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CIANOBACTÉRIAS Organização e Estruturas Toxicidade Aplicação em Ciências de Alimentos BM320 – MICROBIOLOGIA Sandra Soares Martins 30/08/2016 Cianobactérias: “máquinas” de síntese de compostos secundários • Pigmentos indústria alimentícia • Produtos farmacêuticos • Suplementos alimentares • Biocombustíveis • Compostos que afetam qualidade da H2O - matéria prima p/ consumo humano e uso industrial (alimentos/farmácia): – Odores – Sabores – Toxicidade • Corantes: ficobiliproteínas (hidrossolúveis): – Ficocianina azul – Aloficocianina – Ficoeritrina: vermelha • Polissacarídeos – grande variedade de açúcares – D-glicose-D-galactose-D-xilose-ácido D- glucurônico (p.ex. Nostoc commune) Aplicação em Ciências de Alimentos Aplicação em Ciências de Alimentos • Suplemento alimentar: Spirulina spp Produção de custo vantajoso • Bactérias fotossintéticas - sais minerais, água e luz. • Efluentes da indústria de alimentos pode ser meio de cultura: – Arroz parboilizado: Aphanotece sp; – Indústria cítrica, de biodigestor de fezes de suínos (alcalinizado); • Efluente da produção de biomassa de cianobactéria tamponante na silagem de milho Bioacumulação1 e Biomagnificação2 Hipóteses: hábitos, doenças transmissíveis, exposições ambientais, herança genética, alimentação. Sopa de Morcego Morcego Frugívoro Frutos de Cica Cianobactéria Cianotoxina neutóxica Pacientes com tremores e sintomas de doença neurológica Ilha de Guam/USA , Pacífico 1 1 1 2 Definição de cianobactéria • São procariotos fotoautotróficos produtores de oxigênio (O2). • São conhecidas também como: – Blue-green algae ou algas verde-azuladas – Algas azuis – Mixofíceas – Cianofíceas – Cianoprocariontes/ Cianoprocariotos Diversidade de Forma Morfologia celular Cilíndrica Esférica Esfera achatada no centro Cubo Morfologia colônias agregadas unicelular Filamentos isolados colônias agregados •Apresentam maior diferenciação celular. Tricoma indica a fileira de células. Filamentos apresentam tricomas Filamentos apresentam formas diferenciadas Espiral Trançadas Spirulina sp Filamentos apresentam arranjos secundários Agregação Embaraço ERA DAS CIANOBACTÉRIAS • Registros fósseis dão indícios do surgimento das cianobactérias no Pré-cambriano Origem da Terra CIANOBACTÉRIAS Eucariotos Invertebrados Presente 640 milhões AA 1,9 bilhões AA 3,5 bilhões AA 4,5 bilhões AA Fig. 1 -Escala evolutiva da origem da vida na Terra. Fig. 2 – Estromatólitos na Australia. Atmosfera anóxida fortemente redutora Hidrosfera com pouco O2 livre Microbiota do planeta tem procariotos primitivos: •Arqueobactérias •Bactérias sulfurosas •Bactérias não sulfurosas •Cianobactérias • Surgimento de membrana com atividade fotossintética • São os primeiros produtores a liberar oxigenio: –Alteram profundamente a atmosfera terrestre: [O2] e lentamente se forma a camada de ozone (O3) –A hidrosfera passa a ter O2 dissolvido em quantidades nunca antes existentes. Com as cianobactérias... Organização da Vida na Terra Cianobactérias: Grupo das bactérias Gram - (sequenciamento das bases do rRNA 16S e 5S) • Adaptadas a variação de: • temperatura: de 15 a 30°C • pH de 6 a 9 • Encontradas em ambientes extremos • Fontes termais: pH 5,0 e T=85°C • Oceano Antártico: -20°C • Grandes profundidades. • Altamente resistentes aos raios UV Presença em todos os ambientes da Terra Presença em todos os ambientes da Terra • Água doce: maior abundância e diversidade • Água marinha: – Região planctônica: fixação N2 – Todas as profundidades, inclusive extremas. • Àgua salobra: – Importante base da cadeia alimentar dos berçários marinhos; – presentes em lâminas de sal. • Solo: – ambientes que parecem sem vida, mas que “revivem” com as primeiras chuvas – Ecologicamente de grande importancia: – Adicionam biomassa ao ecossistema – Fixam N em áreas pobres em nutrientes • Rochas – Endolíticas: encontradas dentro de rochas na Antártida Presença em todos os ambientes da Terra Nódulos de Nostoc ESTRUTURA CELULAR Semelhante às Eubactérias Gram negativas Protoplasma Mucilagem • Reveste externamente a parede bacteriana • Pode estar presente ou não, dependendo da espécie ou gênero. • Composição principal: polissacarídeos • Termos encontrados: – Envelope mucilaginoso (ao redor da célula) – Bainha mucilaginosa (forma agregados) • Função: proteção mecânica; deslizamento; biofilme. Envelope mucilaginoso Bainha mucilaginosa Inclusões protoplasmáticas Grânulos de cianoficina • Cianoficina: co-polímero de ácido aspártico e arginina, armazena nitrogênio, sendo degradado em ambientes c/ deficit de nitrogênio. • Presença depende da espécie • Os grânulos de cianoficina assemelham-se ao glicogenio, sendo reserva de energia. • Não possuem cloroplastos • Tilacóides se organizam em membranas. • Pigmentos fotossintéticos se localizam na membrana tilacóide : – Clorofila a – Ficobilinas • Ficocianina - azul • Ficoeritrina - vermelha – Xantofilas (pigmentos carotenóides acessórios) Membrana fotossintética • O número de membranas depende da intensidade luminosa • Baixa muitas membranas • Alta poucas membranas • Ficobilissoma: grânulos associados à superfície da membrana das tilacóides contendo pigmentos de ficobilina acessórios da fotossíntese • Ficobilinas • Ficocianina • Ficoeritrina Membrana fotossintética Permitem fotossintetizar em ambientes aquaticos de grande profundidade Pigmentos fotossintéticos Mobilidade • Cianobactérias se movem livremente com a água, podendo flutuar na superfície e mover –se com a corrente superficial. • Não possuem cílios e flagelos • Movimento vem da expulsão de material orgânico de dentro da célula pode ser –deslizantes ou – rotacional. Mobilidade O movimento no sentido vertical na coluna de água é feito pelo enchimento ou esvaziamento dos vacúolos gasosos ou vesículas de gás ou aerótopos. Aerótopos • Presentes na célula quando nos ambientes naturais • Desaparecem em culturas in vitro • Processo de enchimento e esvaziamento são controlados pela fotossíntese Nas florações os vacúolos não são regulados, permanecendo todas as células na superfície • Segue a nomenclatura botânica: por isso o grupo é denominado Cyanophyceae. • Atualmente críticas estão gerando revisões para que haja inserção da nomenclatura bacteriológica. CRITÉRIOS: Morfológicos Bioquímicos Genéticos Fisiológicos Ecológicos TAXONOMIA Estruturas especializadas Heterócito ou heterocisto Microscopia de luz 1 2 2 Microscopia eletrônica 1 2 2 Microscopia de luz 1 2 2 •Célula especializada em fixação de nitrogênio atmosférico (N2) ( ). •Ambiente interno é anóxido →ativaçãoda nitrogenase •Parede espessa (1) •Poros de comunicação seletiva com células vegetativas vizinhas (2). Acinetos • Esporo de resistência: – Célula vegetativa aumentade tamanho – Estoca grande quantidade de grânulos de cianoficina: reserva de proteína – Espessa a parede. – Altamente resistentes à dessecação (anos em sedimentos) – Produzidos sob condições desfavoráveis do meio. Relações simbióticas • LÍQUENS = FUNGO + CIANOBACTÉRIA Cianobactéria Camada de Cianobactéria Coevolução das Cicas e Cianobactérias • Associação simbiótica entre Cicas e Nostoc sp. • Nostoc: zona circular da raiz nódulos induzem mitose na raíz e fixação N2. • Suposição sobre a associação: 1. Impediu a extinção das Cicas. 2. Permite estabelecimento em solos pobres em nutrientes. Biofilmes • Em águas lênticas: lagos, reservatórios, riachos calmos, mangues. • Nas paredes de tanques de tratamento de água ou esgoto • Na superfície da água • Risco de eliminação de toxinas Florações de Cianobactérias • Definição: – Intenso crescimento bacteriano na superfície da água – Formação de densa camada de células com vários centímetros de profundidade – Liberação de toxinas com riscos à saúde animal e humana. Bloom de Microcystis A eutrofização artificial produz mudanças nas qualidades da água: • a redução de oxigênio dissolvido, • perda das qualidades cênicas, • aumento do custo de tratamento, • morte extensiva de peixes • aumento da incidências de florações de microalgas e cianobactérias. Bloom de Microcystis Florações x Cianotoxinas Alteração das propriedades organolépticas da água Genero • Microcystis • Oscillatoria • Phormidium • Pseudanabaena • Anabaena • Aphanizomenon Gosto e/ou odor • Capim • Terra/bolor • Terra/capim • Bolor • Pesticida/capim/bolor • Capim/bolor Florações metabólitos geosmina; 2-methylisoborneol Pertencem a 3 classes químicas: • Peptídios cíclicos • Alcalóides • Lipopolissacarídeos (LPS) Tipos de ação farmacológica: • Neurotóxicos ação rápida morte por parada respiratória após poucos minutos de exposição. • Hepatotóxicos ação lenta lesões ou tumores no fígado. • Dermatotóxicos Cianotoxinas Chapter 21: Cyanotoxins: sampling, sample processing and toxin uptake Jussi AO Meriluoto, Lisa EM Spoof. Department of Biochemistry and Pharmacy, Åbo Akademi University, 20520 Turku, Finland. Cianotoxinas: Mais comum • Hepatotóxicas (+ de 80 análogos): – Microcistina – Nodularina • Citotóxica: cylindrospermopsina • Neurotoxica: anatoxin–a Outras menos comuns • anatoxin–a(S), • Saxitoxina (família de moléculas), • Alcalóides dermatotóxicos, • Lipopolissacarídeos • beta–N–methylamino–L– alanine (BMAA) Fonte: Chapter 21: Cyanotoxins: sampling, sample processing and toxin uptake. Jussi AO Meriluoto, Lisa EM Spoof. Department of Biochemistry and Pharmacy, Åbo Akademi University, 20520 Turku, Finland, 2008. Degradação • Microcystina – Estabilidade: em pH neutro e após fervura (toxicidade) – Resistência: hidrólise química e oxidação – Lenta degradação fotoquímica por irradiação solarÇ 6 a 20 semanas. • Anatoxina-a – Estabilidade: • No escuro; • em pH ácido; decomposição leva 14 dias em pH 8-10 se for em conc. baixas. Apresentam diferenças nas estabilidades químicas e degradação biológica nos sitemas aquáticos. Exposição humana às cianotoxinas pode ser: Contato dermal Inalação Ingestão (H2O abastecimento ou recreativa) Intravenosa - o caso de Caruaru Bio-acumulação alimentar Riscos ambientais: • Alta freqüência em Porto Alegre Cianotoxinas Isolamento a partir de amostras ambientais FIG. 1. Cultura em meio líquido: pré-cultivo ou expansão. • Coleta do ambiente (água, solo, raspado de algas ou rochas)meio líquido • Fase de adaptação ao meio de cultura: crescimento entre 30 a 45 dias (FIG. 1) • Repique em meio sólido: crescimento entre 7 a 15 dias (FIG. 2) • Isolamento das colonias em meio sólido: critério é forma e coloração; crescimento entre 7 a 15 dias • Expansão da cultura pura: semeadura em meio líquido FIG. 2. Cultura em meio sólido para isolamento. FIG. 3. Cultura em fluxo contínuo em meio líquido. Culturas permanentes 1. Cultivo para obtenção de toxinas ou subprodutos • Estoque em meio semi- sólido (Temperatura ambiente) e em solução crioprotetora a -70°C e/ou N2 líquido Métodos de determinação das toxinas Biológicos • Toxicidade (ratos;camundongos) • Exposição a doses/exposições a conc.multiplas do agente tóxico. – Aguda: 24 horas 14 dias – Sub-aguda: 14, 21 e 28 dias – Sub-crônica: 90 dias. – Crônica: 2 a 3 anos. • Bioensaios – Camundongo – Organismos aquáticos: Artemia salina, Daphnia. – Organismos sub-aquáticos: Aedes aegyptii, Drosofila melanogaster. Bioquímicos • ELISA – Microcistina e nodularina • Inibição de fosfatase • Inibição de acetilcolinesterase (neurotoxinas) Físico-Químicos •Cromatografia – HPLC •Eletroforese capilar: microcistina e anatoxina-a; rotina em monitoramento das águas •MMPB: detecção de microcistina total Métodos de determinação das toxinas Etapas do Processo Analítico para Quantificação de Cianotoxinas Fonte: Loftin et al.. Analytical Methods for Cyanotoxin Detection and Impact on Data interpretation. National Water Quality Monitorin Conference, 2010, USA. Exemplos práticos de Detecção • SANASA – Identificação da toxina por HPLC (microcistina) • CETESB – Identificação taxonômica e contagem por microcopia ótica – ELISA para Microcistina. – Identificação e Contagem por Q-PCR. Estudos aplicados para Controle de Cianotoxinas em água: • The Centre for Cyanobacteria and Their Toxins (CCT) – República Tcheca – 1. Estudo da ação da aeração de sedimentos e colunas de água para diminuição da população de cianobactérias. – 2. Uso de nanopartículas de compostos com atividade fotocatalítica de dióxido de titânio e prata 1- Efeitos da aeração de sedimentos na mudança dos parâmetros físico-químicos dos sedimentos e da coluna de água e as mudanças na abundância e na estrutura microbiana das comunidades de cianobactérias. In: http://www.sinice.cz/index-en.php?pg=activities-- scientific-activities--research 2- http://www.sinice.cz/res/file/projects/NANAPL10-EN.pdf Centros de Referência: Nacional: • CETESB Internacional • The Centre for Cyanobacteria and Their Toxins (CCT) – República Tcheca • EPA: Environmental Protection Agency – USA Literatura recomendada • Calijuri, M. C. et al. Cianobactérias e cianotoxinas em águas continentais. RIMA, 2006. • Sant’Anna,C.L.et al. Manual Ilustrado para Identificação e Contagem de Cianobactérias Planctônicas de Águas Continentais Brasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia – SBFic. • Ibelings, B. W. and Chorus, I. Accumulation of cyanobateril toxins in freshwater seafood andits consequences for public health: A Review. Environmental Pollution xx (2007)1-16. • WHO. Guidelines for safe recreational water environments. • CETESB. Qualidade das águas interiores do Estado de São Paulo. Série Relatórios, Anexo IV. INFORMAÇÕES EXTRAS Neurotoxinas: Alcalóide Ação Fisiológica da anatoxina • Os sinais de envenenamento em animais selvagens e domésticos: – desequilíbrio, – fasciculação muscular, – respiração ofegante e convulsões. – Morte por parada respiratória após poucos minutos a poucas horas, dependendoda dosagem e consumo prévio de alimento. • Os sinais clínicos de intoxicação: – progressão de fasciculação muscular, – decréscimo de movimentos, – respiração abdominal exagerada, – cianose, – Convulsão morte. • Ação: – potente bloqueador neuromuscular pós-sináptico de receptores nicotínicos e colinérgicos. – ligação irreversivel a receptores de acetilcolina, pois não é degradada pela acetilcolinesterase. – A DL50 intraperitoneal em camundongos (toxina purificada): 200 mg/Kg de peso corpóreo, com tempo de sobrevivência de 1 a 20 minutos. Valores Permitidos pela Legislação • Poucas referências propõem valores limites para cianobactérias. • Organização Mundial da Saúde, por meio do adendo da segunda edição do Guidelines for drinking-water quality (WHO, 1998), concluiu que não havia dados suficientes que possibilitassem a definição de valores de referência para qualquer outra cianotoxina, além da microcistina-LR de 1 μg/L, considerando a exposição através da água de consumo humano. • A terceira edição do Guidelines for drinking-water quality manteve o mesmo valor para microcistina-LR e não apresentou valores para as demais cianotoxinas (WHO, 2003) • (Fonte: Florações de Cianobactérias e sua inserção na Legislação Brasileira, Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da Saúde, Governo Brasileiro, Abril de 2004) Microcistina LR: gráfico cromatográfico Chapter 21: Cyanotoxins: sampling, sample processing and toxin uptake. Jussi AO Meriluoto, Lisa EM Spoof, Department of Biochemistry and Pharmacy, Åbo Akademi University,20520 Turku, Finland