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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS MATERIAL DE APOIO Preparação de amostra para análise microscópica Curso: Farmácia Disciplina: Farmacobotânica Prof. Ionaldo J. L. Diniz Basílio Data: Ano: 2012.2 O objetivo desta aula é demonstrar os métodos básicos de preparação de amostras para análise microscópica de drogas vegetais. Introdução A análise microscópica eficaz exige não só uma boa compreensão de anatomia vegetal, mas também de habilidades no desenvolvimento de secções que permitem a observação de elementos estruturais da planta. Esta aula descreve os princípios para a escolha e preparação de secções de diversas partes da planta. Técnicas básicas de amostragem O principal objetivo da análise botânico é assegurar a identidade, pureza e qualidade da matéria-prima. Isso é relativamente fácil quando é realizada com uma única amostra. No entanto, é mais difícil do ponto de vista comercial quando se trabalha com vários lotes e em grande quantidade. Com quantidades tão grandes, não seria possível um analista realizar a análise de todo o material. Portanto, para analisar as amostras, várias técnicas de amostragem específicas são empregadas. Sem a utilização de tais técnicas de amostragem, a confiab ilidade analítica é muito menor. Antes de realizar a amostragem para análise, a totalidade do conteúdo deve ser inspecionada visualmente para observar a consistência de cor, odor, textura e uniformidade do lote. Quando os materiais são comercializados na forma integra é relativamente fácil à detecção de adulterantes, tais como a presença de outras espécies ou partes de plantas inadequadas, sujeira, assim como, sinais de degradação. Caso os problemas citados anteriormente sejam confirmados devemos desconsiderar a amostragem. Isto é mais difícil com material que tenham sido reduzidos juntamente com adulterantes, pois na maioria das vezes são impossíveis de serem detectados, uma vez que o material encontra-se pulverizado. Quando o material é relativamente homogêneo, técnicas de amostragem formais podem ser aplicadas. A obtenção de uma amostra representativa do material a granel pode ser feita usando planos de amostragem formalizados em farmacopeias (por exemplo, Farmacopeia Brasileira, 2010; Farmacopeia Americana – USP, 2004), outras fontes autorizadas (por exemplo, Organização Mundial de Saúde, 1998). O uso adequado de dispositivos de amostragem também pode ser útil (Figura abaixo). Planos de amostragem são baseados em fatores como tamanho e homogeneidade do lote, características do produto (por exemplo, moído ou material inteiro), o nível de risco associado potenciais adulterantes e nível de qualidade aceitável. A B Figuras. (a, b) Exemplos de dispositivos de amostragem utilizados para materiais botânicos. A maioria dos planos de amostragem utiliza uma fórmula para o tamanho da amostra com base no número de embalagens de um lote receb ido. Nos casos, em que um adulterante de alto risco pode estar presente, mais amostras podem ser tomadas (critério do analista). Por outro lado, um lote improvável de ser associada à adulteração (por exemplo, espécie cultivada com um h istórico comprovado de material vegetal autêntica) pode ter uma menor amostragem. Segundo a maioria dos planos de amostragem formais (USP, OMS, etc), uma amostra de material deve ser retirada da parte superior, mediana e inferior de cada embalagem a ser amostrada. Estas subamostras são comparadas uns com os outros para assegurar a uniformidade. Uma vez a uniformidade tenha sido estabelecida, as amostras devem ser agrupadas em uma amostra global e processadas em laboratório de análise, de acordo com o esquema abaixo. UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Amolecimento amostra Depois de uma amostra do material vegetal tem sido escolhido para análise, o primeiro passo na preparação do material teste é o amolecimento. Materiais frescos e secos podem ser examinados microscopicamente. No entanto, a maioria dos materiais vegetais comercializados para produção de medicamentos fitoterápicos e suplementos encontra-se secos. Há algumas exceções, onde materiais frescos são utilizados na produção de muitas tinturas homeopáticas "mãe". Além disso, o material pode ser comercializado na sua forma integra, tornando a avaliação macroscópica importante para a determinação da identidade, embora a microscopia deva ser aplicada. A principal d iferença entre a análise de amostras frescas e secas é que a última precisa ser reidratada para o amolecimento dos tecidos, enquanto que o material fresco é suficientemente flexível e pode ser facilmente seccionado. Quando os materiais frescos são preparados para análise devemos tomar o cuidado para assegurar que nenhuma degradação estrutural da amostra ocorreu devido ao seu manuseio ou conservação. Isto pode ser assegurado, através de inspeção visual e pelo uso de um estereomicroscópio, antes da preparação da amostra. A principal forma de amolecimento dos tecidos é pela sua preparação em água ou numa solução de água, álcool e glicerina, ou por fervura numa solução de cloral hidratado, dependendo das estruturas que se deseja analisar. Parte do material seco, em especial de espécies ricas em ó leo pode ser seccionada sem o amolecimento prévio. Um método alternativo e mais eficaz para o amolecimento é a colocação de toda a amostra no centro de uma lâmina com uma quantidade suficiente de água ou solução de cloral hidratado (60%). A lâmina é cuidadosamente e repetidamente passada sobre uma chama ou colocado em uma chapa aquecedora, levando a solução até a fervura. A solução deve ser escolhida de acordo com as es truturas. Caso a intenção é examinar uma secção que contenha amido ou mucilagem, o amolecimento deve ser realizado com água e sem calor. Fragmentos maiores podem ser amolecidos, colocando a amostra num tubo de ensaio com cloral hidratado até ebulição (Figura abaixo ). A B C Figuras. Amolecimento de amostras com hidrato de cloral e fervura. (a) Uso de cloral hidratado para o amolecimento da raiz, (b) Secção aquecida com uma chama para a limpeza da amostra, (c) Amolecimento de fragmentos maiores. Secção em Microscopia Características anatômicas que são utilizadas para a identificação de partes de plantas encontram-se quer na superfície ou em os tecidos mais internos. No caso de estruturas encontradas na superfície, como é típico de folhas delicadas e estruturas florais, suficientemente finas para permit ir a passagem de luz, não é necessário o seccionamento da amostra. Materiais ricos em compostos voláteis que pode ser destruídos quando expostos ao calor, tais como mucilagem e amido, que são frequentemente visualizados como pós, para o qual o amolecimento e seccionamento não são necessários. Para a análise pós, uma pequena quantidade da amostra em pó é aplicada a uma lâmina e cuidadosamente misturada com a água. A amostra pode então ser visualizada. No caso de materiais mais espessos, tais como caules, rizomas, raízes, cascas, frutos, sementes e algumas folhas, o seccionamento é necessário. Três tipos principais de secções são usados em microscopia: transversal; longitudinal radial e longitudinal tangencial. As secções transversais são tomadas perpendicularmente ao eixo longitudinal (maior) da parte da planta utilizada. Secções longitudinais radiais são realizadas paralelamente ao eixolongitudinal da planta na sua parte mediana. Seções tangenciais são também tidas em paralelo ao longo eixo da amostra, como no caso anterior, mas na região periférica em relação a linha central (ao longo de um tangente), exemplificado abaixo . Figuras . Três tipos principais de secções são usados em microscopia: (a) transversal; (b) longitudinal radial, (c) longitudinal tangencial. A B C UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Cada tipo de secção oferece ao analista uma visão diferente do arranjo dos tecidos vegetais. Após a secção, a maioria dos materiais requerem limpeza de p igmentos e conteúdos celulares (por exemplo, a clorofila) com uma solução de cloral hidratado ou hipoclorito de sódio, a fim de facilitar a visualização das estruturas. Alguns materiais também requerem o uso de corantes específicos ou reagentes para serem v isualizados. Visualização da superfície. No caso do órgão ser fino o suficiente para a passagem de luz, após a sua preparação com a solução de cloral hidratado, a amostra pode ser montada diretamente com a solução supracitada sobre uma lâmina de vidro e coberta por uma lamínula; posteriormente a solução é aquecida até fervura. Características diferentes podem estar presentes em ambos os lados do órgão, sendo importante a visualização de ambas . Secção paradérmica: Essa forma de secção é predominantemente utilizada para visualizar caracteres da superfície de folhas, frutos e sementes que se apresentam espessa. A maioria das folhas e flores é suficientemente fina e podem ser vistos de forma adequada, sem maiores preparações da amostra. Algumas espécies, como Eucalipto (Eucalyptus globulus) e Senna (Senna alexandrina), têm folhas mais espessas, coriáceas (consistência de couro) e, portanto, são visualizadas com maior nitidez, após preparação de secções paradérmicas (Figura abaixo ). A B Figuras. Vistas de superfície de folhas de Senna alexandrina com e sem secção. (a) vista da superfície sem seccionamento; (b) vista de superfície com seccionada. Secções paradérmicas de fo lhas podem ser preparadas dobrando-se uma parte da amostra em torno da ponta do dedo indicador ou um objeto redondo, como um lápis ou caneta, e prendendo-o com o polegar e o dedo médio, com o auxilio de uma lâmina de barbear. Assim, a epiderme é cuidadosamente seccionada, com o cuidado para não cortar o dedo (figura abaixo). A B C D Figuras. Preparação de seções paradérmicas. Secção a mão-livre Materiais mais delicados que são difíceis de manusear requerem uma montagem e às vezes auxílio de estereomicroscópio que permite ao microscopista produzir secções suficientemente uniformes, que são extremamente importantes para a visualização de caracteres anatômicos (figura abaixo). A Figura. Secção a mão-livre com auxílio de estereomicroscópio. UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Corte usando um suporte O segundo método para a preparação de lâminas é pelo uso de um material de fixação ou suporte, como isopor para segurar o material vegetal e permitir a obtenção de secções finas e uniformes. Historicamente, materiais como o pecíolo de Embaúba (Cecropia sp.) ou de girassol (Helianthus sp.) foram utilizados como suportes para corte de folhas e flores delicadas. Hoje em dia, a montagem pode ser realizada com pedaços de poliestireno (figura abaixo). A B C D Figuras. Preparação da amostra utilizando como suporte um pedaço de isopor (poliestireno). (a) Prepara-se uma montagem de poliestireno tal como ilustrado. O corte vertical deve ser central e ângulo reto em relação ao plano superior; (b) o corte vertical deve ser estreito e suficientemente profundo para abrigar o material a ser seccionado; (c) a amostra deve ser colocada na região do corte citada anteriormente, paralelamente ao eixo maior do suporte, a fim de obter secções transversais de qualidade; (d) inserção do material de forma incorreta, com ângulo inadequado. Identi ficação microscópica de matéria-prima comercializada em pó Procedimento geral 1. Colocar 1-2 gotas de água, ou glicerol-etanol (1:1), solução hidroalcoólica, hidrato de cloral ou hipoclorito de sódio 2 %. Obs.: Outros corantes ou reagentes histoquímicos podem ser utilizados. 2. Acrescentar um pouco do pó e misturar com uma agulha histológica. 3. Cobrir a lamínula e observar ao microscópio. Solução de cloral hidratado No exame microscópico de matérias vegetais, as características mais utilizadas no diagnóstico são os tipos de células específicas e de cristais de oxalato de cálcio, e estes são melhores observados quando montadas em cloral hidratado. No entanto, a limpeza do material é indispensável para a preparação, permitindo que a solução de cloral hidratado penetre nos tecidos e remova as bolhas de ar aprisionadas. Procedimento: 1. Adicionar duas ou três gotas da solução no material em uma lâmina e cobrir com uma lamínula; 2. Passar o material montado com muito cuidado em uma chama baixa, em movimento de vaivém (o uso de um micro aquecedor é recomendado). Logo que começarem a aparecer bolhas, pare o aquecimento e, se necessário, adicione mais solução sob a lamínula; 3. Se o material contém quantidades consideráveis de amido ou mucilagem, provavelmente será necessário repetir várias vezes o aquecimento. Obs.: É importante que se garanta a presença de líquido suficiente para impedir a secagem da preparação. 4. Quando obtiver uma preparação satisfatória, levante a lamínula e acrescente uma ou duas gotas de cloral hidratado com glicerina para inib ir a formação de cristais de cloral hidratado, em análises posteriores. Obs.: O processo de clareamento remove os grânulos de amido e todas as inclusões celulares solúvel em água. Etanol e água Para determina a presença de grânulos de amido de um material em pó, monte a lâmina da seguinte forma. Procedimento: 1. Acrescentar uma ou duas gotas de álcool; 2. Misturar até que o material fique bem diluído; 3. Adicionar uma ou duas gotas de água, e aplicar a lamínula; 4. Para confirmar a identidade dos grânulos, adicionar uma gota de solução de iodo sob a lamínula, e observar. 5. A coloração azul-enegrecida indica resultado positivo. Obs.: Caso o material a ser analisado contenha uma elevada quantidade de óleo (material pulverizado de frutos e sementes), a lâmina pode ficar embaçada após a adição de água, o que tornará a análise insatisfatória. Por isso, o óleo deve ser removido de tais materiais utilizando-se um solvente adequado (éter ou clorofórmio), antes da analisar dos grânulos de amido. Floroglucinol e ácido clorídrico Para determinar células e tecidos lignificados. Procedimento: 1. Acrescentar uma ou duas gotas de solução de floroglucinol, e misturar; UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 2. Permitir que o solvente evapore, até próximo a secura; 3. Adicionar uma ou duas gotas de ácido clorídrico e aplicar uma lamínula; 4. Examinar imediatamente; 5. A coloração vermelha indica a presença de lignina. Obs.: A reação é semi-quantitativa, ou seja, quanto mais intensa for à coloração, mais a célula ou tecido é lignificado, dando uma cor vermelho escuro para células e tecidos bastante lignificados e rosa pálido quando menos lignificados. O material perde a coloraçãogradualmente. Obs.: Assim como no exame dos grânulos de amido, acima descrito, quando o ácido clorídrico é adicionado após a solução alcoólica de floroglucinol, manchas pode ocorrer se grande quantidade de óleo estiver presente na amostra, sendo necessária a remoção do óleo.
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