Tecnólogia genética av1

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TECNÓLOGIA GENÉTICA- IBMR
Fluxo de Informação Genética: Expressão Gênica
Características que são compartilhadas em famílias geralmente têm uma base genética, o que significa que elas dependem da informação genética que uma pessoa herda de seus pais. Muitos de nós temos curiosidade sobre genética porque queremos entender a herança humana. 
Genética ontem e hoje
Vamos conhecer um pouco mais sobre o fascinante mundo da Genética?
Na segunda metade do século XIX, o monge austríaco Gregor Johann Mendel (1822-1884) descobriu que a transmissão das características hereditárias seguem regras bem definidas e propôs explicação para essas regras. Os resultados dos seus experimentos foram publicados em 1865, mas não despertaram o interesse dos cientistas da época.
Mendel e as ervilhas
Mendel escolheu como material de estudo a ervilha-de-cheiro (Pisum sativum). As ervilhas são plantas da família das leguminosas, apresentam fruto em forma de vagem, possuem flores hermafroditas, isto é, órgãos reprodutores masculinos e femininos e se reproduzem com certa rapidez, permitindo obter várias gerações em pouco tempo.
A flor da ervilha tem estruturas masculinas e femininas guardadas numa espécie de urna (chamada “quilha”) que impede a polinização por pólen de outras flores, favorecendo, assim, a autofecundação. Para realizar a fecundação cruzada entre duas plantas de ervilhas, é preciso abrir a quilha e cortar as anteras para ser, então, colocado sobre o estigma o pólen proveniente de outra planta.
1ª lei de Mendel
Experimento das ervilhas
“Cada caractere é determinado por um par de fatores que se separam na formação dos gametas, indo um par para cada gameta”
Mendel certificava-se de estar lidando com ervilhas de linhagens puras, uma vez que se reproduziam por autofecundação. Como essas plantas não sofriam alteração de uma geração para outra, as características se mantinham nas gerações seguintes.
Uma forma de característica, como por ex., alta, sempre escondia a outra forma, como por ex., baixa, na primeira geração após o cruzamento. Mendel chamou a forma visível de traço dominante e a forma escondida de traço recessivo. 
Na segunda geração, depois que as plantas realizavam a autofecundação (polinizar a si mesmas), a forma escondida do traço reaparecia em uma minoria de plantas. 
Mendel também descobriu que as características eram herdadas independentemente: uma característica, como altura da planta, não influenciava a herança de outra, como cor da flor ou forma da semente
DNA (Ácido DesoxirriboNucléico)
Molécula que armazena informações genéticas; 
Forma de um espiral duplo.
Dois ramos compostos por moléculas de açúcar (desoxirribose) e de fosfatos; 
Ligam-se devido ao pareamento de quatro moléculas denominadas bases nitrogenadas: Adenina (A), Timina (T), Guanina (G), Citosina (C).
DNA 
Bases nitrogenadas Adenina (A) – Timina (T) Guanina (G) – Citosina (C) 
Ligações: pontes de hidrogênio
O QUE É INFORMAÇÃO GENÉTICA?
Características das crianças (tais como cor dos olhos ou dos cabelos). Todas as informações genéticas de um indivíduo estão contidas em seus genes, podendo também, ser obtidas a partir do produto destes. Essas informações são hereditárias e únicas, ou seja, não existem duas pessoas que apresentem informações genéticas idênticas, excetos gêmeos monozigóticos (gêmeos idênticos). Devido a essas características, há muitos anos os médicos utilizam as informações genéticas para realização de diagnósticos clínicos. Baseados no histórico médico familiar, por exemplo, os médicos podem calcular a probabilidade do surgimento de alguma patologia hereditária em uma criança, ainda durante a gravidez.
Genes especificam produtos funcionais (como proteínas)
Uma molécula de DNA é dividida em unidades funcionais chamadas genes. Cada gene fornece instruções para um produto funcional, ou seja, uma molécula necessária para realizar um trabalho na célula. Em muitos casos, o produto funcional de um gene é uma proteína. Por exemplo, o gene da cor das flores de Mendel fornece instruções para fazer uma proteína que ajuda na produção de moléculas coloridas (pigmentos) nas pétalas das flores.
As informações contidas no DNA especifica o tipo de proteína que são feitas nas células.
Como são criados os diferentes tipos de células e suas diversas funções?
Através de diferentes expressões gênicas. As mesmas informações genéticas (genoma) estão em todas as 100 trilhões de células de uma pessoa. O que muda é o fato de apenas alguns genes se expressarem em cada uma delas. Como? Diferentes expressões gênicas ocorrem pelo controle do fluxo de informações do DNA para as proteínas.
Dogma Central da Biologia Molecular
Logo após a elucidação dos mecanismos da hereditariedade e sabendo que as proteínas são as executoras das funções celulares, Crick propôs uma série de teorias para explicar como a informação armazenada na molécula de DNA seria transformada em proteínas. 
Nessa época já era conhecida a existência de enzimas – as RNA polimerases, capazes de sintetizar o ácido ribonucleico, o RNA – a partir de trechos (genes) de uma das fitas do DNA, em um processo conhecido como Transcrição. 
Em 1955, Crick postulou que aminoácidos deveriam se ligar a uma molécula de RNA (mais tarde, chamado de RNA transportador – RNAt) e que a informação contida no DNA era transcrita em moléculas de RNA (RNA mensageiro, RNAm) e em seguida o RNAm era traduzido em proteínas
RNA (ácido ribonucleico)
Molécula responsável pela síntese de proteínas das células do corpo (principal função); 
Por meio da molécula de DNA, o RNA é produzido no núcleo celular, sendo encontrado também no citoplasma da célula; 
O RNA polimerase é o nome da enzima que auxilia na catalisação da síntese do RNA. A partir de uma molécula de DNA ela é formada por um processo chamado de transcrição;
A molécula de RNA é composta por ribonucleotídeos, os quais são formados por uma ribose (açúcar), um fosfato e as bases nitrogenadas. 
As bases nitrogenadas são classificadas em: Adenina (A) e Uracila (U) Citosina (C) e Guanina (G)
ESTRUTURA DE RNA
É feito no núcleo e depois vai para o citoplasma
TIPOS DE RNA 
RNA Mensageiro (RNAm): junto ao RNA ribossômico, ele auxilia na síntese de proteínas, orientando a ordem dos aminoácidos para a formação proteica. Ele é responsável por levar do núcleo celular até o citoplasma as informações genéticas recebidas do DNA. Seu peso é menor que o RNA ribossômico. 
RNA Ribossômico (RNAr): recebe esse nome pois é o principal constituinte dos ribossomos. Ele possui o maior peso, sendo o principal responsável pela síntese de proteínas. 
RNA Transportador (RNAt): seu nome já indica que sua função é transportar as moléculas de aminoácidos que serão utilizados na síntese de proteínas. Ele transporta essas moléculas até os ribossomos, local em que se unem e formam as proteínas. Comparado com os outros, este possui o menor peso.
A partir dessas descobertas a síntese proteica começou a ser desvendada, e em 1966 o Código Genético foi concluído. Tais mecanismos exigem um alto controle de quanto, como e onde uma proteína será produzida, pois apesar de um organismo pluricelular carregar em cada uma de suas células exatamente o mesmo genoma, sabe-se que cada célula ou tecido especializa-se na produção de proteínas distintas. Esse controle se dá em diferentes momentos: antes da formação do RNAm, após sua formação ou após a formação da proteína, e garantem a estabilidade da expressão gênica
Como a sequência do DNA de um gene especifica uma determinada proteína?
Esse processo envolve dois passos principais: TRANSCRIÇÃO e TRADUÇÃO. 
Na TRANSCRIÇÃO, a sequência de DNA de um gene é copiada para fazer uma molécula de RNA. Essa etapa é chamada de transcrição pois envolve reescrever, ou transcrever, a sequência de DNA num "alfabeto" similar de RNA. Nos eucariontes, a molécula de RNA deve passar por um processamento para se tornar um RNA mensageiro (RNAm) maduro. 
Na TRADUÇÃO, a sequência de RNAm é decodificadapara determinar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. O nome tradução significa que a sequência do RNAm precisa ser traduzida numa "linguagem" de aminoácidos completamente diferente
A replicação é o processo em que o DNA produz cópia de si mesmo. Na transcrição que ocorre no citoplasma das células eucarióticas uma molécula de RNA é formada a partir de uma molécula molde de DNA. Por último, a tradução é o processo responsável pela produção de proteína a partir da leitura da mensagem contida no RNA mensageiro com a participação de outros tipos de moléculas de RNA, por exemplo, O RNA transportador (RNAt) e o RNA ribossômico (RNAr) .
Temos o DNA, onde está contida a informação genética, que pode ser transcrito em moléculas de RNA.
No processo de transcrição, uma molécula de DNA serve como molde para a criação de uma molécula de RNA. É nessa molécula de RNA que é encontrado o código usado para organizar a sequência de aminoácidos e formar as proteínas no processo de tradução. 
Esse processo consiste na união de aminoácidos, obedecendo à ordem de códons apresentados em um RNA mensageiro. Observa-se a replicação do DNA, processo pelo qual uma molécula de DNA é capaz de formar outra molécula idêntica à original.
Algumas mudanças já foram feitas no modelo proposto originalmente. Isso ocorreu em razão de hoje se saber, por exemplo, que algumas enzimas são capazes de utilizar o RNA para produzir DNA.
Hoje se sabe que uma molécula de RNA pode produzir DNA. Chamamos esse processo de transcrição reversa e ele acontece principalmente em vírus. Eles possuem uma enzima denominada transcriptase reversa, que transcreve o RNA para o DNA. 
A replicação do RNA também é um fato observado em alguns vírus. Essa molécula é replicada e atua como um RNA mensageiro. Para realizar esse processo, o vírus utiliza um RNA replicase. Observe também que uma proteína é formada a partir dos ácidos nucleicos, mas um ácido nucleico não pode ser formado a partir de uma proteína.
CONCEITOS BÁSICOS
Gene 
Segmento de DNA que ocupa uma posição específica de um determinado cromossomo e que participa da manifestação fenotípica de uma determinada característica.
Éxons: são as partes “efetivamente” responsáveis pela codificação de proteínas.
Cromossomos 
Armazena e organiza o DNA no núcleo das células.
Alelos 
São formas alternativas de um mesmo gene • Ocupam o mesmo loco em cromossomos homólogos 
Alelos diferentes heterozigotos (Aa) 
Alelos iguais homozigotos (AA ou aa) 
Máximo dois alelos diferentes por lóculo
Genótipo 
É a combinação de genes alelos provenientes das células germinativas feminina (♀) e masculina (♂).
Característica fixa de um organismo; 
Fica constante durante toda a vida; 
Não é mudada por fatores do ambiente.
Fenótipo
Expressão física do genótipo. 
Muda em resposta a fatores ambientais. 
Boa indicação da genética do indivíduo. 
Menos confiável.
AULA 3- EQUIPAMENTOS LABORATÓRIAIS
Laboratório de Biologia Molecular
O Laboratório de Biologia Molecular (BioMol), é definido como um espaço multiusuário. Sua finalidade é possibilitar o desenvolvimento de procedimentos de Biologia Molecular. 
O BioMol tem sua organização administrativa e seu funcionamento disciplinados pelo conjunto de Normas Gerais, pelos Regimentos, Regulamentos e Normas da Instituição, além do que está estabelecido nas legislações estadual e federal.
Nos finais dos anos 90 a Técnica Amplificação de Ácido Nucléico (NAT) tornou-se comum nos Laboratórios de Biologia Molecular. 
Um laboratório para execução do NAT, deve-se dispor de áreas e espaços laboratoriais bem delimitados para as diferentes etapas de execução, desde a preparação de amostras até a fase de detecção do produto amplificado. Da sua adequada concepção depende a confiabilidade dos resultados e a prevenção de contaminações.
Segundo RDC nº50/2002, o Laboratório de Biologia Molecular é classificado no Nível de Biossegurança 2 (NB-2), adequado para “qualquer trabalho que envolva sangue humano, líquidos corporais, tecidos ou linhas de células humanas primária onde a presença de um agente infeccioso pode ser desconhecido”.
 De acordo com a citada Resolução, os procedimentos que envolvem um alto potencial para produção de salpicos ou aerossóis que possam aumentar os riscos de exposição dos funcionários, devem ser conduzidos com um equipamento de contenção primária ou com dispositivos como a Cabine de Segurança Biológica ou os copos de segurança da centrífuga, além da utilização de barreiras primárias, como os escudos para borrifos, proteção facial, aventais e luvas.
“As barreiras secundárias como pias para higienização das mãos e instalações para descontaminação de lixo devem existir com o objetivo de reduzir a contaminação potencial do meio ambiente”. (MS, 2002)
SETORES DO LABORATÓRIO
Setor A – Extração de DNA: este setor conta com bancada, armários, freezer vertical, geladeira, centrifugas, termobloco, termobloco com agitação, concentrador a vácuo, centrifuga refrigerada com rotor para microplacas e capela de exaustão. A principal finalidade do setor é a extração e purificação de DNA.
Setor B - Lavagem: este setor conta com pia de metal, equipamento purificador de água, autoclave e estufa. A principal finalidade do setor é dar suporte aos procedimentos realizados no Laboratório de BioMol.
Setor C- Preparação de PCR: este setor conta com bancadas, armários, freezer vertical, geladeira, termocicladores para microplacas half-skirt e full-skirt, estações de trabalho para PCR e microcentrífuga. A principal finalidade do setor é a montagem das reações de PCR e amplificação dos fragmentos de DNA.
Setor D- Eletroforese: este setor conta com bancada, armário, cubas de eletroforese (diversas marcas, modelos e tamanhos), fontes de eletroforese (diversas marcas e modelos), equipamento de foto-documentação e microondas. A principal finalidade do setor são os procedimentos de eletroforese de DNA e produtos de PCR, bem como da fotodocumentação dos mesmos.
Setor E - Uso geral: este setor conta com uma bancada central, esterilizador e balança. A principal finalidade do setor é dar suporte aos procedimentos realizados no Laboratório de BioMol. 
Setor F - Apoio: este setor possui bancada em alvenaria com uma pia e 6 freezers verticais. A principal finalidade do setor é servir como apoio aos outros espaços do laboratório bem como abrigar material estocado nos freezers.
MATERIAIS PERMANENTES
BALANÇAS
VIDRARIAS
Vidraria refere-se a uma grande variedade de equipamentos de laboratório que tradicionalmente são feitos de vidro, mas também podem ser plásticos. Em geral são utilizados em análises e experimentos científicos, principalmente nas áreas de química e biologia. Contudo o vidro ainda é muito utilizado devido a sua transparência, resistência ao calor e por ser praticamente um material inerte. 
Tipos de vidrarias e suas funções 
Geralmente a vidraria de laboratório apresenta graduações e marcas volumétricas em suas paredes. Essa marcação pode ser de maior ou de menor precisão conforme o tipo de vidraria e sua função.
Em alguns casos a vidraria não apresenta marcação;
As vidrarias também podem apresentar cores e materiais diferenciados:
Vidro cristal: Vidro de alta qualidade e transparência, geralmente denominado vidro boro, que possui mais resistências em choques térmicos, mecânicos e químicos.
Vidro âmbar: Vidro escurecido, utilizado na maioria das vezes para diminuir o efeito da luz no armazenamento de compostos fotossensíveis 
Plástico: atualmente alguns equipamentos estão sendo fabricados com plástico, em sua maioria por razões econômicas, porém sem apresentar muitas das qualidades do vidro.
Além das marcações, da precisão e do tipo de material, a função da vidraria também é determinada pelo seu formato. Alguns equipamentos tem formato especifico para algumas vidrarias. (ex: algumas mantas aquecedoras), e da mesma forma algumas vidrarias tem formato especifico para o equipamento.(ex: tubos de falcon).
Vidrarias mais comuns em laboratório
	A limpeza adequada de vidrarias e demais instrumentos de laboratório é fundamental para garantir a precisão dos resultados obtidos nas experiências e medições.
Como lavar vidrarias com soluções químicas comuns
Soluções solúveis (cloreto de sódio ou soluções de sacarose, por exemplo) - Lavar 3-4 vezes com água deionizada e em seguida, colocar o vidro para secar. 
Soluções insolúveis (hexano ou clorofórmio, por exemplo) - Lavar 2-3 vezes com etanol ou acetona, lavar 3-4 vezes com água deionizada e em seguida, colocar o vidro para secar. Em algumas situações, pode ser necessária a utilização de outros solventes para a lavagem inicial. 
Ácidos fortes (HCl concentrado, por exemplo) - Sob um exaustor, lavar cuidadosamente o vidro com volumes abundantes de água da torneira. Lavar 3-4 vezes com água deionizada e em seguida, colocar o vidro para secar. 
Bases fortes (NaOH 6M, por exemplo) - Sob um exaustor , lavar cuidadosamente o vidro com volumes abundantes de água da torneira. Lavar 3-4 vezes com água deionizada e em seguida, colocar o vidro para secar.
Ácidos fracos (soluções de ácido acético ou de diluições de ácidos fortes, como HCl 0,1 M ou 1M, por exemplo) - Lavar 3-4 vezes com água deionizada antes de colocar o vidro para secar. 
Bases fracas (NaOH, por exemplo) - Enxaguar abundantemente com água da torneira para remover a base e em seguida, lavar 3-4 vezes com água deionizada antes de colocar o vidro para secar.
Lavagem de vidrarias especiais
Vidraria utilizada em química orgânica → Lave o vidro com o solvente adequado. Use água deionizada para conteúdos solúveis em água. Use o etanol para conteúdos solúveis em etanol, seguido por lavagens em água deionizada. Lave com outros solventes, quando necessário, posteriormente etanol e água deionizada. Se o vidro precisa ser esfregado, esfregue-o com uma escova usando água quente e sabão, enxague bem com água da torneira e faça lavagens com água deionizada. 
Buretas → Lave com água quente e sabão, enxague bem com água da torneira e lave 3-4 vezes com água deionizada. Certifique-se as lavagens finais removeram todos o conteúdo da vidraria. Buretas precisam estar completamente limpas para serem usadas em experimentos quantitativos. 
Pipetas e balões volumétricos → Em alguns casos, pode ser necessário deixar o vidro de molho durante a noite em água com sabão. É recomendável o uso de água morna e sabão, assim como esfregar a vidraria com uma escova. Enxague com água da torneira seguido por 3-4 lavagens com água deionizada.
REAGENTES que merecem destaques em LBM...
Acrilamida é suspeita de ser carcinogênica, severamente neutoróxica, causar irritação nos olhos, pele (é imediatamente absorvida) e trato digestório.
Cuidado em pesar acrilamida e bis-acrilamida
Policrilamida teoricamente não é prejudicial
Descarte em recipiente apropriado
Brometo de etídeo- provável ação cancerígena 
SEGURANÇA GERAL EM LABORATÓRIO
Para contenção do risco e seguranças são utilizadas as seguintes medidas básicas:
Boas práticas no laboratório
Barreira de contenção
RISCO QUÍMICO
RISCO BIOLOGICO
RISCO FISICO 
Segurança Geral em Laboratório
Dispor da saída de emergência
Ter as bancadas revertidas com material não poroso e dispostas de modo a possibilitar a circulação dos técnicos.
Estar com os equipamentos instalados de acordo com suas características e orientações do fabricante e instalados próximos a tomadas.
Ter disponíveis para todos, equipamentos de proteção individual (EPIs)
Manter os equipamentos elétricos longes das pias e superfícies úmidas ou molhadas.
Utilizar uma tomada para cada equipamento
A bancada deve ser utilizada apenas com os materiais utilizados no trabalho que vai se executar, deve estar o mais livre possível.
Utilização correta de equipamentos coletivos.
Utilização de processo seguros de descontaminação do ambiente e das bancadas, do lixo, nas atividades e práticas de higiene pessoal
O acondicionamento e envio para descarte final desconta minado;
O estabelecimento de rotinas a serem seguidas em caso de acidentes.
Manutenção preventiva
Tratamento precoce
Especifico para cada equipamento 
Descrições nos manuais (procedimentos/ frequência)
Corrigir as pequenas avarias e evitar a parada total do equipamento
Realizada pelo responsável técnico ou assistência técnica especializada
LIXO
Fazer o descarte adequado do lixo/resíduo, utilizando os recipientes adequados para lixo comum, resíduo biológico, material pérfuro-cortante e resíduo químico.
Segregação; 
Acondicionamento; 
Identificação; 
Transporte interno;
Armazenamento temporário; 
Tratamento; 
Armazenamento externo; 
Coleta e transporte externo;
Destinação final;
LIMPEZA
Separar todo o material de limpeza de áreas técnicas das áreas comuns (balde, rodo, pano)
 É proibida a presença de produtos de uso doméstico nas áreas técnicas
A limpeza das áreas técnicas tem que ser feita com produtos apropriados para descontaminar (detergente especifico, hipoclorito de sódio e 1% de álcool a 70%)
2º BARREIRAS DE CONTENÇÃO
São classificadas como primarias e secundarias.
Barreiras primarias: são equipamentos de proteção individual e coletiva.
Luvas descartáveis (de látex ou de vinil)
Luvas de borracha grossa: para manipulação de resíduos, lavagem de material e limpeza laboratorial.
Luvas de PVC: para manuseio de citostáticos
Luvas resistentes para temperatura
Jaleco
Óculos de proteção
Máscara de proteção
Cabines de segurança biológica
Capela de exaustão química 
Chuveiro de emergência
Lava olhos
Extintores de incêndio
Luvas de látex: O látex é uma secreção esbranquiçada extraída de certos tipos de árvores. É esse material que vai dar origem às luvas descartáveis mais utilizadas nos serviços de saúde. 
Luvas de nitrila Ao contrário das luvas de látex, as luvas de nitrila são produzidas a partir de borracha sintética
Barreiras secundárias: projeto e construção das instalações, devem e star de acordo com o bom funcionamento e com o nível de biossegurança recomendados.
 Medidas coletivas: descarte e remoção de lixo, extintores de incêndio, lavados de olhos, sinalização adequada.
TIPOS DE RISCOS
MAPA DE RISCO
	
AULA 3- EXTRAÇÃO DE DNA EM CADEIA POLIMERASE (PCR)
A genética molecular tem sido um campo de estudo muito amplo, propiciando o desenvolvimento da biotecnologia. A biotecnologia corresponde a técnicas que permite o uso de organismos para a produção de substâncias uteis ao ser humano.
Com os avanços do conhecimento cientifico, surge uma nova biotecnologia que inclui modernas técnicas de manipulação do DNA, permitindo 
Manipular genoma dos organismos
Transplantar genes de uma espécie para outra
Construir sequencias de DNA no laboratório
DNA 
no interior das células de procariotos 
no núcleo celular em eucariotos
DNA eucariótico
Proteínas Básicas Histonas + DNA= Cromatina
EXTRAÇÃO DE DNA
Qualquer procedimento laboratorial envolvendo análise de DNA e RNA tem que passar pelo processo de extração. 
A extração de DNA é o primeiro passo para utiliza- lo em técnicas moleculares. Neste aspecto, a qualidade e integridade do DNA são fundamentais para o sucesso nas etapas posteriores. Existem diferentes protocolos de extração de DNA que variam em função da espécie e do tecido a ser utilizado. 
O êxito nesta etapa depende de vários fatores, como: a adequação do protocolo e, sobretudo, o manuseio de utensílios de maneira adequada para evitar contaminação. 
Normalmente os componentes da solução extratora variam de acordo com o protocolo utilizado, sendo que cada solução deve conter um tampão para estabilizar o pH, um sal para dissocia as proteínas, um detergente para solubilizar as membranas e um agente inativante das DNAses cuja função é proteger. o DNA genômico;
Amostras
Sangue
Sêmen 
Raiz do dente 
Bulbo piloso 
Mucosa oral 
Muco cervical 
Ossos 
Tecidos vegetaisObtenção das amostras para extração de DNA
As amostras perecíveis devem ser acondicionadas de forma adequada até o momento de serem submetidas à extração do DNA. Amostras de sangue e de outros tecidos animais devem ser refrigeradas até chegarem ao laboratório. Amostras de tecidos vegetais também devem ser cuidadosamente colhidas, armazenadas e refrigeradas.
Para melhor conservação, as amostras devem ser mantidas em temperatura de –20°C a – 80°C, dependendo do tempo de armazenamento. Para utilização de amostras conservadas em estoque, é interessante o fracionamento em pequenas alíquotas, para que o material não sofra descongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do DNA.
O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados por nucleases, enzimas que normalmente estão presentes nos fluidos corporais liberados principalmente nas mãos das pessoas.
Cuidados durante e após a extração de DNA
Com a finalidade de se obter amostras de DNA adequadas aos protocolos de amplificação, é importante que exista uma sala exclusiva para esse fim. O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro e pode ser adsorvido na presença de alguns sais; por isso, esse material não deve ser empregado durante o processo de extração. Todo o material plástico (polipropileno) utilizado deve ser esterilizado e novo (não deve ser usado material reciclado), para que as amostras apresentem boa qualidade e para que se diminuam os riscos de contaminação entre amostras no momento da análise
Material necessário para extração de DNA
Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório tenha os equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos procedimentos. O material mínimo necessário é o seguinte:
Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos (ou para o tipo de tubo empregado no laboratório). É aconselhável que a centrífuga tenha controle de refrigeração.
Capelas de exaustão.
Banho-maria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura. 
Vidraria para preparo das amostras (provetas, pipetas, bastões de vidro). 
Microtubos de polipropileno. 
Micropipetas automáticas para volumes diversos (com ponteiras). 
Gelo e nitrogênio líquido, quando necessário.
Etapas da extração
4 etapas básicas: 
Lise das membranas lipídicas 
Purificação do DNA 
Precipitação do DNA 
Hidratação do DNA
Procedimento básico
1–Lise 
Membranas: fosfolipídios + proteínas 
Rompimento da membrana celular 
Detergente para degradar
2- Purificação de DNA
Remoção de componentes celulares como proteínas, organelas e restos celulares
Proteinase K 
Enzima extraída de fungo 
Desnatura e solubiliza proteínas 
DNA se desprende das Histonas
Sal 
Ajuda a manter as proteínas dissolvidas no líquido extraído, impede que precipitem 
Fenol 
Remove proteínas e outros contaminantes da solução aquosa 
Clorofórmio 
Ajuda a desnaturar proteínas e remover o fenol residual
3- Precipitação de DNA no álcool
Etanol 
O DNA é insolúvel no etanol gelado 
Quando o etanol é lentamente adicionado ao filtrado, o DNA se precipita
4- Reidratação do DNA
Após retirada do etanol, o DNA precisa se solubilizar em algum solvente: solução tampão 
Este solvente servirá para armazenamento do DNA extraído 
Deve ser livre de contaminantes e enzimas capazes de destruir o DNA 
Armazenar a -20ºC
Aplicação: Extração de DNA a partir de amostra sangue de sangue periférico. 
Amostra: amostra de sangue total periférico, obtida a partir de coleta em tubo primário contendo o anticoagulante EDTA. 
Materiais e equipamentos :Avental, máscaras, óculos de proteção e luvas sem talco Pipetas automáticas Ponteiras de filtro estéril Tubos de 1,5 mL a 2,0 mL estéreis Tubos tipo falcon de 15 mL estéreis Tubos de coleta sangue a vácuo com anticoagulante EDTA Criotubos de 0,5 mL Tampas de cor amarela.
PROCEDIMENTO
1. Pipetar 200 μL de Protease QIAGEN no fundo de um tubo de 15 mL (não fornecido). 
2. Adicionar 1-2 mL de sangue e misturar rapidamente. Se o volume for inferior a 1 mL, adicione PBS até completar 2 mL. A protease pode ser adicionada ao tubo já contendo o sangue. Neste caso, é importante certificar-se que a enzima adicionada foi misturada adequadamente. 
3. Adicionar 2,4 mL de tampão AL e misturar invertendo o tubo por 15 vezes, seguido de agitação vigorosa por pelo menos 1 min. Para garantir uma lise adequada, a amostra deve ser misturada com o tampão AL até produzir uma solução homogênea. Não adicione a protease diretamente ao tampão AL
4. Incubar a 70°C por 10 min. O rendimento de DNA atinge um máximo após lise por 70°C por 10 min, mas tempos de incubação mais longos não afetam o rendimento. 
5. Adicionar 2 mL de etanol (96-100%) e misturar invertendo o tubo por 10 vezes, seguida de agitação vigorosa. Para garantir uma ligação eficiente, é essencial que a amostra seja misturada completamente após a adição do etanol para se obter uma solução homogênea. Use somente etanol 96- 100%. Outros tipos de álcoois podem reduzir o rendimento e a pureza do DNA. 
6. Transferir metade da solução (3,3 mL) para uma coluna QIAamp Midi colocada em um tubo de 15 mL (fornecido), tomando o cuidado para não molhar a borda do tubo. Tampe e centrifugue a 1850 g (3.000 rpm) por 3 min. Se a solução não passar completamente pela membrana da coluna, centrifugar novamente a uma velocidade um pouco maior. Não apertar demais a tampa. Sempre segurar as colunas em uma posição vertical mesmo que as tampas estejam fechadas para não correr o risco de algum líquido transbordar. 
7. Remover a coluna, descartar o filtrado e colocar a coluna de volta o tubo de 15 mL. Transferir o restante da solução da etapa 5 para a coluna. Tampar e centrifugar novamente a 1.850 g (3.000 rpm) por 3 min. Enxugar qualquer gota que tenha ficado no tubo de 15 mL antes de inserir novamente a coluna. Não molhar a borda da coluna. Fechar cada coluna para evitar contaminação entre as amostras durante a centrifugação. Se a solução não passar completamente pela membrana da coluna, centrifugar novamente a uma velocidade um pouco maior.
8. Remover a coluna, descartar o filtrado e colocar a coluna de volta o tubo de 15 mL. Enxugar qualquer gota que tenha ficado no tubo de 15 mL antes de inserir novamente a coluna. Se o filtrado não for removido, a ponta da coluna ficará submergida no filtrado e a eficiência de lavagem será reduzida. 
9. Adicionar 2 mL de tampão AW1 cuidadosamente sem molhar a borda. Fechar e centrifugar a 4.500 g (5.000 rpm) por 1 min. Não descartar o filtrado neste passo e continuar diretamente na etapa 10. 
10. Adicionar 2 mL de tampão AW2 cuidadosamente sem molhar a borda. Fechar e centrifugar a 4.500 g (5.000 rpm) por 15 min. O aumento do tempo de centrifugação deve remover todos os traços de tampão AW2 da coluna antes da eluição. Se a força de centrifugação for menor que 4000 g, recomenda-se incubar a coluna por 10 min a 70°C para evaporar resíduos de etanol, que pode causar inibição de reações de PCR levando a resultados falso negativos. 
11. Colocar a coluna em um tubo limpo de 15 mL (fornecido) e descartar o tubo de 15 mL contendo o filtrado. Utilizar um lenço de papel para enxugar qualquer respingo da coluna antes de inserila no tubo novo.
12. Adicionar 300 μL de tampão a temperatura ambiente diretamente na membrana da coluna. Fechar e incubar por 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 4.500 g (5.000 rpm) por 2 min. Para armazenamento por longos períodos do DNA, recomenda-se aliquotar o DNA em alíquotas a -20°C. 
13. Utilizar 1 μL do DNA (filtrado) para quantificação de em Nanofotômetro. 14. Separar o DNA em duas alíquotas em criotubos de 0,5 mL com tampa amarela, devidamente etiquetados a -80°C.
A caixa de armazenagem deve ser bem identificada. Cada alíquota deve estar em caixas e em freezers diferentes. Anotar as posições e caixas onde as alíquotas forem estocadas.
Kit comercial
Existem muitostipos de protocolos e muitos kits comerciais para a extração de DNA que se adaptam a diversos tipos de amostras. Para cada tipo de tecido podem ser testadas adaptações, de acordo com as características de cada espécime a ser analisado.
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
PCR -> Polymerase Chain Reaction
Multiplicação “in vitro” de um trecho específico de DNA (gene ou parte dele) resultando na produção de milhares de cópias da sequência desejada sem o uso de um organismo vivo. Apesar da facilidade de amplificação de DNA possibilitada pela técnica de PCR, existe a necessidade da adequada padronização dos protocolos a serem utilizados em todas as fases dos procedimentos, desde a obtenção do ácido nucléico até a reação de amplificação propriamente dita
Reagentes Necessários para a Reação
A reação SEMPRE parte de um DNA molde, extraído convenientemente da amostra. 
O ideal é que o ácido nucléico esteja livre de impurezas (proteínas, lipídeos, outro ácido nucléico, reagentes de extração, etc.) e numa concentração mínima de 5µg/mL, apesar de quantidades bem menores poderem ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a utilizar quantidades de até 10-12 mol de DNA).
DNA-POLIMERASE: A mais usada é a TAQ-Polimerase, é a catalisadora da extensão dos primers. 
SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons diversos (Na⁺ , Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições da reação
MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺ , que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima; 
 dNTP : Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq.
COMO ESCOLHER O PRIMER?
PRIMER/INICIADOR 
Sintetizados quimicamente; 
Define limites alvo a amplificar; 
Serve como ponto de início para a replicação; 
Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás); Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org)GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
COMO É FEITO? 
Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina termocicladora que possui como função fazer ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para as reações seguintes da análise.
A multiplicação dos trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio entre: 
Denaturação das cadeias do DNA genômico; 
anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a sequência a ser amplificada; 
temperatura ótima específica da enzima: 72ºC; 
reinício do ciclo.
ETAPAS DO CICLO 
1-Desnaturação: É muito importante para que a fita do DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio.
2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.
3-Extensão: Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.
Esquema dos processos realizados numa reação PCR. Após a desnaturação das fitas moldes, ocorre o pareamento dos primers. A enzima, representada em verde, adiciona os desoxinucleotideos complementares as fitas-mãe.
Passos finais de uma reação de PCR. A figura mostra as duas fitas mãe, pareadas com suas fitas-filha complementares, sintetizadas a partir da adição dos desoxinucleotideos pela DNA polimerase.
DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR 
Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose ou acrilamida. A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras.
PONTOS IMPORTANTES: 
Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da reação, resultando em baixa concentração do produto desejado; 
A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica. Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida concentração do produto.
VANTAGENS DA TÉCNICA 
Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; 
Rápida; 
De baixo custo 
LIMITAÇÕES 
Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos; 
Facilidade de contaminação da amostra; 
Extensão limitada da sequência a se amplificar; 
Limitada extensão da sequência; 
Incorporação errônea de bases durante a replicação.
AULA 4- TIPOS DE PCR
A PCR (reação em cadeia da polimerase)
Técnica descrita por katy mullis em 1983
Técnica “in vitro” que permite a amplificação de sequencias de DNA e RNA.
Elementos da técnica: primase, helicase, taq DNA polimerase, ions, multinucleotideos, primer. 
Etapas da técnica: desnaturação (94º -95º) => anelamento (55°-65°) => extensão (72°)
PCR- NESTED
Objetivo: solucionar o problema da especificidade da técnica simples que, pela grande capacidade de amplificação, aumenta a possibilidade de que o DNA amplificado não seja o desejado.
Para contornar esses problemas, primers internos (nested) são desenhados e empregados para testar a especificidade ao segmento de PCR que foi amplificado.
Vantagens
Ganho em especificidade e eficiência a DNA –molde do 2 round em concentrações altíssimas, e os primers da segunda etapa tem menos chances de anelamento em sequencias especificas, dada a redução do tamanho do molde.
Aumentar a sensibilidade das reações em cadeia
Diagnostico de microorganismos em amostras de DNA extraídas de espécimes clínicos diversos
Desvantagens 
?
PCR-MULTIPLEX
Técnica descrita por Jeffrei S.Chamberlain e Joel R. Chamberlain em 1998
Baseada na amplificação de mais de um segmento de DNA. Sendo que cada fragmento do DNA, possui um par de primers.
Aplicações:
Reconhecer e discriminar simultaneamente infecções mistas
Caracterizar simultaneamente mais que um fator de resistência a fármacos
Teste de paternidade
Vantagens
Detecção e analise de múltiplos genes de uma amostra ao mesmo tempo
Mais econômico e mais rápido
Isso de um controle interno nos ensaios diagnósticos, não sendo necessário controle externo
Desvantagens
Excesso de primers => complementariedade entre os primers (dímeros)
PCR- REAL TIME
A amplificação do DNA e a detecção ocorrem simultaneamente
A reação de amplificação é detectada por um sistema fluorescente 
Fluorocromo R: presente na extremidade 5’ e emite luz
Fluorocromo Q: presente na extremidade 3’ e funciona como capturador de energia (quencher)
A energia para excitação dos fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra -> taqman
Exemplo:
Leucemia mieloide crônica 
Elevada expressão de proteína de fusão BCR-ABL
Confirmação do diagnóstico é através da marcação dessa proteínae posterior a fluorescência após a amplificação.
Aplicações:
Todas as aplicações do PCR tradicional
Identificação, quantificações e caracterizações genética do vírus (HIV, vírus da hepatite b e c e citamegalovirus), bactérias, micobacterias e fungos.
Determinação quantitativa de transcritos da translocação BCR-ABL, característicos de leucemia mieloide crônica
Determinação de pontos de mutações genéticas
Testes de eficiência terapêutica
Analise de patógenos em alimentos e os produtos transgênicos 
Vantagens do PCR- real time
Coleta de dados na fase exponencial 
SEM manipulação pos-PCR
Resultados quantitativos
Tempo de reação reduzido
Maior reprodutividade sensibilidade
 X
PCR- tradicional
Coleta de dados na fase final da reação 
Manipulação pós PCR
Resultados qualitativos
Preparação de gel de agarose- visualização
Muito tempo para obter resultados
CONCLUSÃO
O desenvolvimento da técnica de amplificação de fragmentos do DNA pela PCR permitiu avanços na análise de genes, diagnostico de doenças genéticas, detecção de agentes infecciosos entre outros.
PCR real time possibilita quantificação e rapidez do resultado sendo de grande relevância para diagnosticar patógenos e doenças genéticas.
PCR multiplex permite que diminua a intensidade e período de trabalho laboratorial, número de reagentes e custos, mas reduz a sensibilidade de detecção.
PCR nested proporciona ganho de especificidade e eficiência. Poucos estudos utilizam essa técnica.