exercicio_Biomol Aplicada

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Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG 
Guia de estudos - Biomol Aplicada 
ALUNA: Nathália Greco Coelho MARÍCULA: 2018087988 
1. Explique por que é mais difícil obter boa extração de RNA do que de DNA. 
Uma dificuldade encontrada na extração de RNA quando comparada ao DNA se 
diz respeito à estabilidade da amostra. O DNA apresenta estabilidade maior, enquanto 
o RNA é instável e, portanto, rapidamente degradado após a coleta. Isso ocorre devido 
à presença de grande quantidade de ribonucleases (RNAses) estáveis e ativas nos 
tecidos, que permitem que o RNA, por ser altamente instável, seja rapidamente 
degradado. 
 
2. Que cuidados devem ser tomados para uma boa extração de RNA? 
Na extração de RNA, alguns fatores além da escolha do protocolo utilizado, são 
extremamente importantes para a obtenção e a manutenção do RNA de qualidade. 
Primeiramente, é necessária a exposição deste material a tampões de extração que 
apresentam substâncias como o cloreto de lítio que auxilia a precipitação do RNA e 
isotiocianato de guanidina que permite a manutenção do RNA intacto nas etapas 
posteriores da extração, através da degradação das ribonucleases endógenas, e ainda 
clorofórmio, que solubiliza os lipídios permitindo a sua remoção. Além disso, todas as 
soluções utilizadas durante o processo deverão ser feitas com água DEPC 
(dietilporocarbonato) autoclavada, que atua inativando RNAses degradando as 
histidinas presentes. Deve-se ter o máximo de cuidado com todos os utensílios que 
serão utilizados, de modo que se apresentem livres de RNAses. Para tanto, eles devem 
ser previamente esterilizados em estufa a 180 °C por um período de quatro horas e as 
ponteiras e tubos de polipropilenos devem ser novos, bem como as micropipetas 
devem ser utilizadas apenas para os procedimentos com RNA. A bancada de trabalho 
deve ser constantemente limpa com SDS 10% e com etanol 70% e, se possível, 
exclusiva para a manipulação de RNA. Muito cuidado deve ser tomado também com as 
luvas utilizadas, de forma a mantê-las livres das RNAses, normalmente liberadas 
abundantemente pelas secreções da pele. 
3. Quais parâmetros fisico-químicos determinam a mobilidade das moléculas de ácido 
nucléico na eletroforese? 
Diferença de cargas elétricas e tamanho molecular. A eletroforese é um 
método de separação de macromoléculas por meio da aplicação de corrente elétrica e 
como as moléculas de ácido nucleico apresentam carga elétrica negativa (em razão do 
grupo fosfato dos nucleotídeos), ao serem submetidas a um campo elétrico, 
User
Retângulo
User
Retângulo
direcionam-se para o polo positivo. Quanto menor o tamanho da molécula, ou seja, a 
quantidade de nucleotídeos que ela possui, mais rápido será o seu deslocamento e, 
portanto, maior será a distância percorrida. Moléculas de mesmo tamanho migram a 
mesma distância e se concentram em uma determinada região, independentemente 
da sequência de seus nucleotídeos. 
 
4. Quais são as principais alternativas de métodos de extração de ácidos nucleicos? Cite 
vantagens e desvantagens. 
Atualmente existem várias alternativas de métodos de extração de ácidos 
nucleicos, como por exemplo o método de fenol/clorofórmio, o de colunas de sílica e o 
método de beads-magnéticas. 
Método fenol/clorofórmio → é o mais utilizado e constitui-se na desnaturação 
das proteínas devido a afinidade por solventes orgânicos. É vantajoso por ser barato e 
de fácil execução, contudo entre as desvantagens está o fato de, tanto o fenol quanto 
o clorofórmio, serem reagentes altamente tóxicos e que podem inibir atividades 
enzimáticas realizadas posteriormente ao método. 
Método de Colunas de Sílica → tem como vantagem ser um processo simples e 
rápido, que permite automação. Nele, o material com as células lisadas é colocado em 
contato com a coluna de sílica que, por ter carga positiva, retém os ácidos nucleicos de 
carga negativa. Depois, é feita uma eluição com um líquido que compete pelas cargas 
positivas da sílica, isolando-se, assim, os ácidos nucleicos. Uma desvantagem desse 
método consiste na membrana da coluna que pode entupir, levando a perda de 
material. 
Método de beads-magnéticas → é um método que utiliza a interação do DNA 
com partículas magnéticas revestidas de sílica, vantajoso por ser simples e sem 
possível oclusão da membrana, uma vez que essa barreira não existe. Além disso é um 
método bem seguro. Contudo, o equipamento utilizado para se realizar essa técnica 
tem um custo muito elevado, desvantagem que pode limitar o seu uso. 
5. Qual a função do isotiocinato ou tiocianato de guanidina na extração de RNA? 
O isotiocianato de guanidina são componentes presentes no tampão de 
extração do RNA que permitem a manutenção do RNA intacto nas etapas posteriores 
da extração, através da degradação endógena das ribonucleases. 
 
6. Que parâmetros físico-quimicos afetam a capacidade de moléculas de ácido nucleico 
formarem híbridos? 
A hibridização é um processo que ocorre devido a capacidade dos ácidos 
nucleicos de fita simples formarem fitas duplas com fitas de sequências 
complementares. Para que ele possa ocorrer é preciso que os ácidos nucleicos estejam 
devidamente desnaturados e, dessa forma, o fator temperatura é um dos 
influenciadores do processo, uma vez que quanto maior a temperatura maior a 
desnaturação das fitas. Outro fator que influencia na desnaturação dos ácidos 
nucleicos é a quantidade de pontes de hidrogênio, pois quanto maior a quantidade de 
pontes presentes, mais difícil é a desnaturação. Além disso, a concentração dos ácidos 
nucleicos presentes na solução também afeta a hibridização, uma vez que em altas 
concentrações a sequência de fita simples é capaz de formar fitas duplas mais 
rapidamente. 
 
7. Na extração de DNA plasmidial, que característica (s) promove a separação 
diferencial do DNA cromossomal? 
Na extração de DNA plasmidial o que promove a separação diferencial do DNA 
cromossomal é a utilização da lise alcalina com NaOH aliado a um SDS (detergente 
fortemente aniônico) para desnaturação do DNA seguida da neutralização do meio 
com a solução de acetato de potássio (CH3CO2K). A lise alcalina rompe a célula, 
desnatura o DNA cromossomal e as proteínas, liberando o plasmídeo no 
sobrenadante. A solução de acetato de potássio ocasiona a relicoidização do DNA 
plasmidial fazendo com que ele permaneça na solução. Uma vez que o meio teve seu 
pH neutralizado pelo acetato de potássio, as proteínas, bem como outros 
componentes celulares (como o DNA cromossômico) se precipitam, o que permite a 
separação desses componentes e possibilita a extração do DNA plasmidial. 
8. Aponte as etapas de separação da eletroforese bidimensional, ressaltando seus 
fundamentos. 
A eletroforese bidimensional consiste em 5 etapas: Preparação da amostra, 
primeira dimensão: focalização elétrica, segunda dimensão: eletroforese desnaturante 
em gel de poliacrilamida, detecção das proteínas e digitalização e análise da imagem. 
Preparação da amostra → as proteínas devem ser parcialmente purificadas, 
completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas. 
Primeira dimensão: focalização elétrica → Esta técnica consiste em uma 
separação eletroforética, na qual as proteínas são separadas de acordo com as 
diferenças de seus pontos isoelétricos (ao valor de pH no qual o somatório de todas as 
suas cargas parciais é igual a zero). Uma vez submetidas a um campo elétrico, as 
proteínas migrarão até encontrar uma faixa de pH referente ao seu pI e neste ponto 
ficarão com carga total neutra, interrompendo a migração no gel. 
Segunda dimensão: eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida → 
nessa etapa a separação, diferentemente da etapa anterior, ocorrerá devido à 
diferença da massa molecular. Nessa etapa, a tira de gel é mergulhada em uma 
solução de equilíbrio contendo SDS e depois colocada no topo de um gelde 
poliacrilamida – cuja espessura é geralmente de 1mm, e cada cadeia polipeptídica irá 
migrar em função de sua massa molecular. O poder de separação é altíssimo e duas 
proteínas que diferem em apenas um aminoácido carregado podem ser prontamente 
distinguidas. 
Detecção das proteínas → As proteínas separadas eletroforeticamente podem 
ser visualizadas por métodos gerais de coloração, tais como azul brilhante de 
coomassie, nitrato de prata, fluorescência ou autoradiografia, ou por métodos 
específicos como a coloração de glicoproteínas ou detecção com imunoquímicos. A 
partir desses métodos elas serão devidamente identificadas. 
Digitalização e análise da imagem → Os géis de eletroforese bidimensionais 
corados com azul brilhante de comassie ou nitrato de prata são digitalizados com o 
auxílio de um scanner específico e analisados com um software que permite a 
contagem do número de spots, a caracterização automática dos valores de pI e massa 
molecular, a análise dos níveis de expressão, assim como diversos outros recursos para 
o melhoramento da qualidade da imagem. 
 
9. Liste as condições em que gel de poliacrilamida e gel de agarose são mais adequadas 
para eletroforese? Quais as vantagens e desvantagens de cada um deles? 
Gel de Agarose → Os géis de agarose comumente preparados na rotina de 
laboratórios são indicados para separar fragmentos de DNA que variam entre poucas 
centenas de pares de bases até cerca de 40-50 kb. Ele é utilizado por ter uma maior 
extensão de separação para fragmentos longos de DNA, identificando os ácidos 
nucléicos presente neste. Dentre suas vantagens temos que sua polimerização é rápida 
e a solução para seu preparo não é tóxica. Contudo, como desvantagens vimos que o 
método de revelação dos resultados pode gerar danos à saúde do profissional 
responsável pelo método, na falta de cuidados, uma vez que necessita de um 
transluminador de luz ultravioleta. Esse transluminador de luz ultravioleta pode ser 
substituído por brometo de etídio, usado como intercalante de DNA, porém essa 
substância é mutagênica. 
Gel de Poliacrilamida → Comumente utilizado na separação de fragmentos com 
tamanhos menores, como proteínas e moléculas de DNA que possuam diferenças de 
até 1Kb. Sua resistência é maior, por isso é necessário o uso de maior voltagem. Esta 
técnica é utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar fragmentos 
muito pequenos de DNA e que apresentam uma mínima diferença de massa, além 
disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra. Apesar das vantagens, o 
gel de agarose é mais utilizado pois a a solução de preparo da poliacrilamida é 
extremamente neurotóxica, além de ter um tempo de polimerização mais longo o que 
dificulta a sua preparação. 
10. Cite e explique as etapas básicas da PCR. 
A Reação em Cadeia da Polimerase, PCR, ocorre em 3 etapas básicas. São elas: 
Desnaturação, Anelamento ou Hibridização e Extensão ou Polimerização. 
Desnaturação → O DNA genômico cuja sequência será amplificada, é 
desnaturado ao ser aquecido a cerca de 95°C por 30 segundos. Dessa forma, a fita 
dupla se abre se tornando uma única fita simples. 
Anelamento ou Hibridização → Nessa etapa, a fita oposta da sequência de DNA 
a ser amplificada é complementada por um par de iniciadores (primers), de modo que 
um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é 
complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos 
iniciadores que se anelam a fita. Esses processos ocorrem a uma temperatura de 60°C. 
Extensão ou Polimerização → Após a identificação do molde determinado na 
etapa anterior, bases complementares são adicionadas a ele, pela enzima DNA-
polimerase, de modo a formar uma nova fita, e portanto, originando novamente a 
duplicação da fita de DNA. Esse processo ocorre a uma temperatura de 72°C e logo 
após, O ciclo inteiro é reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então 
desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O 
procedimento é repetido muitas vezes até ́ que o nível desejado de amplificação seja 
obtido. 
 
11. O que é temperatura de melting? 
Define-se Temperatura de Melting (Tm), ou temperatura de pareamento, como 
a temperatura na qual metade das moléculas estão pareadas e a outra metade não. 
São encontradas na literatura diferentes formulações para o cálculo da Tm, todas elas 
sendo apenas uma aproximação da Temperatura de Melting real de um primer. 
 
12. Quais parâmetros são importantes para determinação de sequência dos 
oligonucleotídeos ou iniciadores para o sucesso da PCR? 
Um parâmetro importante para a determinação de sequência dos 
oligonucleotídeos ou iniciadores constitui-se na especificidade da sequência alvo a ser 
amplificada e no tamanho do primer a ser utilizado no processo, o qual é vantajoso 
que se tenha no mínimo 16 pares de base podendo chegar até a 30 pares, de modo a 
alcançar a especificidade desejada com o melhor e menor custo-benefício. Outro 
parâmetro importante é a Temperatura de Melt, que deve ser similar para possibilitar 
o anelamento do DNA na presença de moléculas desnaturadas. Além disso, a 
extremidade do primer deve conter a presença de G-C o que também facilita o 
anelamento com a fita molde. Finalmente, para que não ocorra a formação de 
grampos e dímeros as repetições em excesso devem ser evitadas. 
13. Discorra sobre a importância do uso de controles positivo e negativo para a PCR. 
A utilização de controles positivo e negativo é de extrema importância e 
essencial para que possíveis erros técnicos sejam minimizados, bem como as 
contaminações que possam vir a acontecer que culminariam em resultados falso 
negativos e falso positivos sejam evitadas. O controle negativo é importante durante 
as reações de amplificação, de modo que o ensaio que apresentar um resultado 
positivo, deve ser repetido. Caso o resultado positivo se mantenha, torna-se um 
indicador de, por exemplo, uma contaminação no laboratório ou de uma má qualidade 
dos materiais utilizados no processo. 
14. Explique como a concentração de magnésio afeta as reações de PCR. 
Estudos mostram que o Cloreto de Magnésio funciona como cofator da enzima 
DNA polimerase, o que pode afetar as temperaturas de desnaturação das fitas de DNA 
e o anelamento dos primers. Além disso, as concentrações elevadas desse reagente 
podem ser responsáveis pelo aparecimento de produtos inespecíficos que são 
derivados do aumento excessivo da atividade enzimática bem como pela formação de 
dímeros dos primers. 
 
15. Na técnica de Western blot e Southern blot explique a necessidade de uso de 
substâncias e condições de bloqueio da membrana. 
Nas técnicas de Western blot e Southern blot é necessária a utilização de 
substâncias e condições de bloqueio da membrana para que se possa garantir a 
especificidade dos resultados, de modo que utilizando essas substâncias, são evitadas 
possíveis ligações inespecíficas. Dessa forma, os anticorpos, no Western blot e as 
sondas no Southern blot se ligarão apenas nas moléculas especificas que estão sendo 
estudadas, o que irá gerar um resultado de observação válido. 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 
 
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Disponível em: 
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DE ARRUDA JÚNIOR, Reginaldo Gomes. Temperatura de Melting: um estudo 
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Conheça a técnica de PCR, suas aplicações e princípios. Kasvi, 2018. Disponível em: < 
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https://kasvi.com.br/boas-praticas-em-pcr-reacao-em-cadeia-da-polimerase/#:~:text=O%20controle%20negativo%20%C3%A9%20importante,m%C3%A1%20qualidade%20dos%20materiais%20utilizados
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