Bioquimismo 2018

Prévia do material em texto

1 1 
BIOQUIMISMO BACTERIANO 
▫ O que é identificar? 
▫ Qual é o primeiro passo a ser efetuado? 
▫ Quais são as características que devem ser observadas, 
para se identificar um microrganismo? 
2 2 
 Morfologia: morfotipo 
 Metabolismo: biotipo 
 Virulência / patogenicidade: patótipo 
 Função antigênica: sorotipo 
 Homologia do DNA: genótipo 
BIOQUIMISMO BACTERIANO 
3 
 Fermentação 
 Putrefação 
 
 
 
 degradação microbiana de carboidratos 
 degradação microbiana de proteínas 
 degradação microbiana de lipídeos 
 degradação microbiana de ácidos 
nucléicos 
BIOQUIMISMO BACTERIANO 
 enzima x substrato 
4 
 Evidenciação da produção de enzimas: 
 
 1 - integridade do substrato 
 Ex: gelatina 
 2 - pesquisa de subprodutos 
 * inespecíficos 
 Ex: ácido, gás, aminas 
 * específicos 
 Ex: acetoína, H2S, indol, putrescina 
 3 - pesquisa da enzima 
 Ex: catalase, oxidase 
BIOQUIMISMO BACTERIANO 
5 
Composição do meio 
Componentes Utilização Principal 
Peptona 17g Fonte de energia, carbono e nitrogênio 
Proteose peptona 3g Fonte de nitrogênio 
Lactose 10g Fonte de energia e carbono 
Sais Biliares 1,5g Inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas e 
Gram-negativas fastidiosas. 
Cristal violeta 0,001g Inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas. 
Cloreto de Sódio 5g Sal inorgânico 
Vermelho neutro 0,03g Indicador de pH 
Agar 13,5g Agente solidificante 
pH final 7,1 +/- 0,2 
6 
 Algumas cepas de organismos Gram-positivos não são 
inibidos ou são parcialmente 
 
 
 Outros Gram-negativos não Enterobacteriaceae, como 
Pseudomonas e Aeromonas, também podem crescer 
neste meio 
 
7 
Interpretação do Ágar MacConkey 
BACTÉRIA MORFOLOGIA DAS COLÔNIAS 
E. coli Coloração vermelha ou rosada. Não são mucóides. Podem 
ser rodeadas de um precipitado opaco de sais biliares. 
Klebsiella sp Grandes,rosadas, mucóides. 
Enterobacter sp Grandes,rosadas. Não mucóides. 
Serratia sp Vermelhas ou rosadas. Não mucóides. 
Citrobacter sp 
Arizona sp 
Incolores, transparentes. 
Vermelhas,se fermentam a lactose. 
Proteus sp Incolores e transparentes. 
Pseudomonas sp Incolores, até café-esverdeado, odor adocicado 
característico. 
Salmonella sp Incolores, transparentes. 
Shigella sp Incolores, transparentes ou levemente rosadas. 
Staphylococcus sp Puntiformes, rosa-pálido,opacas e escassas. 
8 
Interpretação do Indicador de pH 
 
 amarelo 
 
 elevação do pH (8.0) 
 
 
Vermelho Neutro = pH Neutro 
 
 
 
 diminuição do pH (6.8) 
 
 vermelha 
 
9 
Interpretação da Fermentação da 
Lactose 
Lactose 
possui a enzima beta-galactosidade 
não possui a enzima 
produção de ácidos 
pH 
colônia vermelha 
lactose positiva 
não ocorre produção de ácidos 
► 
colônia incolor 
► lactose negativa 
10 
Meio Ágar SS 
(SALMONELLA-SHIGELLA) 
 Meio diferencial (lactose positiva e lactose negativa) 
 Meio seletivo (Sais Biliares) 
 Recomendado: isolamento de Shigella e Salmonella 
 Materiais clínicos: fezes e urina 
 Outras amostras: alimentos frescos ou enlatados 
 
11 
Composição do Meio 
Componentes Utilização Principal 
Extrato de carne 5g Fonte de vitaminas e sais 
Proteose peptona 5g Fonte de nitrogênio 
Lactose 10g Fonte de energia e carbono 
Sais biliares 8,5g Inibe o crescimento de bactérias Gram-
positivas 
Citrato de sódio 8,5g Sal inorgânico 
Tiossulfato de sódio 8,5g Fonte de enxofre 
Citrato férrico 1g Fonte de ferro 
Verde brilhante 0,33g Inibe o crescimento de bactérias Gram-
positivas. 
Vermelho neutro 0,025g Indicador de pH 
Ágar 13,5g Agente solidificante 
pH final 7,0 +/- 0,2 
12 
Interpretação do Ágar SS 
Bactérias Morfologia das colônias 
Shigella e a maioria das 
Salmonella 
Claras, incolores transparentes 
Escherichia coli Pequenas, que vão de rosa a vermelha 
Enterobacter sp 
Klebsiella sp 
De maior tamanho que as E.coli, 
mucóides, opacas, de creme pálido até 
rosa 
Proteus sp e algumas Salmonella Incolores , transparentes, com centro 
negro, se produzir H2S 
13 
Interpretação da Produção de H2S 
4H+ + 4e + 3S2O3
2- 
em meio ácido 
2SO3
2- + 2H2S 
tiossulfato redutase 
Gás ác. sulfídrico + íons férrico sulfeto ferroso 
precipitado negro 
14 
CALDO SELENITO 
 Meio de enrequecimento (selenito de sódio) 
 Recomendado:para detecção de Salmonella sp 
 Materiais clínicos:qualquer amostras biológicas 
 Outras amostras:alimentos,produtos derivados de leite 
e outros de importância sanitária de apresentarem 
grandes concentrações de bactérias mistas 
 
15 
Composição do Meio 
Componentes Utilização Principal 
Peptona 5g Fonte de nitrogênio 
Lactose 4g Fonte de energia e carbono 
Selenito de sódio 4g Inibe o crescimento de E.coli e 
muitas cepas de Shigella 
Fosfato de sódio 10g Sal inorgânico 
pH final 7,0 +/- 0,2 
16 
Interpretação do Caldo Selenito 
Após algumas horas da inoculação da amostra o 
caldo torna-se turvo.Visto que outros 
enteropatógenos da microbiota intestinal 
podem em poucas horas superar o 
crescimento de Salmonella, recomenda-se 
subculturas em ágar SS dentro de 8 a 12 horas. 
 
17 
Identificação presuntiva de enterobactérias 
baseado num conjunto de provas bioquímicas 
TSI:Tríplice Açúcar e Ferro 
► TSI apresenta informações quanto aos testes de 
produção de: 
 Gás, à partir da fermentação da glicose 
 Ácido, à partir da fermentação da glicose 
 Ácido, à partir da fermentação da lactose e/ou 
sacarose 
 H2S-sulfeto de hidrogênio (gás) 
 
18 
Composição do Meio 
 Peptona de caseína 10g 
 Peptona de carne 10g 
 Glicose 1g 
 Lactose 10g 
 Sacarose 10g 
 Cloreto de sódio 5g 
 Sulfato férrico amoniacal 0,2g 
 Tiossulfato de sódio 0,2g 
 Vermelho de fenol 0,025g 
 Ágar 13g 
 pH final 7,3 +/- 0,2 
19 
Interpretação do Indicador de pH 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vermelho de fenol = pH Neutro 
vermelho 
elevação do pH (8,0) 
amarelo 
diminuição do pH (6,8) 
20 
TSI 
21 
Indentificação dos Bacilos Gram 
Negativos 
 
 Identificação presuntiva: TSI e outros 
 Identificação bioquímica 
 Identificação sorológica 
 Provas de patogenicidade 
 
 
22 
Identificação Bioquímica 
 De primordial importância para a identificação das 
bactérias, é o estudo de suas características bioquímicas, uma 
vez que é comum a ocorrência de culturas bacterianas similares 
em suas características morfológicas e culturais e diferenciais em 
suas reações metabólicas. 
 Através das chamadas Provas Bioquímicas, podemos 
detectar à capacidade que têm as bactérias de desdobrar certos 
substratos como (açúcares,proteínas e gorduras). 
 
23 
Indol 
 O indol é um dos produtos do metabolismo do 
aminoácido triptofano 
 
 Princípio: A prova do indol está baseada na 
formação de um complexo de cor vermelha quando o 
indol reage com o grupo aldeído do p-
dietilaminobenzaldeído (que está presente no 
reativo de Kovac´s) 
 
24 
Indol 
 
 Peptona............................30g 
 Extrato carne......................3g Ferro peptonado..............0,2g 
 Tiossulfato de sódio.....0,025g 
 Ágar....................................3g 
 Água destilada............1000ml 
25 
Interpretação 
Triptofano 
triptofanase 
Indol + ác.pirúvico + amônia 
p-dimetilamino-benzaldeído (reativo de Kovac´s) 
+ 
composto quinoidal vermelho 
26 
Interpretação 
Resultado Cor da reação Interpretação 
Positivo Vermelho Presença de Indol 
Negativo Amarelo Ausência de Indol 
27 
Citrato 
► As bactérias utilizam este composto como a única fonte de carbono 
para o metabolismo e crescimento 
 Princípio: A utilização de citrato por uma bactéria é detectada 
em meio de citrato, através da produção de subprodutos alcalinos. 
O meio contém citrato de sódio, um ânion, como única fonte de 
carbono e fosfato de amônia como única fonte de nitrogênio. As 
bactérias capazes de utilizar o citrato também são capazes de extrair 
nitrogênio do sal de amônio, com produção de amônia, levando à 
alcalinização do meio,à partir da conversão do NH+3 em hidróxido 
de amônia (NH4OH). 
 
Citrato de sódio 
+ 
Fosfato de amônia 
Hidróxido de amônia 
28 
Indicador de pH 
Indicador de pH Azul de bromotimol 
azul 
amarelo 
pH 7,0 
29 
URÉIA 
A uréia é uma diamina do ácido carbônico. Os microrganismos que 
possuem a enzima urease têm a capacidade de hidrolisar a uréia com 
liberação de amônia. 
 
 
 
 
 
 
Todas as aminas são facilmente hidrolisadas com liberação de amônia e 
dióxido de carbono 
 
NH3 
CO2 
 
 Princípio: A urease é uma enzima presente em muitas 
espécies de microrganismos que podem hidrolisar a uréia 
 
30 
Provas de Identificação 
Uréia ágar base Christensen 
 
 Peptona..............................................1g 
 Glicose...............................................1g 
 Cloreto de sódio.................................5g 
 Fosfato dipotássio..............................2g 
 Vermelho de fenol.......................0,012g 
 Ureia.................................................20g 
 Ágar..................................................12g 
 
31 
Interpretação 
Resultados Cor do meio Interpretação 
Positivo Rosa Meio Alcalino 
Negativo Amarelo Ácido 
 NH2-C-NH2 + 2H2O 
urease
 CO2 + H2O + 2NH3 (NH4) 2CO3 
 
 O 
32 
 
Descarboxilases 
 Muitas espécies de bactérias possuem enzimas capazes de 
descarboxilar aminoácidos específicos do meio teste, 
liberando aminas de reação alcalina e dióxido de carbono 
como produtos. 
 As descarboxilases são um grupo de enzimas substrato-
específicas, capazes de atuar sobre a porção carboxila(COOH) 
dos aminoácidos. Cada enzima descarboxilase é específica 
para um aminoácido. 
 
33 
 Lisina, ornitina e arginina são os três 
aminoácidos habitualmente avaliados na 
identificação das enterobactérias e produzem as 
seguintes aminas específicas: 
 
 Lisina  cadaverina 
 
 
 Ornitina  putrescina 
 
 
 Arginina  citrulina(agmatina) 
 
34 
 Princípio: Deve-se usar um caldo base (Moeller) 
adicionando-se o aminoácido a ser avaliado ao meio antes da 
inoculação do microrganismo em estudo. Devemos utilizar um 
controle que consiste de um tubo com meio base sem o 
aminoácido. Os tubos são incubados em condições de 
anaerobiose (óleo mineral estéril). Durante o período inicial de 
incubação o meio de ambos os tubos tornam-se amarelos devido 
à fermentação de glicose. Se o aminoácido for descarboxilado, 
formam-se aminas alcalinas e o meio volta á cor púrpura original. 
 
35 
Interpretação do Indicador de pH 
Púrpura de bromocresol = pH Neutro 
púrpura, roxa 
elevação do pH(8,0) 
diminuição do pH(6,8) 
amarelo 
Resultado 
▪ tubo controle: amarelo / tubo aminoácido teste: amarelo 
▪ tubo controle: roxo / tubo aminoácido teste: roxo 
▪ tubo controle: amarelo / tubo aminoácido teste: roxo 
 ► 
► 
 ► 
36 
 
Meio Malonato de Sódio 
 Extrato de levedura 1g 
 Sulfato de amônia 2g 
 Fosfato de potássio 0,6g 
 Mono potássio 0,4g 
 Cloreto de sódio 2g 
 Malonato de sódio 3g 
 Dextrose 0,25g 
 Azul de bromotimol 0,025g 
 
37 
Interpretação 
O sulfato de amônia é usado como fonte de 
nitrogênio. E o malonato de sódio como fonte de 
carbono 
 
Positivo: bom crescimento, cor azul 
Negativo: sem crescimento 
38 
Provas de Identificação 
Meio Fenilalanina 
 D-fenilalanina...................................2g 
 Extrato de levedura..........................3g 
 Cloreto de sódio...............................5g 
 Fosfato de sódio...............................1g 
 Ágar................................................12g 
 Água destilada..........................1000ml 
39 
Interpretação 
Fenialanina + ½ O2 amônia + ác.fenilpirúvico 
Fenilalanina 
 desaminase 
 adiciona 
composto de coloração verde Cloreto férrico 
40 
Provas de Identificação 
Ágar DNase 
 Triptose 20g 
 Ácido desoxiribonucléico 2g 
 Cloreto de sódio 5g 
 Ágar 15g 
 Verde de metila 0,05g 
 pH =7,3 +/- 0,2 
 
(+) zona clara ao 
redor das colônias 
41 
Provas de Identificação 
Ágar DNase 
(+) zona rosa ao 
redor das colônias 
 Triptose 20g 
 Ácido desoxiribonucléico 2g 
 Cloreto de sódio 5g 
 Ágar 15g 
 Azul de toluidina 0,10g 
 pH =7,3 +/- 0,2 
 
42 
Provas de Identificação 
Ágar Gelatina 
 Extrato de carne.........................3g 
 Peptona......................................5g 
 Gelatina..................................120g 
 pH final 6,8 
Fonte de Nitrogênio e Aminoácidos 
43 
Interpretação 
 
 
Positiva : zona de reação apresenta-se transparente 
Negativa : enegrecimento difuso do meio 
proteína + H2O polipeptídeos 
gelatina 
proteinase 
polipeptídeos + H2O aminoácidos gelatinase 
peptidase 
44 
 
Provas de Identificação 
Oxidase 
 
 Reativo de Kovacs 
 tetrametil-p-fenilodiamina.....................0,1g 
 água destilada.....................................10ml 
 
• Reativo de Gordon e Mcleod 
 dimetil-p-fenilodiamina........................0,15g 
 água destilada....................................10ml 
 
• DISCOS E TIRAS REATIVAS 
 
 
45 
Interpretação 
 
 
 
 
 
As colônias bacterianas que possuem atividade de citocromo 
oxidase desenvolvem em 10 segundos uma cor azul 
escura no local de inoculação 
46 
Provas de Identificação 
Catalase 
Composição 
 H2O2..........3% 
 
 Bactéria + 2H2O2 catalase 2H2O + O2 
 
47 
Interpretação 
 Positivo: presença imediata de bolhas, a produção de 
efervecência indica a conversão do H2O2 em água e 
oxigênio gasoso 
 
 Negativo: ausência de bolhas ou efervescência 
48 
Provas de Identificação 
Teste Vermelho de Metila (VM) 
Composição do meio Clark e Lubs: 
 
 Peptona tamponada.....................7g 
 Glicose.........................................5g 
 Fosfato dipotássico......................5g 
 Água destilada.....................1000ml 
 pH final=6,9 
 
49 
Indicador de pH 
 Vermelho de metila...............0,1g 
 Álcool etilíco a 95%............300ml 
 Água destilada...................200ml 
 
 
 
 Glicose 
 
 
ác.láctico 
ác.acético 
ác.fórmico 
ác.etílico 
ác.succínico 
H2 + CO2 
50Interpretação 
Positivo: desenvolvimento de uma cor vermelha indica 
produção de ácido suficiente para baixar o pH a 4,4. 
 
Negativo: produção de quantidades menores de ácido 
a partir do substrato, pode-se desenvolver uma cor 
alaranjada entre o amarelo e o vermelho. 
51 
Provas de Identificação 
Teste de Vogues Proskauer (VP) 
Composição 
 Mesmo meio para o teste VM 
 Meio de Clark e Lubs 
 
 2,3-butanediol acetoína 
 
 
52 
Interpretação