MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA DE INTERESSE INDUSTRIAL

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA
Andréia Colombo
Karine Zanella
Tiago Bogler Souza
Wilson Junior dos Santos
MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA DE INTERESSE INDUSTRIAL
TOLEDO – PARANÁ
2008
Andréia Colombo
Karine Zanella
Tiago Bogler Souza
Wilson Junior dos Santos
MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA DE INTERESSE INDUSTRIAL
Trabalho acadêmico apresentado disciplina Miicrobiologia Industrial. Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE) - Campus de Toledo.
Professor: Sérgio L. Lucena
TOLEDO – PARANÁ
2008
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO	7
2. MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO INDUSTRIAL	8
3. FONTES DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE	10
4. CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE MICRORGRANISMOS E DE MEIOS DE CULTURA PARA APLICAÇÃO INDUSTRIAL	12
4.1. Características desejáveis de microrganismos	12
4.2. CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE MEIOS DE CULTURA	16
5. PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO MICROBIANA E SEUS MEIOS DE CULTURA	18
5.1. PRODUÇÃO DE ETANOL	19
5.1.1. Matérias-primas 	21
5.1.2. Composição da matéria-prima	23
5.1.3. Preparação dos substratos	24
5.1.3.1. Preparação do mosto de matérias-primas diretamente fermentescíveis	24
5.1.3.2. Preparação do mosto de matérias-primas indiretamente fermentescíveis	25
5.1.4. Agentes de fermentação alcoólica	26
5.1.5. Correção do mosto ou preparo do meio de cultura	27
5.1.6. Preparo do inoculo	29
5.1.7. Etapas de fermentação alcoólica	30
5.1.8. Destilação	30
5.2. PRODUÇÃO DE ÁCIDOS POR MICORGANISMOS	31
5.2.1. Produção de ácidos por bactérias	32
5.2.1.1. Fermentação lática	32
5.2.1.2. Fermentação acética	34
5.2.2. Produção de ácidos por fungos	36
6. PRODUTOS DE SÍNTES MICROBIANA E SEUS MEIOS DE CULTURA	36
6.2. ANTIBIÓTICOS	36
6.2.1. Conceito	36
6.2.2. Produção de antibióticos	36
6.2.3. Penicilina	37
6.2.4. Cefalosporina	39
6.3. ENZIMAS MICROBIANAS	40
6.3.1. Celulases	42
6.3.2. Pectinases	43
6.3.3. Enzimas amilolíticas 	44
6.3.3.1. Produção de amilase fúngica	46
6.3.3.2. Produção de amiloglicosidase	47
6.3.3.3. Produção de isomilase (ou pullulanase)	48
6.4. AMINOÁCIDOS	48
6.4.1. Produção do Ácido Glutâmico	48
6.4.2. Produção de Lisina	50
6.4.3. Produção de Triptofano	51
7. MICROORGANISMOS E A RECUPERAÇÃO DE MATÉRIA-PRIMA	51
7.1. MICROBIOLOGIA E MINERAÇÃO	51
7.2.MICROBIOLOGIA DO PETRÓLEO	52
7.2.1. Formação de Petróleo	53
7.2.2. Exploração do Petróleo	53
7.2.3. Recuperação do Petróleo	53
7.2.4. Derramamento de Óleo	54
8. DETERIORAÇÃO MICROBIANA DE MATERIAS	54
8.1. PRODUTOS DE PAPEL	55
8.2. TECIDOS E CORDAS	55
8.3. SUPERFÍCIES PINTADAS	56
9. BIORREMEDIAÇÃO	56
10. CONCLUSÃO	60
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema geral de um processo fermentativo	8
Figura 2. Saccharomyces cerevisae	26
Figura 3. Esquema de preparo do inoculo	29
Figura 4. Conversão de açucares em ácido lático	33
Figura 5. Método de Frings	35
Figura 6. Perfis de concentração principais das espécies numa fermentação semi-descontínua de penicilina G	40
Figura 7. Produção de enzimas por Aspergillus niger 	47
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. A função das leveduras na produção de bebidas alcoólicas	 21
Tabela 2. Alguns ácidos obtidos por degradação microbiana	36
Tabela 3. Exemplos de antibióticos e seus agentes produtores	37
Tabela 4. Exemplos de enzimas microbianas produzidas industrialmente e suas aplicações 	42
Tabela 5. Exemplos de enzimas microbianas produzidas industrialmente e suas aplicações	42
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1. INTRODUÇÃO
Os meios de culturas são responsáveis por fornecer os nutrientes necessários para o desenvolvimento do microrganismo fora do seu meio natural, que em conjunto com características desejáveis, proporciona maior produtividade e conseqüente lucratividade ao empreendedor.
Entre os principais componentes de um meio de cultura estão as fontes de carbono e energia como os açúcares, as fontes de nitrogênio, fósforo e sais minerais. Outros componentes mais específicos podem ser encontrados em um meio para determinado organismos, estes são os Fatores de Crescimento como as vitaminas, aminoácidos. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais 
Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia), dentre outras. 
	O objetivo principal deste trabalho consiste na descrição das características gerais que microrganismo e meios de cultura devem apresentar para que seja possível utilizá-los em uma operação industrial de grande porte. 
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MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO INDUSTRIAL
Para o sucesso de um determinado processo industrial é necessário que o meio de cultura escolhido forneça os nutrientes necessários para o desenvolvimento do microrganismo, para que este converta a maior quantidade de substrato no produto desejado.
	SCHMIDELL et al., 2001, apresenta um esquema geral para um determinado processo fermentativo que está representado pela Figura 1, na qual se buscou ressaltar alguns pontos essenciais, que permitem um início de discussão dentro do objetivo apresentado acima. 
Figura 1. Esquema geral de um processo fermentativo 
(Fonte: SCHMIDELL et al., 2001).
Pela análise da Figura 1, nota-se que o sucesso desse processo fermentativo depende muito de uma correta definição de quatro pontos básicos: o microorganismo, o meio de cultura, a forma de condução do processo fermentativo e as etapas de recuperação do produto. Na realidade, esses quatro pilares interagem enormemente um com o outro, sendo necessário buscar defini-los de forma conjunta, levando em consideração aspectos biológicos e econômicos. Para tornar clara essa idéia, menciona-se que sempre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas lembrando-se que o microorganismo deve encontrar neste meio, condições adequadas para realizar a conversão pretendida. 
Seria difícil imaginar a produção de etanol no Brasil, em termos de formas de condução do processo fermentativo, caso não se operasse com biorreatores em sistema descontínuo alimentado. Da mesma forma, o grande avanço alcançado pela digestão anaeróbica no tratamento biológico de águas residuárias, deveu-se muitíssimo ao surgimento dos reatores contínuos operados com fluxo ascendente e reciclo interno de células. (SCHMIDELL et al., 2001).
	As operações finais para a recuperação do produto são de grande importância. Por exemplo, a etapa de recuperação do etanol, após uma fermentação alcoólica, é a destilação, mas ela incide significativamente no custo do produto final, em virtude da energia necessária para a sua execução. No entanto, a importância de uma boa definição das operações de recuperação do produto, fica mais clara quando se aborda a produção de valores de alto valor agregado, como a produção de antibióticos, enzimas, ou outras proteínas.
	Cabe, portanto, abordar algumas reflexões sobre microorganismos e meios de cultura que podem ser eventualmente empregados em uma produção industrial.
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FONTES DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE
Os microorganismos que possam ter interesse industrial podem ser obtidos basicamente das seguintes maneiras (SCHMIDELL et al., 2001).:
Isolamento a partir de recursos naturais;
Compra em coleções de culturas;
Obtenção de mutantes naturais;
Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais; e
Obtenção de microorganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética.
Para Schmidell et al., (2001) o isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais sempre foi uma atividade de grande importância para a obtenção e novas linhagens de interesse industrial. Trata-se de uma atividade que envolve muito trabalhoexperimental, significando um custo relativamente elevado, porém pode conduzir ao isolamento de linhagens melhor produtoras de um dado produto, mas, mais importante do que isto, pode conduzir à descoberta de novos produtos, o que confere a esta possibilidade uma relevância inquestionável. Cumpre lembrar que as grandes empresas produtoras de antibióticos, ou enzimas mantêm programas de isolamento de linhagens produtoras de novos antibióticos pó exemplo. É claro que o isolamento de linhagens deve ter início em certas premissas, definindo-se o que se pretende obter,pois o simples isolamento poderá levar à disponibilidade de um número inimaginável de culturas, o que dificulta a convergência para o processo ou o produto que se pretende	 produzir.
A compra em coleções de culturas é bastante viável. É de esperar que o microrganismo utilizado para a produção de um dado antibiótico não estará disponível em uma coleção de culturas, sendo com muita freqüência, oriundo de programas que melhorem sua genética.
Segundo Schmidell et al., (2001) quando uma dada célula prolifera, tem-se uma pequena possibilidade de surgimento de mutantes naturais, e essas pequenas alterações não são interessantes do ponto de vista de um processo fermentativo, mas podem vir a gerar novas linhagens que apresentem interesse prático. Mas esperar os surgimentos destas linhagens pode significar o desperdício de muito tempo, razão pela qual se escolhe “lançar mão” destes métodos. A técnica para a obtenção de mutantes é aleatória, tratando-se de recuperar células sobreviventes em meios ou condições específicas, de forma a dirigir este isolamento para as células que se pretende. Tais programas de mutação/seleção costumam ser bastante caro, mas levaram a várias condições de sucesso e necessitam trabalho de adaptação do meio de cultivo, da forma de conduzir o processo fermentativo e as alterações nas etapas de recuperação do produto, a fim de propiciar o real surgimento das vantagens, em nível de produção industrial, da nova linhagem selecionada. 
As técnicas de engenharia genética também designada por técnicas ou tecnologia de DNA recombinante trouxeram imenso avanço nas possibilidades de se obter células mais produtivas. 
A tecnologia do DNA recombinante tem sido empregada para obtenção de proteínas heterólogas de alto valor agregado, em particular para o uso em saúde humana como é o caso da produção de hormônio de crescimento humano, insulina, etc. Como microrganismos receptores da codificação genética empregam-se bactérias (Escherichia coli), leveduras (Saccharomyces cerevisiae) ou fungos filamentosos (Aspergillus niger). Igualmente são empregadas células animais, particularmente para a produção de proteínas mais complexas e de maior valor agregado, o que explica o crescente interesse das grandes empresas do setor no cultivo de células animais (SCHMIDELL et al., 2001).
Hoje em dia, é possível imaginar o emprego de um certo número de microrganismos, bem conhecidos em termos de necessidades nutricionais e características de crescimento, como é o caso de Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae, para a síntese de uma grande variedade de proteínas de uma grande variedade de proteínas. Obviamente isso pode contribuir para alguma simplificação dos processos produtivos, desde que se consiga obter os mutantes adequados. 
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE MICRORGRANISMOS E DE MEIOS DE CULTURA PARA APLICAÇÃO INDUSTRIAL
Neste item apresentam-se algumas características gerais que os microrganismos e os meios de cultura devem apresentar, para que seja possível o estabelecimento de processo produtivo, e enunciar as características desejáveis de microrganismos relacionadas aos meios de cultivo, lembrando, no entanto, que o desempenho de um dado microrganismo depende muito da composição do meio de cultura em que é colocado. 
	4.1. Características desejáveis de microrganismos
Para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais (SCHMIDELL et al., 2001): 
Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto;
Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do produto no caldo fermentado;
Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;
Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico;
Não ser patogênico;
Não exigir condições de processo muitos complexas;
Não exigir meios de cultura dispendiosos;
Permitir a rápida liberação do produto para o meio.
As duas primeiras características são discutidas em conjunto, pois apesar de serem diferentes concorrem para o mesmo objetivo geral de extrema importância.
De fato, uma célula deve permitir grande conversão do substrato em produto, já que com freqüência as matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final, em particular a fonte orgânica de carbono 
Por outro lado, segundo SCHMIDELL et al., 2001 é sempre desejável que o microrganismo permita um elevado acúmulo do produto no meio, sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo, pois isto concorre para uma redução nos custos de recuperação, os quais podem ser muito acentuados.
Um exemplo é o caso da fermentação alcoólica, simplificada pela equação química final:
C6H12O6 -> 2C2H5OH + 2CO2
Como se pode observar, cada grama de glicose convertida gera 0,511g de etanol, sendo que o Saccharomyces cerevisiae, normalmente empregado nesta fermentação,com freqüência permite obter um rendimento da ordem 90% deste valor estequiométrico, o que torna este microrganismo o mais importante para realizar esta conversão, lembrando que vários outros também pode acumular etanol, a partir de glicose, porém não com este rendimento tão elevado (SCHMIDELL et al., 2001).
Não é possível manter um processo, por exemplo da fermentação alcoólica obtendo 100% de rendimento, pois as células têm de proliferar. Este é um ponto fundamental, pois a matéria-prima incide em algo como 60% do custo do etanol e, desta forma, baixos rendimentos tornariam inviável a produção deste produto de baixo valor agregado. Por outro lado, quando se atinge 8 a 10 % em etanol no vinho fermentado, já ocorre uma clara inibição da levedura, o que faz com que a velocidade da conversão do açúcar em etanol fique prejudicada, razão pela qual procura-se não ultrapassar estes valores, pelo menos na produção de álcool combustível. Isso significa a necessidade de destilar um líquido quem contém apenas 10% de etanol, o que irá gerar 90% de resíduo na forma de vinhaça, que necessita encontrar um destino adequado.
O ideal seria que se encontrasse leveduras mais resistentes ao etanol sem que ocorresse queda nas velocidade da fermentação alcoólica, o que não é simples. Dessa maneira é claro que a conversão de matéria-prima em produto torna-se elevada, não permitindo assim a visualização de grandes incrementos.
Segundo SCHMIDELL et al., 2001 mesmo permitindo o acúmulo do produto no meio, a célula produtora deve ainda, contar com a característica de não produzir substâncias que sejam incompatíveis com o produto, pois isto pode levar uma situação de desinteresse pelo processo produtivo. Por exemplo: o caso de se estar interessado na produção de uma dada enzima ou proteína, mas se utilizar uma linhagem que também seja boa produtora de proteases extracelulares. Assim ao se produzir a enzima, separar as células e armazenar o produto, pode-se ter uma redução sensível da atividade enzimática em virtude da ação das proteases.
Outra característica, de mais alta importância, refere-se à estabilidade fisiológica da linhagem a ser empregada industrialmente. Isso significa que não basta que se tenha uma linhagem hiperprodutora de uma dada substancia de interesse, mas que se conheça as técnicas mais adequadas para sua conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substância de interesse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferação em nível de laboratório, germinadores e biorreator principal. Aoperação de biorreatores de grande porte, do ponto de vista técnico e econômico, exige o emprego e microrganismos não patogênicos, os quais possam ser manuseados sem riscos ambientais. Mesmo durante a fermentação, caso manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de se bastante aumentados, particularmente com os gases efluentes, incidindo assim em custos adicionais (SCHMIDELL et al., 2001). 
O cultivo de patogênicos é efetuado, por exemplo, para a produção de vacinas, porém confinados em câmaras assépticas, tomando cuidado para não contaminação do meio ambiente. Isso logicamente significa custo adicional, o que pode ser justificado no caso de produção de vacina, mas tornaria inviável para a produção de enzimas ou antibióticos.
	A obtenção de células recombinantes de Esscherichia coli, pela introdução de plasmídeos é sempre muito atraente, já que é uma das bactérias mais conhecidas, porém encontra resistências em termos de uma utilização em grande porte, por ser enterobacterias. Essa é uma das razoes, pela quais se prefere partir de células de leveduras, ou fungos filamentosos não patogênicos, ou mesmo de células animais, a fim de se obter recombinantes.
	Um microrganismo também não deve exigir condições de processo muito complexas, por motivos de economicidade do produto final.
	Como sabe-se, sempre existem valores ótimos do pH e da temperatura, por exemplo, em termos do acúmulo do produto. No entanto, também sabe-se que o controle preciso do pH e da temperatura só é possível em reatores de bancada, sendo que em reatores de grande porte, deverá ocorrer uma certa heterogeneidade ao longo da altura do reator, de forma que a célula deverá manter seu desempenho, apesar de uma certa flutuação nos valores do pH e da temperatura. Em outras palavras, ideal é que o microrganismo tenha uma faixa de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais (SCHMIDELL et al., 2001).
	Segundo SCHMIDELL et al., (2001) convém mencionar que o microrganismo selecionado para um processo industrial não deve exigir meio de cultura extremamente oneroso, por questões de economia do processo produtivo. Essa é a razão pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais de uma linhagem é estudo de vital importância, objetivando o fornecimento dos nutrientes apenas necessários. Em algumas circunstâncias esse desconhecimento leva à necessidade da adição de certas substâncias, como extrato de levedura, extrato de carne, peptona e etc., as quais costumam ser bastante dispendiosas. Particularmente na área de produção de vacinas, costuma-se utilizar meio de cultura bastante complexos e onerosos, assim como nos cultivos envolvendo células animais.
	Além do aspecto ligado a uma possível inibição do próprio microrganismo, pela retenção de um dado produto do metabolismo, ainda cumpre lembrar que, com freqüência, a primeira etapa de recuperação do produto significa a separação do microrganismo, trabalhando a seguir, com o líquido isento de células. Assim, se algum produto ainda permanecer associado às células, será perdido.
	Sabe-se que a retenção de certos produtos pelas células depende de uma seria de fatores, tais como: da linhagem empregada, da composição de meio de cultura e das condições impostas (pH e temperatura) (SCHMIDELL et al., 2001).
4.2. CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE MEIOS DE CULTURA
	É sempre muito difícil mencionar as características de microrganismos, sem associá-los a um determinado meio de cultivo. Dessa forma, as características dependem do meio utilizado, como permitir o acúmulo de produto do meio, não permitir a síntese de substâncias incompatíveis com o produto etc.. Claramente isso não teria um maior interesse, além de tornar-se monótono, preferindo-se descrever algumas características mais específicas, que obviamente dependerão do microrganismo a ser utilizado (SCHMIDELL et al., 2001). 
 	Algumas características gerais, que devem ser consideras para os meios de cultura, são:
Ser o mais barato possível;
Atender às necessidades nutricionais de microrganismo;
Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tamponado, ou evitar uma excessiva formação de espuma;
Não provocar problemas na recuperação do produto;
Os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponíveis todo o tempo;
Ter composição razoavelmente fixa;
Não causar dificuldades no tratamento final do efluente.
	Todas essas são características importantes, destacando-se o custo do meio de cultura, que deve ser o menor possível, porém atendendo às necessidades do microrganismo selecionado para o produto desejado.
	Justamente esta combinação de atender às necessidades nutricionais do microrganismo, a fim de que o produto possa ser sintetizado, e ser minimamente oneroso, é que, com freqüência, acaba por causar certas complicações (SCHMIDELL et al., 2001). 
Meios de cultura constituídos apenas por essas substâncias costumam ser chamados de meios definidos, ou meios sintéticos, cuja composição química é sempre muito bem conhecida e pode ser produzida a qualquer instante. Por essa razão, para as células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de em geral, não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação o produto final. Esses meios mesmo onerosos podem ser preferidos caso permitam maior economia nas etapas de recuperação do produto. 
No entanto, segundo Schmidell et al., (2001) para grande variedade de linhagens, há necessidade da adição de certos fatores de “crescimento”, como aminoácidos específicos ou vitaminas. Quando se conhecem essas necessidades específicas, é possível adicionar essas substâncias puras, a fim de manter o meio em sua forma mais definida, mas o custo destes meios pode tornar-se inviável, a menos que isto signifique um enorme ganho econômico na recuperação do produto, ou preserve alguma característica fundamental deste produto, necessariamente de alto valor agregado. Alternativamente, para suprir essas necessidades de linhagens mais exigentes e, com características nutricionais mal conhecidas, pode-se adicionar certos matérias complexos como: extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, peptona, etc.. Esses materiais permitem introduzir no meio de cultura os fatores faltantes em um meio definido, mas além de onerosos são complexas e de composição variável ao longo do tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado.
	Na direção dos meios mais complexos e, igualmente, menos onerosos, razão pela qual são empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala, cumpre mencionar o uso de matérias-primas naturais, tais como caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas diversas, água de maceração de milho. Essas matérias-primas são de composição desconhecida (SCHMIDELL et al., 2001).
	É fato que a composição química estará na dependência de uma série de fatores, tais como no solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante a colheita e estocagem. Estes fatos indicam a expectativa de que possam ocorrer oscilações no processo fermentativo que emprega essas matérias-primas, além de obrigarem as empresas produtoras de antibióticos, ou enzimas a manterem instalações piloto para o ajuste da composição do meio a cada novo lote de matéria-prima que a empresa recebe, a fim de evitar maiores surpresas nos biorreatores de grande porte. Inclusive essas matérias-primas naturais podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação do produto final, assim como problemas no tratamento das águas residuais. No entanto, ainda continuam a ser as matérias-primas preferidas em grande número de casos, pela razão de serem mais baratas.
PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO MICROBIANA E SEUS MEIOS DE CULTURA
	A degradação microbiana consiste na quebra de substrato pelos microrganismos e formação de produtos comercialmente valiosos, como a cerveja,vinho, uísque, rum, vinagre, entre outros. Tais processos de degradação dependem essencialmente das características dos microrganismos e dos meios de cultura, fatores que influenciam no custo econômico do processo e, consequentemente, na produção em larga escala (PELCZAR JR et al., 1996; SCHMIDELL et al., 2001).
	Por esses motivos, nos últimos anos, a utilização de meios de culturas simples e não dispendiosos vem aumentando em diversas aplicações industriais, como, por exemplo, o emprego de resíduos da indústria de papel para a fabricação de etanol e ácido lático.
PRODUÇÃO DE ETANOL
No Brasil, desde a criação do PROÁLCOOL na década de 70, a produção de álcool etílico está intimamente ligada à indústria açucareira, pois esse é praticamente um subproduto desta.
O etanol pode ser produzido por duas maneiras principais: por via sintética e por via fermentativa. Por via sintética, obtêm-se a partir dos hidrocarbonetos não saturados eteno e etino, de gases de petróleo e da hulha (LIMA, 1975).
Atualmente, no país, a via fermentativa é a mais importante para a obtenção do álcool etílico a partir da cana-de-açúcar. Em outros países, como os Estados Unidos, o milho e outros produtos amiláceos e celulósicos podem servir como matéria-prima barata e renovável que, como já mencionadas, constituem características desejáveis dos meios de culturas. Tecnologias para a conversão de materiais lignocelulósicos em etanol já estão disponíveis, embora a um custo ainda não competitivo (LIMA, 2002).
As operações básicas na produção do álcool pelo processo fermentativo dependem do tipo de substrato, se diretamente fermentativo, como o melaço e o caldo de cana, ou indiretamente fermentescível, como as matérias primas amiláceas ou celulósicas. O álcool também pode ser obtido a partir do soro de leite, resíduo de queijo, rico em lactose, que pode ser fermentado por algumas espécies de leveduras (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988).
Na via fermentativa distinguem-se três fases distintas: o preparo do substrato, a fermentação e a destilação. 
O preparo de substrato difere-se para diferentes materiais-primas, e tem o objetivo de preparar o meio de cultura e obter rendimentos ótimos na transformação dos açucares fermentescíveis em álcool etílico (fermentação). As variações entre os processos de fermentação são apenas em detalhes (Tabela 1).
 Portanto, segundo Lima (2002), a utilização eficiente dos substratos (glicose, sacarose, frutose, xilose, pentose) é um passo importante para o desenvolvimento de processos economicamente viáveis de produção de etanol a partir de biomassa vegetal.
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Tabela 1. A função das leveduras na produção de bebidas alcoólicas.
	Produto
	Microrganismo
	Método de preparação
	Função da levedura
	Cerveja
	Saccaharomyces cerevisiae ou S. carlsbergensis
	Malte da cevada e amido misturados com água morna após a conversão enzimática do amido, o mosto é flitrado e então fervido com o lúpulo e, finalmente fermentado com a levedura
	Converte o açúcar em álcool e dióxido de carbono; produz alterações em proteínas e outros constituintes secundários que modificam o sabor.
	Rum
	Saccaharomyces cerevisiae ou outras leveduras.
	Melaço contendo açúcar 12-14% de açúcar fermentável; sulfato de amônia e ocasionalmente fosfatos podem ser adicionados como nutrientes; destilado após a fermentação.
	O açúcar é convertido em álcool que então é removido por destilação.
	Uísque escocês
	Saccaharomyces cerevisiae
	Pasta de cereal cozida, sacarificada com turfa de malte e fermentada; destilado em lotes e envelhecido em barril de carvalho por pelo menos 3 anos; a seguir é misturado com cereal de uísque.
	Produz álcool e substâncias congêneres (ácidos, ésteres, vários álcool) que reagem com o malte para dar o sabor escocês característico. 
	Uísque bourdon
	Saccaharomyces cerevisiae
	Pasta de malte consistindo em milho (pelo menos 51%) geralmente com centeio; cozido e sacarificado com malte e fermentada; destilada com teor alcoólico entre 110 e 130, envelhecido em barris de carvalho carbonizados
	Idem ao uísque escocês.
	Vinho 
	Saccaharomyces ellipsoideus
	Mosto de uva com concentração de açúcar superior a 22%; a massa é sulfitada para reduzir a taxa de fermentação; pode ser fermentado com uma amostra especial de leveduras ou com levedura presentes na uva; a fermentação primária é sucedia por um período de armazenamento para o envelhecimento
	Converte o açúcar em álcool e também produz alterações nos constituintes secundários que modificam o aroma e o bouquet; a quantidade de álcool varia quanto ao tipo de vinho.
Fonte: SPECTOR, W. S. (1956, apud, PELCZAR JR et al., 1996)
Matérias-primas 
Qualquer produto que contenha açúcar ou outro carboidrato constitui em matéria prima para a produção do etanol (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988). Entretanto, para maior rendimento, é preciso considerar seu volume de produção, o rendimento industrial e o custo de fabricação.
As matérias-primas são classificadas em açucaradas, grupando cana, beterraba, melaços, mel de abelha e frutas; em matérias amiláceas e feculentas, grupando amido de grãos, a fécula de raízes e tubérculos; e em matérias celulósicas, incluindo palhas, madeiras, resíduos agrícolas e resíduos de fábricas de papel (LIMA, 1975).
Entre as matérias açucaradas, distingui-se as diretamente fermentescíveis e as não diretamente fermentescíveis. As primeiras são os monossacarídeos existentes nos sucos de frutas. Sua produção industrial reside na produção de etanol em bebidas como vinhos e cidra. As não diretamente são os dissacarídeos, que fermentam após uma hidrólise, à qual se dá o nome de inversão e que se realiza normalmente por ação de enzimas da levedura. A sacarose é o componente mais importante dos da cana de açúcar e dos melaços.
As matérias amiláceas, feculentas e celulósicas contem polissacarídeos (amido e celulose) e fermentam após uma hidrólise, que se chama de sacarificação, e consiste na quebra dos polissacarídeos em açúcares diretamente fermentescível. 
Dentre os materiais que fazem parte do grupo dos indiretamente fermentáveis são alguns subprodutos gerados pela agroindústria, a celulose apresenta-se como um dos mais abundantes, estando presente em resíduos, tais como: bagaço da cana-de-açúcar, casca de arroz, palha de milho, serragem, entre outros. Por exemplo, o bagaço da cana-de-açúcar tem sido descartado em rios acarretando a lixiviação dos mesmos. Já os resíduos da produção de arroz, quando não são queimados para a geração de energia, são depositados em estradas vicinais ou lançados clandestinamente nos mananciais de água, acarretando graves problemas ambientais (LIMA, 2007). Felizmente, grande parte do bagaço de cana-de-açúcar produzido tem sido queimado para a geração de energia elétrica. Apesar dos benefícios advindos dessa prática, esta também contribui com a emissão de CO2 para a atmosfera.
Como alternativa ao destino dado aos resíduos celulósicos, estes podem ser gerenciados de forma que benefícios interessantes pudessem ser atingidos tanto do ponto de vista ambiental quanto econômico. Portanto, a riqueza em celulose desses dois resíduos, bem como sua disponibilidade a um baixo custo, representam um importante recurso para a produção de álcool via processo de sacarificação (Reyes et al., 1998; Fujita et al., 2004, apud, LIMA, 2007).
Para o Brasil, as principais matérias primas de importância econômica para a produção do etanol industrial são os melaços e a cana-de-açucar; para a preparação de bebidas destiladas, a cana-de-açucar e as matérias amiláceas, particularmente o milho. A mandioca é uma matéria feculenta que, atualmente, é constantemente explorada para a produção de etanol, pois é uma fonte barata e renovável, assim como a cana-de-açúcar.
Composição da matéria prima
De acordo com Lima (1975) há diversas variáveis que influenciam a composição de qualquer produto vegetal, entre elas se destacam: a variedade, a idade, as regiões e as condições culturais, mesológicas, de maturação, de sanidade,de colheita, de transporte, de armazenamento e de industrialização.
Respeitando essas considerações têm-se, em números gerais, as composições de diversas matérias primas que dão origem ao etanol:
Cana-de-açúcar: 74% de água, 14% de açucares (12,5 de sacarose, 0,9 de dextrose, e 0,6 de glicose), 10% em fibras e o restante dividido em matérias minerais, compostos nitrogenados, ceras, pectinas e ácidos. O caldo de cada obtido pela moagem tem 78-86% de água e 10 a 20% de sacarose.
Melaços: 20% de água, 62% de açucares, 8% de cinzas, 3% de materiais nitrogenados e 7% de outros, como gomas e ácidos.
Milho: 9 a 16% de água, 59 a 70% de extrativos não nitrogenados, material protético de 5 a 15%, material celulósico de 1,5 a 8,5% e cinzas de 1,3% a 4%.
Mandioca: as raízes frescas têm 67% a 75% de água, de 18 a 23% de fécula e o restante distribuído entre material protético, celulose, graxas e cinzas. 
Preparação dos substratos
Essa fase difere conforme se tratem de fontes de carboidratos das matérias-primas direta ou indiretamente fermentescíveis.
Os substratos açucarados ou mostos requerem uma preparação prévia adequada, inoculando os nutrientes adequados para o melhor rendimento do processo fermentativo. 
As matérias-primas indiretamente fermentáveis necessitam, ainda, um pré-tratamento (hidrólise) para a obtenção de açucares fermentáveis.
Preparação do mosto de matérias-primas diretamente fermentescíveis.
a) Preparação do mosto do melaço
O melaço é diluído com água para fornecer uma concentração de açúcar de 14 a 18% (LIMA, 1975), uma vez que alta quantidade de açúcar significa alta produção de etanol, e esse pode inibir o crescimento da levedura
b) Preparação do mosto do caldo de cana
Após a moagem, o caldo de cana é coado ou filtrado para separar o bagaço, que pode dificultar a destilação.. O caldo assim tratado, além de mais limpo, forma menos espuma durante a fermentação e provoca menor acúmulo de detritos na coluna de destilação, além de auxiliar a redução de microrganismos indesejáveis (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988). 
O caldo resultante apresenta, às vezes, concentração muito elevada de açúcar, tornando necessária sua diluição, pois, como já dito, caso contrário, a limitada tolerância da levedura ao álcool irá impedi-la de utilizar todo o açúcar presente para a transformação em álcool. 
Preparação do mosto de matérias-primas indiretamente fermentescíveis
A hidrólise de substratos amiláceos ou celulósicos, por processo ácido ou enzimático, é uma etapa preliminar e de grande importância na fermentação alcoólica utilizando as matérias-primas indiretamente fermentescíveis. 
Preparo do mosto de materiais amiláceos e celulósicos
É necessário sacarificar as matérias primas que contem polissacarídeos, pois as leveduras são incapazes de metabolizar tais carboidratos. A sacarificação é realizada por via química ou biológica.
A sacarificação biológica se faz por ação enzimática do malte ou pela ação microbiana de certos fungos.
a.1) Sacarificação pelo malte 
Malte é um cereal germinado em condições especiais de umidade, temperatura e aeração, caracterizados, principalmente pela secreção de enzimas diástases (LIMA, 1975). 
Nas cervejarias, principalmente, pela ação das enzimas diástases proveniente do malte, os polissacarídeos são quebrados e produz-se a maltose, açúcar diretamente fermentescível. 
a.2) Sacarificação por ação microbiana 
Usam-se, nesse processo, fungos capazes de secretar enzimas com propriedade de quebrar amido ou celulose em açucares fermentescíveis. As espécies que mais se usam são Amylomyces rouxii, Aspergillus oryzae, Clamydomucor orizae, Rhizopus japonicus e Mucor delemar. Comumente se associa o fungo com uma levedura que fermenta os açucares.
Na grande maioria dos processos estudados nos países da América do Norte e Europa, a conversão da celulose em monossacarídeos tem sido efetuada por meio de microrganismos que sintetizam as enzimas conhecidas como celulases. Estes monossacarídeos são posteriormente convertidos em etanol. Este processo tem sido estimulado, pois permite a produção com matérias-primas renováveis, além de reduzir a emissão de gases com efeito-estufa (LIMA, 2007).
Portanto, para o uso de microrganismos na produção de álcool ou de qualquer outro produto, a partir de resíduos celulósicos e amiláceos como substrato, podem ser empregadas basicamente duas estratégias. A primeira, que utiliza dois organismos, um responsável pela sacarificação do resíduo e o outro pela síntese do produto em si. O segundo processo é conhecido como Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF). Neste, o microrganismo além de ser capaz de produzir álcool, ou outro produto, também é apto a sintetizar celulases e amilase, ou estas são adicionadas ao sistema durante o cultivo (Krishna e Chowdary, 2000; Mielenz, 2001, apud, LIMA, 2007). Nestes processos, os principais procariotos produtores de celulases utilizados são Bacillus spp., Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas fluorescens, Acetobacter xylinum, etc. Entre as bactérias produtoras de etanol destacam-se Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Clostridium thermosacharolyticum, Clostridium thermocellum e Cellulomonas fimi.
Agentes de fermentação alcoólica
Do ponto de vista econômico, as leveduras são os microorganismos mais importantes na obtenção do álcool por via fermentativa. As espécies mais utilizadas na produção de álcool e aguardentes são os Saccharomyces cerevisae e Saccharomyces uvarum.
Figura 2. Saccharomyces cerevisae 
(Fonte http://www.br-business.com.br/port/fungos.htm)
 Correção do mosto ou preparo do meio de cultura
O melaço diluído, o caldo de cana e as substâncias amiláceas e celulósicas constituem o mosto que já pode ser submetido à fermentação alcoólica. Todavia, conhecendo-se as propriedade fisiológicas e as exigências nutricionais das leveduras, pode-se propiciar condições ótimas para esses microorganismos e favorecer a fermentação alcoólica, a fim de que esta seja mais rápida e regular. Isto se consegue adicionando ao mosto os nutrientes necessários, corrigindo a reação do meio, empregando-se anticépticos ou antibióticos e conduzindo a fermentação à temperatura adequada (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988).
Elementos nutricionais	
A adição de elementos nutricionais complementares dependem do tipo de mosto. Na fermentação alcoólica, a fonte de carbono é fornecida pelos carboidratos ou açúcares. As fontes de nitrogênio e fósforo também são imprescindíveis à fermentação, e como os caldo de canas e a maiorias do hidrolisados amiláceos ou celulósicos são carentes desses elementos, é de fundamental importância a adição de sais desses elementos, como sulfato de amônio e superfosfato. A fermentação é mais eficiente quando se adicionam sulfato de magnésio, sulfato de cobalto e sulfato de manganês, e como fonte de vitaminas é comum a adição de farelo de arroz.
Para o melaço, o enriquecimento é feito apenas com superfosfato, na proporção de uma grama por litro de mosto, e para o mosto de amido de mandioca hidrolisado têm-se conseguido bons resultados usando sulfato de amônio e sulfato de magnésio (LIMA, 1975). Essa pequena quantidade adicional de micronutrientes torna o processo mais acessível e barato.
Preparo do meio
A reação correta do mosto para favorecer a levedura e inibir o desenvolvimento de muitos tipos de bactérias está entre pH 4,0 e 5,0. O ácido sulfúrico é comumente usado para esse fim, na proporção de 25 mL para 100 litros de mosto (LIMA, 1975). Novamente, quantidades insignificantes de ácido sulfúrico proporcionam alta rentabilidade, uma vez que este funciona como meio seletivo.
Antissépticos
No caldo de cana está pode estar presente, também, uma população microbiana natural que se compete com a levedura pelo substrato diminuindo o rendimento alcoólico. Para assegurar uma fermentação alcoólica “pura”, livre de competição de microrganismo indesejáveis, é indispensável o emprego de antissépticos nos mosto.
Obtêm-se boa fermentações usando-se4 mg de hexaclorofeno por litro de mosto ou pentaclorofenol na proporção 0,01 a 0,05g/litro de substrato. O ácido sulfúrico, que se usa para a correção da reação do meio, age como anticéptico. Nas fermentações para a produção de vinhos de mesa, o único anticéptico que se usa é o anidro sulfuroso (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988).
Antibióticos
Em virtude de suas propriedades bacteriostáticas ou bactericidas, os antibióticos agem como agentes desinfetantes do mosto. A adição de alguns por litros de penicilina resulta em um acréscimo de do rendimento do álcool. Podem-se usar também o cloranfenicol, tetraciclina e a clorotetraciclina.
Temperatura
A faixa de temperatura recomendada para a fermentação alcoólica está entre 25 a 36°C. Temperaturas inferiores ao limite retardam a fermentação e temperaturas superiores ocasionam a evaporação do álcool e favorecem o aparecimento das contaminações. Nota-se que nesta faixa de temperatura, situa-se temperaturas ambiente em diversas regiões brasileiras proporcionando facilidade na produção de etanol por via fermentativa e evitando assim gastos exagerados em caldeiras ou trocadores de calor, característica ideal do meio de cultura.
Preparo do inóculo
Tendo sido escolhida a levedura para a fermentação, a fase inicial do processo de fermentação é a do preparo do inoculo. 
Nas pequenas cantinas e nas destilarias de aguardentes, comumente usam-se microrganismos que acompanham o caldo.
	Nas grandes instalações industriais a levedura é previamente selecionada e possui grande tolerância aos altos teores de álcool. Para esses casos parte-se de 10 a 20 g de leveduras para cada litro de mosto. Prepara-se o inóculo com a inoculação subseqüente de volumes de substrato em quantidade e concentrações crescentes até atingirem o volume útil de fermentação na indústria. Neste tipo de preparo do inoculo distingui-se um etapa de laboratório e outra industrial, de acordo com a Figura abaixo.
Figura 3. Esquema de preparo do inóculo 
(Fonte: LIMA, 1975)
Verifica-se que uma pequena quantidade de levedura é capaz de transformar cerca de 15 mil litros de mosto em etanol com alta tolerância ao produto, características desejáveis para o processo fermentativo.
Etapas da fermentação alcoólica
Depois da mistura do inóculo ao mosto, inicia-se o processo de fermentação alcoólica dos açucares fermentescíveis, nele contidos. Há três fases numa fermentação alcoólica, uma preliminar, uma tumultuosa e uma final ou complementar.
	A fase preliminar inicia-se no momento do contato do levedo com o mosto. Caracteriza-se por multiplicação celular intensa e pequeno desprendimento de dióxido de carbono. Nesta fase grande quantidade de leveduras é reproduzido, o que se consegue com temperatura baixa e mosto convenientemente preparado. Sua duração é de 4 a 6 h.
	A fase tumultuosa caracteriza-se pelo desprendimento intenso de dióxido de carbono, conseqüência da existência de um número suficiente de células para desdobrar os açucares fermentescíveis do mosto. O substrato agita-se como em ebulição. Os inconvenientes da elevação exagerada da temperatura corrigem-se com refrigeração.
	O desprendimento de dióxido de carbono é evidente. O aspecto da espuma difere para cada raça da levedura e para cada tipo de substrato. A fase tumultuosa dura de 12 a 16 h.
	A fase complementar, que leva de 4 a 6 h para se completar, caracteriza-se pela diminuição da intensidade do desprendimento do dióxido de carbono, maior tranqüilidade no líquido e diminuição da temperatura e redução abrupta no teor de açucares no meio.
Por fim, o processo total leva em torno de 24 horas mostrando que a fermentação é um procedimento rápido, eficiente e altamente rentável. 
Destilação
Após a fermentação, os substratos açucarados denominam-se vinhos, com uma constituição variável, mas encerrando sempre substâncias gasosas, sólidas e líquidas. As primeiras representam, principalmente, o dióxido de carbono, que se dissolve em pequena porção no vinho. Os sólidos se fazem presente pelas células de leveduras, bactérias, sais minerais, açucares infermentados e impurezas mecânicas em suspensão.
Os líquidos mais importantes são a água e etanol, em percentagem que variam de 88-93% a 7-12%, respectivamente nos vinhos comuns (LIMA, 1975).
Dessa substância impura separa e heterogenia, separa o álcool, em grau de pureza e concentração variáveis por destilação. 
O aroma e sabor característicos das bebidas alcoólicas dependem das impurezas (já citadas) que acompanham o destilado e fazem parte da fração liquida dos vinhos, juntamente com a água e o etanol.
PRODUÇÃO DE ÁCIDOS POR MICRORGANISMOS
Os microrganismos, tais como as bactérias e os fungos, podem ser utilizados na produção de ácidos de grande valor econômico. O êxito depende exclusivamente da maneira conveniente de tratá-los.
As bactérias utilizadas industrialmente são as anaeróbias e as microaerófilas, para a produção de ácido lático, acético, glucônico e propiônico ou, então, para a produção de alimentos como queijos, picles, vinagres e outros.
Os fungos são também empregados na produção de ácido por via fermentativa. Entre eles, temos os ácidos cítrico, glucômico, ácidos graxos e outros.
Produção de ácidos por bactérias
As bactérias envolvidas nesses processos são principalmente as do gênero Acetobacter e os Lactobacillus, de maior interesse econômico na produção de ácido lático e ácido acético. 
Os ácidos são provenientes da degradação anaeróbia de glicídeos por oxidação incompleta.
 Fermentação Lática
O ácido lático, ácido 2-hidroxipropiônico ou ácido a-hidroxipropiônico, tornou-se comercialmente importante desde 1881 tendo aplicação nas indústrias alimentícia, farmacêutica, cosmética, têxtil, de couro e química (HAULY et al., 2003).
As bactérias láticas são bastante exigentes quanto às condições de crescimento. Segundo Buchta (1983 apud HAULY et al., 2003) os açúcares representam as melhores fontes de carbono para estas bactérias, havendo também necessidade de fonte de nitrogênio, vitaminas e sais minerais para o bom desempenho da fermentação lática. Empregam-se também resíduos da indústria de papel e polpa de celulose, que contém polímeros de açúcar. Os substratos utilizados são principalmente a glucose, lactose e sacarose. Porém, substratos amiláceos como milho, batata e mandioca podem ser empregados, desde que pré-hidrolisados por enzimas (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988). 
Dentre as matérias-primas, os melaços destacam-se como meio de cultivo nos processos fermentativos, em virtude do alto teor de açúcares, nitrogênio e vitaminas. 
O soro residual, obtido a partir de laticínios manufaturados (queijo e manteiga), é também comumente utilizado para produzir ácido lático porque é um meio de cultivo barato e eficiente para o crescimento de bactérias. Este meio é uma solução contendo o açúcar do leite (lactose), substância nitrogenadas, como vitaminas e sais minerais. Como o despejo do soro não tratado pode ser uma causa de poluição, a sua utilização na produção de ácido lático tem a função adicional de reduzir fontes de poluição (PELCZAR JR et al., 1996).
Para a fermentação láctica, a concentração do mosto de ser ajustada para 5 a 20%, dependendo da matéria prima (LIMA, 1975).
Os microrganismos responsáveis pela conversão são bactérias dos gêneros Lactobacillus e Streptococcus. A espécie escolhida depende do carboidrato disponível e da temperatura a ser empregada. Assim, para L. bulgaricus e L. delbrueckii, a temperatura deve ser de 45-50ºC. Para L. casei e S. lactis, a temperatura deve estar ao redor de 30°C.
Em geral, a produção de ácido lático é um processo utilizado pelas bactérias para obter energia através da oxidação incompleta da glicose, sem usar oxigênio livre, logo, essas bactérias são anaeróbicas estritas. A Figura 4 abaixo mostra as reações de conversão dos açucares em ácido lático.
Figura 4. Conversão de açucares em ácido lático
As bactérias láticas são reconhecidamente exigentes para certosfatores de crescimento. Algumas bactérias necessitam de vitaminas como a riboflavina, ácido pantogênico, ácido nicotínico e biotina.
O pH, para propiciar elevado rendimento, deve-se situar nas proximidades da neutralidade ou na faixa levemente ácida. Por isso, utilizam-se agentes neutralizantes como o amônio, carbonato de amônio ou mistura de sódio potássio e carbonato de amônio (LIMA, 1975).
A fermentação se completa entre 1 a 6 dias e o rendimento é de 85 a 90% em relação ao açúcar consumido (ROITMAN e TRAVASSOS, 1988). O ácido formado é mistura racêmica.
Exemplo de meio de cultura para produção do ácido lático
Hauly et al. (2003) obteve um bom desempenho na produção do ácido acético pela bactéria Lactobacillus curvatus. O meio de cultivo foi constituído de melaço de cana-de-açúcar a 10% (m/v); extrato de levedura 2% (m/v) e peptona 2% (m/v). O resultado experimental obtido foi de 29,9 g de ácido lático por litro de mosto.
O melaço de cana-de-açúcar apresentou em sua composição 17% de água; 66 % de açúcares, sendo 16% açúcares redutores (glicose e frutose) e 50%, sacarose; 8% de cinzas, 4% de matéria nitrogenada e 5% de outros. Sendo assim, uma matéria-prima rica em açúcares fermentescíveis. 
Considerando que Oliveira (1995, apud HAULY et al., 2003) verificou queo L. curvatus possui baixo metabolismo de sacarose, e a sacarose é o açúcar presente em maior quantidade no melaço de cana-de-açúcar, investigou-se previamente a hidrólise enzimática deste substrato utilizando a invertase (na concentração de 2% (v/v)) a fim de disponibilizar os açucares glicose e frutose, prontamente fermentescíveis ao microrganismo
Fermentação acética (Produção do vinagre)
O vinagre é utilizado no mundo inteiro como condimento e conservante de alimentos. Além disso, é considerado um complemento indispensável à alimentação humana, pela ação nutritiva e biorregulatória. É produzido por dois processos bioquímicos distintos, ambos resultantes da ação de microrganismos: a fermentação alcoólica, pela ação de leveduras sobre matérias-primas açucaradas e amiláceas e a fermentação acética, pela ação de bactérias aeróbias do gênero Acetobacter (BORTOLINI et al., 2001).
As diferenças entre vários tipos de vinagres estão associados principalmente ao tipo de material, contendo carboidrato, utilizado (por exemplo, um suco de uva, um xarope contendo açúcar ou uma substância amilácea hidrolisada) (PELCZAR JR et al., 1996).
A concentração do álcool no mosto utilizado é inicialmente ajustada até 13% (BORTOLINI et al., 2001).
Muitos equipamentos têm sido projetados para a produção de vinagre. As características essenciais de um processo são mostradas pelo método de Frings (Figura 5). 
Figura 5. Método de Frings
Neste processo, a solução alcoólica é acidificada pela adição de ácido acético (porque as acetobactérias preferem condições de acidez), bem como de nutrientes especiais para o crescimento das acetobactérias. A solução alcoólica é colocada dentro de uma canalícula presente na parte superior da câmara, o que permite o seu gotejamento sobre madeiras lascadas previamente inoculada com as bactérias. Quando o álcool passa pelas lascas, as acetobactérias oxidam certa quantidade de álcool em ácido acético:
	
Este processo é aeróbio, para cada mol de ácido acético produzido, um mol de oxigênio é consumido. Por este motivo a síntese microbiana de ácido acético requer uma aeração intensiva.
Além disso, a temperatura deve ser mantida entre 15 e 34°C, a faixa ótima para o crescimento e metabolismo do Acetobacter. Temperaturas fora desse intervalo permitem o crescimento de outros microrganismos que produzem substâncias indesejáveis (LIMA, 1975).
Produção de ácidos por fungos
Os fungos produzem uma grande variedade de ácidos orgânicos. Muitos ácidos orgânicos são produzidos em larga escala em processos industriais: ácido cítrico, ácido glucônico, ácido itacônico, entre outros (Tabela 2). O ácido de maior importância comercial é o cítrico.
Tabela 2. Alguns ácidos obtidos por degradação microbiana
	Produto
	Microrganismo
	Aplicação
	Ácido cítrico
	Aspergillus niger
	Alimentos, bebidas, cosméticos e produtos de couro.
	Ácido glucônico
	Aspergillus niger
	Alimentos e compostos de limpeza.
	Ácido itacônico
	Aspergillus terreus
	Produção de resinas acrílicas.
	Ácido fumárico
	Rhizopus nigricans
	Produção de resinas alquídicas e agentes umectantes.
Fonte: PELCZAR JR et al., 1996
PRODUTOS DE SÍNTESE MICROBIANA E SEUS MEIOS DE CULTURA
Muitos produtos industriais são elaborados por meio da atividade biossintética dos microrganismos, como por exemplo, antibióticos, enzimas, peptídeos e aminoácidos (PELCZAR JR et al., 1996)
6.2. ANTIBIÓTICOS
6.2.1. Conceito
Durante o processo de influência prejudicial de um microrganismo sobre outro (antibiose) os microrganismos elaboram substâncias chamadas antibióticos. Designa substâncias produzidas por microrganismos com capacidade, em doses reduzidas, inibir o crescimento ou mesmo destruir outros microrganismos. Por definição, os antibióticos são substâncias de origem natural, o que não impede, entretanto, sua produção por via sintética, como ocorre com o cloranfenicol, produzido pelo microrganismo Streptomyces venezuelae e ciclosserina, produzido pelo Streptomyces orchidaceus, sintetizados atualmente em escala industrial. Antibióticos semi-sintéticos são aqueles cujas moléculas são submetidas a modificações químicas, de modo a alterar certas características biodinâmicas, conservando, entretanto, suas propriedades antibióticas (LIMA, 1975).
6.2.2. Produção de antibióticos
	 Na Tabela 3 tem-se os principais antibióticos e seus agentes produtores:
Tabela 3. Exemplos de antibióticos e seus agentes produtores 
	Antibiótico
	Produzido por
	Mecanismo de ação
	Penicilina
	Penicillium sp.
	Inibição da síntese da parede celular
	Cefalosporina
	Cephalosporium sp.
	-
	Polimixinas
	Bacillus polymyxa
	Alteração das membranas celulares
	Bacitracina
	Bacillus subtillis
	Inibição da síntese da parede celular
	Cloranfenicol
	Streptomyces 
venezuelae
	Interferência nos mecanismos de síntese 
protéica
	Estreptomicina
	Streptomyces griseus
	-
	Tetraciclina
	Streptomyces rimosus
	-
	Canamicina
	Streptomyces kanamyceticus
	-
	Neomicina
	Streptomyces fradie
	-
Fonte: repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/2763/1/Livro%20Actinomicetas%20.pdf
6.2.3. Penicilina
	Atualmente, as penicilinas G (benzilpenicilina) e V (fenoximetilpenicilina) são as únicas com interesse industrial e econômico, com uma produção e valor de mercado de cerca de 20.000 ton/ano e 600 milhões USD/granel (MENEZES et al., 2000).
	A obtenção de uma dada penicilina está relacionada com o fornecimento de, sais de ácido fenil acético (AFA) à formação exclusiva de penicilina G ou fornecimento de sais de ácido fenóxi acético (AFNA) à formação exclusiva de penicilina V (MENEZES et al., 2000).
	Quer a penicilina G quer a penicilina V são produzidas industrialmente do mesmo modo em reatores agitados, com arejamento, operados em fed-batch (i.e., alimentação contínua de várias substâncias a uma fermentação descontínua). Este modo de operação permite um melhor controle das condições de fermentação do que os modos contínuo ou descontínuo, conseguindo-se com a adição controlada de um açúcar facilmente metabolizável manter na fase de produção uma atividade catabólica adequada à fermentação da penicilina (MENEZES et al., 2000).
	A operação fed-batch permite manter ao mesmo tempo as condições de fermentação em estado quase-estacionário e a cultura em estado transiente, sendo indispensável a uma boa produção de antibiótico (MENEZES et al., 2000).
	Os meios de cultura industriais são formulados com matérias primas fontes de C & N a maioria das quais são complexas em termos de composição química (e.g., água da maceração de milho, melaços, óleos vegetais ou gorduras animais). Após a inoculação do meio segue-se umcurto período de operação descontínua (12 h). Em seguida e até ao fim da fermentação são adicionadas diversas substâncias, como açúcar, AFA ou AFNA, sais, óleos, gorduras, corretores de pH (MENEZES et al., 2000).
	A regulação das adições ao longo da fermentação (180 a 220 h) depende da estirpe utilizada. Por exemplo, a adição de açúcar faz-se normalmente com um xarope de glucose ou sacarose (30-50%) com um caudal decrescente durante a fermentação (de 2,0 a 1,0 kg/m3/h) (MENEZES et a.l, 2000).
Durante a fermentação, o pH e a T são mantidos constantes (6,5 e 25-27ºC, respectivamente) e a condução do processo é quase exclusivamente manual com procedimentos estabelecidos empiricamente para a estirpe utilizada. A velocidade de arejamento está normalmente entre 0,5 e 1,0 m3 de ar/ m3 de meio/min (vvm), dependendo da estirpe, fermentador e velocidade de agitação entre 120 e 150 rpm (MENEZES et al., 2000).
	Na produção industrial de penicilina (G ou V) são utilizadas duas estratégias de condução da fermentação no que respeita à evolução do volume de meio dentro do fermentador. Devido à adição de nutrientes durante a fermentação o volume dentro do fermentador vai aumentar desde o início até ao fim da fermentação. Uma das estratégias consiste em fazer periodicamente descargas parciais do meio fermentado que irão ser processadas juntamente com a descarga final do fermentador. A outra estratégia consiste em iniciar a fermentação com um volume tal que no fim da mesma é atingido o volume máximo do fermentador, não havendo assim descargas parciais. A primeira estratégia implica menos investimento de capital para a mesma capacidade de produção (MENEZES et al., 2000).
Na Figura 6 apresentam-se os perfis de concentração típicos das espécies mais importantes numa fermentação semi-descontínua de penicilina G, com meios complexos:
Figura 6. Perfis de concentração principais das espécies numa fermentação semi-descontínua de penicilina G (MENEZES et al., 2000).
	A quantidade de penicilina G (ou V) produzida por estirpes de produtividade elevada é da mesma ordem da concentração de biomassa (como peso seco) no fim de uma fermentação - i.e., 50 g-PENG/l-caldo (MENEZES et al., 2000).
6.2.4. Cefalosporina 
	A molécula de cefalosporina C é sintetizada por diferentes microrganismos, mas é o fungo Cephalosporium acremonium o microrganismo utilizado na biossíntese desse composto nas grandes indústrias que o produzem via processo fermentativo (ANDRIETTA, 1998).
	Para se obter inóculo para os ensaios podem ser realizados criotubos da cultura congelada. O criotubo é descongelado e transferido para frascos erlenmeyer de 250 ml contendo 20 ml de meio recomendado (ANDRIETTA, 1998). As condições de incubação foram: 28ºC±1, sob agitação de 250 rpm±5 por 72 horas.
	O controle e monitoramento do processo de fermentação para produção de cefalosporina C pode ser avaliada empregando-se as seguintes formulações de substrato (ALCARDE et al., 2006):
substrato formulado com melaço (10% de ART) 
suplementado com uréia (4% N)
	O rendimento, com a utilização deste meio de cultura, é igual a 0,1 g.L-1 (ALCARDE et al., 2006). 
6.3. ENZIMAS MICROBIANAS
	As enzimas são proteínas vitais que catalisam reações bioquímicas com grande especificidade, sendo capazes de aumentar em até 1014 vezes algumas reações, sem requerer condições extremas de pH, pressão e temperatura. Além de formarem a base do sistema metabólico dos organismos vivos, essas proteínas proporcionam enormes oportunidades às indústrias por efetuarem conversões biocatalíticas finas, eficientes e mais econômicas (OLIVEIRA et al., 2006).
Apesar das enzimas ocorrerem amplamente em plantas e animais, as de origem microbiana representam as melhores fontes devido à sua ampla diversidade bioquímica e susceptibilidade à manipulação genética. Depois dos antibióticos, as enzimas são os produtos mais explorados pela indústria biotecnológica, as quais são utilizadas em larga escala nas indústrias têxtil (amilase, celulase, pectinase), papel (lipase, xilanase, oxidoredutase), detergente (celulase, lipase, protease), couro (lipase, protease) e de alimento (pectinase, lipase, amilase, protease), entre outras (OLIVEIRA et al, 2006)
As Tabelas 4 e 5 exemplificam as enzimas microbianas produzidas industrialmente e suas aplicações:
Tabela 4. Exemplos de enzimas microbianas produzidas industrialmente e suas aplicações 
	Enzima
	Fonte
Microbiana
	Aplicações
	Reações
	Estreptoquinase
	Streptococcus sp.
	Tratamento de pacientes que sofreram ataques cardíacos
	Ativa o plasminogênio sanguíneo a plasmina, uma enzima que dissolve a fibrina de coágulos sanguíneos
	Glicose
isomerase
	Streptomyces sp.; Bacillus sp.
	Produção de xaropes com alto teor de frutose
	Converte glicose em frutose
	DNA
polimerase
	Thermus
Aquaticus
	Reação de polimerização em cadeia (PCR).
	Mediadora na formação de pares de base entre os nucleotídeos livres e os nucleotídeos de DNA ligados
	
Lipase
	
Aspergillus niger, Rhizopus sp.,
Mucor spp.
	Aromatizante utilizado no processamento de alimentos; melhoramento da ação clarificante dos detergentes
	Hidrolisa lipídeos a glicerol e ácidos graxos
	Celulase
	Aspergillus niger, Trichoderma viride
	Preparação de concentrados líquidos de café, clarificação sucos
	
Fonte: PETCZAR et al, 1996
Tabela 5. Exemplos de enzimas microbianas produzidas industrialmente e suas aplicações
	Enzima
	Fonte microbiana
	Aplicações
	Reações
	Glicose oxidase
	Aspergillus sp.;
Penicillium sp.
	Remove o oxigênio de alimentos enlatados, refrigerantes e cerveja; também é utilizado para a produção de fitas-teste para o controle de diabetes
	Oxida glicose a ácido 
glutâmico
	Amilase
	Aspergillus niger, A. oryzae,
Bacillus subtillis, Rhizophus spp, Mucor rouxii
	Suplemento de farinha, preparação de massa, alimentos pré-cozidos, elaboração de xaropes
	
	Invertase
	Sacharomyces cereviase
	Mel artificial
	
	Lactase
	Sacharomyces fragillis
	Hidrólise da lactose
	
	Pectinase
	Aspergillus niger, Rhizophus spp., Penicillium
	Clarificação de vinho e de sucos de frutas
	
Fonte: PETCZAR et al, 1996
6.3.1. Celulases
É uma das enzimas industriais cuja produção tem se desenvolvido pouco. Uma das maiores razões por que a utilização dessa enzima não pode se desenvolver logo deve-se ao fato de ser muito difícil sua produção por microrganismos. Por exemplo, os microrganismos vivos, que produzem celulase ativa, podiam potencialmente destruir a celulase, mas não excretavam a enzima intracelular durante fermentação. Hoje esses problemas já foram resolvidos, e celulase altamente ativa é industrialmente produzida em certos países (LIMA, 1975).
Na produção comercial de celulase por meio de fermentação de farelo, usam-se Trichoderma viride e Aspergillus niger (processo de Koji). Entretanto, a fermentação submersa é mais conveniente, embora maiores rendimento seja obtido com o processo de cultura em meio semi-sólido (LIMA, 1975).
Sabe-se também que a celulase obtida de Trichoderma viride degrada bem o papel de filtro, enquanto que a celulase obtida de Aspergillus niger hidrolisa melhor devido à carboni-metilcelulase presente (CMC). Os materiais que contêm ácidos orgânicos, por exemplo, casca de laranjas, são bons componentes de meio de cultura, e esses materiais são usados misturados com farelo de trigo (LIMA, 1975).
Sabe-se também que fermentação de Trichoderma viride pode produzir mais celulase, pela adição de pequenas quantidades de agente tenso ativo, em meio de cultura semi-sólido (LIMA, 1975).
Os resíduos, após a extração de amiloglicosidade da fermentação semi-sólida por Rhizopus sp, podem ser usados como meio de cultura, tanto para fermentação submersa como para semi-sólida com T. viride. Nesse caso, mais celulose pode ser produzida do que quando se usa o farelo de trigo como meio de cultura (LIMA, 1975).
Na produção de celulase por fermentação submersa, énecessário preparar um meio de cultura altamente concentrado. Esse tipo de meio pode ser preparado misturando-se farelo de trigo, casca de laranja, casca de soja, resíduo de extração de óleo e bagaço com solução alcalina e aquecendo-se a mistura. Após o aquecimento, neutraliza-se com ácido e separa-se o líquido. Este líquido pode ser usado como meio de cultura em fermentação submersa (LIMA, 1975).
6.3.2. Pectinases 
As enzimas pectinolíticas são largamente empregadas na indústria de alimentos, principalmente na clarificação de sucos de frutas e na eliminação de substância pécticas (polissacarídeo complexo) de alimentos vegetais. Essas enzimas têm sido produzidas industrialmente, em vários países, por fermentação, e uma variedade considerável de microrganismos pode produzi-las (LIMA, 1975).
Entre as espécies utilizadas para a produção de pectinase, temos: Neurospora crassa, Aspergillus niger, Penicillium sp., Rhizopus sp., Bacterium aeroideos, Saccharomyces fragilis, Byssochlamys fulv, Fusarium moniliforme, Botrytis cinerea, Erwinia carotenora, Clostridium laniganii, Bacillus mesentericus, Bacillus polymyxa, Phthium debaryanum, Flavobacterium sp., Pseudomonas prunicola, Sclerotinia libertiana, Coniothyrium diplodiella, Cândida utilis, Hansenula anomal, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae e Phizopus tritici (LIMA, 1975).
Atualmente, a técnica de fermentação para a produção de enzimas pectinolíticas está bem desenvolvida. Existem dois métodos principais de fermentação, sendo ambos eficientes: o da fermentação submersa e o de fermentação em meio semi-sólido, resultando na produção de enzimas pectinolíticas para a clarificação de sucos de frutas (LIMA, 1975).
Na fermentação semi-sólida, usam-se o farelo de trigo, farelo de arroz, farelo de soja ou outras substâncias pécticas, como meio de cultura. Após completa a fermentação, o meio de cultura semi-sólido fermentado (farelo fúngico) é tratado com agentes de esterilização (álcool etílico, metanol, éter, clorofórmio), para matar os fungos. Depois, seca-se e mói-se. Esse produto chama-se pectinase bruta (LIMA, 1975).
Sendo desejável, a enzima pode ser extraída do farelo fúngico com água, precipitada com solventes orgânicos, e submetida a secagem e a moagem. Esses produtos são complexos enzimáticos (enzimas pectinolíticas) que contêm várias enzimas pectinolíticas. Quando se deseja obter apenas a pectinoesterase, a poligalacturonase do complexo enzimático é inativada com uréia (LIMA, 1975).
6.3.3. Enzimas amilolíticas
As enzimas amilolíticas, tais como 
amilase fúngica, 
amilase bacteriana, amiloglicosidase e isoamilase são muito usadas industrialmente. Hoje, são produzidas em escala industrial. A 
amilase fúngica é utilizada em panificação e para auxiliar a digestão. E a 
amilase bacteriana é usada nas fábricas de papéis, em indústrias têxteis, e na liquefação de amido (LIMA, 1975).
A amiloglicosidase é uma enzima sacarificante, usada para produzir glicose a partir do amido, juntamente com 
amilase bacteriana. A isoamilase é uma enzima que rompe ligação glicosídica 
1,6- do amido, formando amilose; também é usada na produção de xarope de maltose e álcool etílico (LIMA, 1975).
A 
amilase bacteriana pode ser produzida tanto por fermentação semi-sólida como por submersa. Underkofler (1966 apud Lima, 1975) descreve a produção de 
amilase bacteriana pelo método de fermentação submersa, no que a cultura usada foi uma linhagem selecionada de Bacillus sbtilis. As culturas foram mantidas em água inclinado com caldos de nutrientes, transferidas e incubadas a 32°C, e armazenadas sob refrigeração, até serem usadas com novas repicagens, a cada dois meses.
Para inocular frascos semeadores para fermentação industrial, Underkofler utilizou meios de cultura sólidos de ágar, com a seguinte composição: farinha de soja, 1,85%; leveduras de cerveja autolisadas, 1,50%; solúveis secos de destilaria, 0,76%; hidrolisado enzimático de caseína, 0,65%; lactose, 4,75%; 
 .7
, 0,04%; Antiespumante, 0,05%; 
, 90,40 g (LIMA, 1975).
As fermentações foram levadas com aproximadamente 5.000 litros de meio, preparados com a adição dos ingredientes adequados sobre a água previamente colocada no fermentador e mantida em agitação constante. A esterilização foi feita a 121°C, por 35 min, com constante agitação, e aquecimento por injeção de vapor na camisa. O resfriamento foi feito por circulação de água gelada pela camisa, até o meio atingir 34°C. A pressão interna foi mantida ao redor de 0,34 atm, com mínima variação, para evitar a formação de excessiva de espuma. Para prepara a “semente”, foram inoculadas frascos de Fernbach de 2 litros, cada um contendo 1.000 mL de caldo de nutriente, com culturas de ágar em estoque, e incubados por 12 h a 32°C num agitador alternativo. As culturas dos frascos foram então usadas para inocular um pequeno fermentador (pré-fermentador) contendo aproximadamente 160 litros de meio esterilizado, de composição semelhante à do meio do fermentador principal (LIMA, 1975).
A semente foi cultivada por 10 h a 32°C com agitação a 150 rpm e aeração de 141 litros por minutos, a uma sobre pressão interna de 0,2 atm. No fim desse período, a “semente” foi examinada quanto à pureza, e transferida assepticamente para o fermentador, onde a fermentação foi desenvolvida nas seguintes condições: temperatura, 34°C; sobre pressão de 0,34 atm; agitação, 170 rpm; aeração, 991 litros/min. Amostras forma tomadas imediatamente após a inoculação e a cada 4 h, durante as primeiras 24 h, e a cada 2 h até terminar a fermentação, para verificar a atividade amilolítica das amostras (LIMA, 1975).
Quando duas amostras sucessivas não mostraram qualquer aumento na atividade da amilase, o que ocorreu após 48 h, a fermentação foi interrompida, interrompendo-se a aeração e resfriando-se até 21°C. A curva da Figura 7 foi obtida para representar graficamente as análises de controle.
Figura 7. Produção de enzimas por Aspergillus niger 
(Fonte: PELCZAR JR et al.,1996)
Para recuperar a enzima, foram adicionados 2% de terra diatomácea aos 5.000 litros de líquido fermentado, e feita uma filtração a vácuo.O filtrado (cerca de 4.200 litros) foi transferido para um tanque de precipitação, onde foram adicionados cerca de 11.400 litros de álcool, vagarosamente, sob agitação contínua. Terminadas a adição e a agitação, deixou-se decantar o precipitado e o líquido limpo sobrenadante foi separado (LIMA, 1975).
Foram adicionados mais 4.000 litros de álcool ao precipitado com agitação cuidadosa por alguns minutos, formando suspensão. Após nova decantação, o líquido sobrenadante foi eliminado. O precipitado é recuperado por centrifugação ou por filtração em filtro e depois transferido para um secador a vácuo. A seguir, é moído para transformar em pó fino (LIMA, 1975).
6.3.3.1. Produção de amilase fúngica
A amilase fúngica também pode ser produzida por fermentação semi-sólida ou submersa. Farelo de fungo pode ser produzido por fermentação semi-sólida em escalas de laboratórios, em instalação-piloto ou comercial (LIMA, 1975).
Altas concentrações da enzima 
amilase foram produzidas por linhagens de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, A. Alliaceus, A. foetidus e A. wentii. E, entre estas, A. niger que apresentou a maior eficiência. Vários meios podem ser usados na produção de amilases fúngicas por método de cultura submersa. O meio utilizado por Le Mense (1947 apud Lima, 1975) foi resíduo da destilação de substratos fermentados de milho e sorgo, 2% de farinha de milho e 0,5% de carbonato de cálcio.
A cultura licorosa é obtida após o desenvolvimento do fungo, em três a cinco dias, com alta atividade de 
amilase. Pool e colaboradores usaram o meio contendo 5% de solúveis secos de destilaria, 1% de fubá, 0,8% de CaCO3.
6.3.3.2. Produção de amiloglicosidase
A amiloglicosidase pode ser produzida comercialmente por fermentação submersa ou semi-sólida. Geralmente as espécies de Rhizopus são usadas na produção da enzima em fermentação submersa.Smiley e colaboradores (1964 apud Lima, 1975) publicaram o método de produção de amiloglicosidase por fermentação submersa. Utilizaram o fungo Aspergillus niger, cultivado num fermentador de 20 litros, com aeração de um volume de ar por volume de meio por minuto, com uma velocidade de agitação igual a 600 rpm. O meio consistiu em 2 kg de farinha de milho, 40 g de malte tratado com giberelina-malte, 8 litros de água e pH ajustado a 5,5. Durante o processo de esterilização, a temperatura foi mantida a 60°C por alguns minutos para hidrolisar o amido de milho pelo malte de cevada, e depois, elevada a 120°C e mantida por 20 min, para esterilizar a massa e inativar as enzimas do malte. O fermentador foi inoculado com 800 mL de cultura e operou durante 4 dias a 35°C com um inóculo cultivado em frasco de Fernbach, num agitador rotativo, num meio que consistiu em 5% de milho em grão e 0,25% de extrato de levedura. Após se completar a fermentação, a enzima foi obtida misturando-se água e filtrando-se para remover materiais sólidos. A enzima do filtrado é precipitada por meio de solventes orgânicos com o álcool. E seca e moída.
6.3.3.3. Produção de isomilase (ou pullulanase)
A 
enzima de batata e pullulanase bacteriana hidrolisam a ligação glicosídica 
1,6 na pullulanase e nas dextrinas-limites e, também, na amilopectina. O Aerobacter aerogenes tem produzido pullulanase que quebra a ligação glicosídica 
1,6 da amilopectina (LIMA, 1975).
Fujio e colaboradores (1970 apud Lima, 1975) publicaram a produção de isoamilase por Aerobacter aerogenes. Utilizaram vários meios de cultura na produção de isoamilase e selecionaram o seguinte meio: amido de batata, 2%; peptona, 1,5%; extrato de levedura, 0,1%; NaCl, 0,5%; 
 0,1%; 
, 0,02%; e 
, 0,002%, em água destilada.
O microrganismo foi cultivado em tubos inclinados de Bennet por três dias, a 30°C, inoculado em 100 mL do meio, e reincubado a 30°C com agitação. A produção de isoamilase começou após três dias e seu nível máximo foi atingido no quarto dia, enquanto que o crescimento máximo das células deu-se em menos de três dias. Durante o cultivo, o pH incial, que era 7,0, elevou-se para 8,6 em quatro dias (LIMA, 1975).
6.4. AMINOÁCIDOS
Os microrganismos que produzem aminoácidos podem ser bactérias, fungos, as leveduras e os actinomicetos.
6.4.1. Produção do Ácido Glutâmico
Dois são os principais processos utilizados atualmente na indústria. Em um deles, o microrganismo Micrococcus glutamicus transforma diretamente os açúcares em ácido glutâmico. O meio típico é o seguinte: glicose, 10% ; uréia, 0,8%; caseína hidrolisada, 0,5%; água de milho, 0,25%; fosfato monopotássico, 0,10%; sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,025% (LIMA, 1975).
A glicose pode ser substituída por outros açúcares (levulose, manose), ácidos orgânicos (succínico, acético) ou por fontes de outros carboidratos como o amido da batata ou os melaços, conforme o local da fábrica. Também, ao invés de uréia, podem ser usados peptonas, sais inorgânicos de amônio, caseína, derivados de pescado, de soja, etc (LIMA, 1975).
É importante adicionar biotina, na concentração de 1 a 5 
g/litro. A finalidade da mesma é orientar o metabolismo do microrganismo de maneira tal que o mesmo passe a produzir quantidades grandes de aminoácidos e não se desvie para a formação de outros produtos (LIMA, 1975).
Também a presença de íons de amônio e de ferro, geralmente colocados durante a fermentação, auxilia a formação do ácido glutâmico. As condições dessa fermentação se mantêm, genericamente, com o pH próximo de 8 com amoníaco, a temperatura entre 27 e 30°C, e a aeração elevada (LIMA, 1975).
A concentração chega a 30 g de ácido glutâmico por litro de mosto, após três dias de fermentação (rendimento de mais de 30% sobre o carboidrato). Quando se usa o Brevibacterium lactofermentus o meio pode conter: glicose (
10%), uréia, hidrolisado de sementes de soja, além de traços de fatores essenciais de crescimento (LIMA, 1975).
A fermentação é mantida a 30-31°C e termina após 45h. O rendimento é de quase 50% em relação à glicose (cerca de 50 g de ácido glutâmico por litro de mosto).
O segundo processo-padrão tem duas etapas: na primeira, chega-se ao ácido 
-ceto-glutárico, inoculado em meio contendo uma fonte de carbono (geralmente carboidrato), um composto nitrogenado inorgânico e alguns sais minerais. A transformação do ácido 
-ceto-glutárico no aminoácido pode ser efetuada também com os seguintes gêneros de microrganismos: Aerobacter, Asprgillus, Erwinia, Hansenula, Micrococcus, Mycotorula, Penicillium, Pseudomonas, Rhizopus, Sccharomyces, Xnthomonas, Aeromonas entre outros. O Pseudomonas ovalis é muito usado, pois dá um rendimento próximo de 100% (LIMA, 1975).
Deve-se levar em consideração, porém, que analogamente ao caso das leveduras, por exemplo, a aeração é de fundamental importância: para a formação do produto da fermentação deve ser anaeróbia, valendo o inverso quando se deseja multiplicar o microrganismo. Um meio utilizado é: ácido 
-ceto-glutárico, 10 g; cloreto de amônio, 5 g; fosfato monoácido de potássio, 1 g; sulfato de magnésio heptahidratado, 0,5 g; caseína hidrolisada, 0,08 g; extrato de levedura, 0,07 g; água, 1 litro. A aeração é feita durante 18 h a 30°C. Separam-se os microrganismos por centrifugação, lavam-se e inoculam-se em mosto de composição análoga. Inicia-se então nova fermentação, desta vez sem aeração, à mesma temperatura e mantendo-se o pH entre 7 e 8 (LIMA, 1975).
A transformação do ácido 
-ceto-glutárico em ácido glutâmico pode ser efetuado através de enzimas de origem microbiana, com muito bom rendimento. Usam-se principalmente a transaminase, de Escherichia coli ou de outras bactérias e a desidrogenase (LIMA, 1975).
Uma suspensão celular de Saccharomyces cerevisiae lisado também pode transformar ácido cítrico (sob a forma de citrato de sódio) em ácido glutâmico, na presença de um sal de amônio e de traços de um sal de ferro. Temperatura entre 25 e 25°C e pH ao redor de 7 (LIMA, 1975).
6.4.2. Produção de Lisina
Como no caso do ácido glutâmico, também aqui existem dois tipos principais de processamento. No processo direto, com mutante de Micrococcus glutamicus, devem-se introduzir no meio quantidades muito pequenas de biotina e de homosserina e controlar as ótimas de metionina e treonina. As concentrações maiores do que as consideradas ótimas têm papel justamente inverso: inibem a formação da lisina. O método fornece 20 g de aminoácido por litro (LIMA, 1975).
O processo em duas etapas chega inicialmente ao precursor, ácido diaminopimélico por fermentação aeróbia (agitação e aeração) com a Escherichia coli. A fermentação dura três dias, com temperatura de 28°C e pH mantido entre 7 e 7,5 com KOH. Um meio-padrão para a multiplicação e o crescimento do microrganismo pode ser o seguinte: glicerol, 0,5%; fosfato monoácido de amônio, 0,5%; água de milho, 0,5%; enquanto que, para a fermentação propriamente dita, pode ser usado um mosto contendo: glicerol, 6%; fosfato monoácido de amônio, 4%; água de milho, 4%; carbonato de cálcio, 0,5%; óleo de soja. Ambos os meios citado acima devem ser esterilizados após o acerto do pH, e este último inoculado com um volume de 1 a 5% de células (LIMA, 1975).
O ácido diaminopimélico, obtido na concentração de cerca de 10g/litro por esse procedimento, é então transformado em lisina através do Aerobacter aerogenes, em mosto de composição semelhante ao anterior. É interessante adicionar, nesse caso, ácido cítrico, vitaminas do complexo B e mesmo etilenodiaminotetracetato de sódio em quantidades muito pequenas, para melhorar o rendimento. Isso se dá em um dia, a 28°C, com agitação e aeração (LIMA, 1975).
6.4.3. Produção de Triptofano
Também para a biossíntese microbiana desse aminoácido, é interessante usar no meio de cultura uma substância para favorecer a transformação: o indol, que deve ser colocado durante o transcurso da fermentação. Trabalha-se a 2°C, durante cinco dias, com rendimento