAGCTC...
...CTCGAG...
Restriction Site Sequence After Cut:
...GAGCT C...
...C TCGAG...
Sac I
Sst I
Restriction Site Sequence:
...GAGCTC...
...CTCGAG...
BamHI
GGATCC
CCTAGG
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
BglII
AGATCT
TCTAGA
Endonucleases de Restrição: Terminais 
compatíveis
For example, these two "sticky" ends are compatible:
5'-ATCTGACT + GATGCGTATGCT-3„
3„-TAGACTGACTACG CATACGA-5' 
They can form complementary base pairs in the overhang region:
Endonucleases de Restrição: Atividade “star”
- “Star Activity”: clivagem em sites 
randômicos.
- EcoRI ou Kpn I
- Condições:
- pH > 8,0
- baixa força iônica (esquceu o tampão)
- glicerol > 5% (estoque: 50%)
- alta concentração da Enzima: > 100 u/ug DNA)
- Presença de Solventes orgânicos
(Etanol, DMSO) 
Atividade de Restrição Contaminante
Ensaios de Clivagem com Endonucleases de Restrição
1 unidade de Bgl II: quantidade para clivar 1 ug de  DNA em 1 hora a 37 oC
Bgl I: 4 unid/uL
Enzyme top
Supplied 
NEBuffer
B1 B2 B3 B4 EcoRI Heat
Inac.
Incu.
Temp.
Dilu-
ent
BaeGI NEBuffer 1 100 75 10 50 100 65 37 A
BaeI NEBuffer 4
+ BSA + 
SAM
50 100 50 100 40 65 25 A
BamHI NEBuffer 3
+ BSA
75 100 100 dd 100 100 No 37 A
BamHI-
HF™
NEBuffer 4 100 50 10 100 25 No 37 A
BanI NEBuffer 4
+ BSA
50 100 50 100 25 65 37 A
BanII NEBuffer 4 100 10 50 100 100 80 37 A
BbsI NEBuffer 2 100 100 25 75 50 65 37 B
BbvCI NEBuffer 4 50 100 10 100 100 80 37 A
BbvI NEBuffer 2 100 100 25 75 100 65 37 B
BccI NEBuffer 1
+ BSA
100 50 10 50 15 65 37 A
BceAI NEBuffer 3
+ BSA
100 100 100 100 100 65 37 A
BcgI NEBuffer 3
+ SAM
NR NR 100 dd NR 50 65 37 A
BciVI NEBuffer 4 100 50 0 100 25 65 37 C
BclI NEBuffer 3 50 100 100 dd 75 100 No 50 A
BfaI NEBuffer 4 75 50 10 100 0 80 37 B
BfuAI NEBuffer 3 0 75 100 10 100 65 50 B
BfuCI NEBuffer 4
+ BSA
100 50 25 100 15 80 37 B
BglI NEBuffer 3 50 75 100 50 100 65 37 B
BglII NEBuffer 3 10 75 100 10 100 No 37 A
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0708.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB7001.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0613.asp
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http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0539.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB7002.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0601.asp
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http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0143.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB7003.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0144.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB7003.asp
Ensaios de Clivagem com Endonucleases de Restrição
EcoRI NEBuffer 
EcoRI dd
100 100 100 100 100 65 37 C
HindIII NEBuffer 2 50 100 10 50 25 65 37 B
B2
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0101.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB0101.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB0101.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0104.asp
http://www.neb.com/nebecomm/products/productB7002.asp
Ensaios de Digestão Dupla
Clivagem sequencial: Corrigir a força iônica da solução.
Cliva com a Hind III, ajusta e acrescenta a BamHI!
Análises da Clivagem com Endonucleasesde Restrição
Acima de 5 ng
Mapas de Restrição: Escolha das Enzimas
Mapas de 
Restrição
- Not I 48 = 65,536 bp.
Análises de fragmentos acima de 20 Kb 
 Campo Pulsado permite um continuo rearranjo 
da direção de migração permitindo uma maior
resolução.
- PFGE: “Pulsed Field Gel Electrophoresis”
Sistema de Modificação e Restrição 
 Metilação pode impedir clivagem!
Conhecer o fenótipo da Estirpe
de E. Coli!
Mbo I: não corta DNA metilado por
Dam metilase. Bsp1431 é um 
isosquisómero insensível!
 Dam: N6 Adenina (GATC)
Dcm: C5 citosina interna CCAGG
ou CCTGG 
- E. Coli Rec A –: é dam +

Ligação entre Fragmentos de Restrição 
DNA Ligase
-Tampão com ATP: 10 X ou 4X.
- diluição para ATP 0,25 a1,0 mM.
- 0,01 u (coesivo) e 1 u (cegas)
- T4 DNA Ligase em alta 
concentração!
Ligação entre Fragmentos de Restrição 
Ligação entre Fragmentos de Restrição 
-Ligase: tanto pontas cegas 
quanto coesivas.
- Vetor clivado com enzimas 
compatíveis (normalmente).
- Clivagem dupla: evitar ligação 
entre moléculas idênticas.
- Direcionamento da inserção!
Temperatura ótima: compromisso entre 
boas condições de anelamento e atividade 
enzimática!
 Temperatura ótima da Enzima: 37oC.
Temperatura de incubação: 16 oC.
Terminais cegos: usar altas 
concentrações de Enzimas e DNA e 37oC!
Fornecedores: T4 DNA Ligase diluída ou 
concentrada!
Tempo de incubação??
- 16 horas (Overnight)
Condições de Ligação entre Fragmentos de Restrição 
1X T4 DNA Ligase 
Reaction Buffer:
50 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
1 mM ATP
10 mM Dithiothreitol
pH 7.5
Procedure 10μL Ligation Mix:
•1.0 μL 10X T4 ligase buffer 
•6:1 molar ratio of insert to vector (~ 0.5 a 1ug de vector) 
•Add (8.5 - vector and insert volume) μl ddH2O 
•0.5 μL T4 Ligase 
Cálculo da quantidade de Inserto:
Relação inserto: Vetor - Eficiência de Ligação e transformação.
“Relações molares podem variar de 1:1 até 10:1”. 
Method
1.Add appropriate amount of deionized H2O to sterile 0.6 mL tube 
2.Add 1 μL ligation buffer to the tube. 
Vortex buffer before pipetting to ensure that it is well-mixed. 
Remember that the buffer contains ATP so repeated freeze, thaw cycles can 
degrade the ATP thereby decreasing the efficiency of ligation. 
3.Add appropriate amount of insert to the tube. 
4.Add appropriate amount of vector to the tube. 
5.Add 0.5 μL ligase. 
Vortex ligase before pipetting to ensure that it is well-mixed. 
Also, the ligase, like most enzymes, is in some percentage of glycerol which 
tends to stick to the sides of your tip. To ensure you add only 0.5 μL, just 
touch your tip to the surface of the liquid when pipetting. 
6.Let the 10 μL solution sit at 22.5°C for 30 mins 
7.Denature the ligase at 65°C for 10min 
8.Dialyze for 20 minutes if electroporating 
9.Use disks shiny side up 
10.Store at -20°C 
Estratégias de Clonagem para Fragmentos de Restrição 
Uso de “Linkers”:
- Inserção de sítios de clivagem.
- Produzidos em grandes 
quantidades!
-Problemas: multiplas ligações 
entre os linkers.
- Clivagem irá retirar excesso de
linkers!
Estratégias de Clonagem para Fragmentos de Restrição 
Uso de Adaptadores: não auto-polimerização
- sintetizado com um terminal coesivo 5’OH com 
um sítio (BamHI) e um Cego fosforilado.
- Adptador pode ligar no inserto!
- Adaptor + inserto é agora fosforilado 
(polinucleotídeo quinase) e ligado ao vetor!
DNA Polimerases 
Enzimas Modificadoras do DNA
Geração de Terminais Coesivos
Geração Cauda poli-A ou poli-T
- Geração de 3’OH terminal: PstI
exonuclease .
- Terminal transferase + dATP 
ou dTTP! ligado ao vetor!
Estratégias de Clonagem: Desfosforilação
Desfosforilação:
- Tratamento do DNA do vetor com 
fosfatase Alcalina: remoção do fosfato 
5’P.
- Permite a ligação somente com o 
DNA inserto!
- Reduz o números de clones para 
analisar!
- Pontos de quebra são reparadas in 
vivo!
- CIAP (Calf Intestinal): termo-tolerante
- SAP (Shrimp): Termo- sensível!
Estratégias de Clonagem: Mutagênese por Deleção 
Mutagênese por Deleção:
- Tratamento do DNA do 
vetor+inserto com 
Exonuclease III: remove 3’ 
para 5’ do terminal 3’ 
recessivo.
- Clivagem com uma 
nuclease específica para 
fita simples (S1): gerar 
terminal cego!
-Ligação e introdução em 
hospedeiro!
Estratégias de Clonagem: Mutagênese por Deleção 
Bal 31
Mutagênese por Deleção:
- Tratamento do DNA do 
inserto com Exonuclease 
Bal3I: remove extremidade
DS ou SS. 5’ para 3’
- Remoção de sequências 
indesejáveis.
-Ligação e introdução em 
hospedeiro!
Fragmento Klenow da DNA Polimerase I
- Deleção do domínio com atividade de exonuclease 5’ para 3’.
- Mantém a atividade de exonuclease de 3’ para 5’.
Klenow: Tratamento de Terminais Coesivos
Preenchimento de DNA com terminais recessivos 3’: Atividade de Polimerase
 Deleção de DNA com terminais protuberantes: remoção do terminal 
3’OH pela atividade de exonuclease.
T4 DNA Polimerase:
- Isolada do Fago T4: atividades semelhantes a Klenow. 
Sem a atividade de exonuclease 5’ >> 3’.
Vantagem:
1 – 200X maior atividade de exonuclease 3’>>>5’: mais eficiente e apropriada 
para geração de terminais cegos.
T7 DNA Polimerase:
- Isolada do Fago T4: Polimerase 5’>>>3’. Sem a atividade de exonuclease 
5’ >> 3’. Semelhante a Klenow e T4 DNA polimerase.
Vantagem:
1 – Elevada processividade: tamanho do fragmento gerado até o 
desligamento da enzima do DNA molde é muito alto.
2 – Sequenase: T7 DNA Polimerase modificada para a eliminação da atividade 
de Exonuclease 3’>>5’. Sem proofreading!