relatório eletroforese em gel de agarose

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INSTITUTO LATINO-AMERICANO DE 
CIÊNCIAS DA VIDA E DA NATUREZA (ILACVN) 
Curso: Biotecnologia 
Professora: Sanely Lourenco Da Costa 
 
 
 
 
 
 
Prática 3 
“Eletroforese de Gel de Agarose e sua preparação” 
 
 
 
 
 
 
 
Sara Cristina Wandrowski Froes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Foz do Iguaçu, 04 de setembro de 2018. 
 
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1. Introdução 
Eletroforese é o método utilizado para a separação de macromoléculas, como 
fragmentos de ácidos nucleicos e proteínas, de acordo com suas taxas específicas de 
migração em um campo elétrico e suas propriedades físicas, como a massa. O processo 
é realizado em uma matriz porosa (gel de agarose, poliacrilamida) de modo que a 
migração ocorra de acordo com as suas propriedades físicas (BLOOM, Mark V. et al. 
1996). 
Os fragmentos de DNA migram em direção ao pólo positivo, uma vez que têm carga 
elétrica negativa, conferida pela ionização dos seus grupos fosfato. Após a migração 
eletroforética, todas as moléculas de DNA de mesmo tamanho ficam agrupadas em uma 
determinada região do gel e são visualizadas como uma banda, pois a matriz porosa 
funciona como um filtro inversamente proporcional ao tamanho da amostra (BLOOM, 
Mark V. et al. 1996). 
Podemos dividir o procedimento de eletroforese em quatro etapas: preparação do gel 
de agarose, aplicação das amostras, eletroforese e análise dos fragmentos separados. A 
taxa de migração do DNA em um gel de agarose depende de quatro fatores principais: da 
concentração de agarose no gel, da corrente aplicada, da configuração das moléculas de 
DNA e do tamanho do DNA fragmentado. As moléculas de DNA migram na matriz de 
aga-rose com taxas diferentes, que são inversamente proporcionais ao log10 do seu peso 
molecular. Assim, o peso molecular de um fragmento de interesse pode ser deter-minado 
comparando-se sua mobilidade com a mobilidade de moléculas padrão, com pesos 
moleculares conhecidos (BLOOM, Mark V. et al. 1996). 
A concentração da agarose tem um papel importante nas separações eletroforéticas, 
uma vez que ela determina o tamanho dos poros da matriz e, consequentemente, a 
amplitude dos tamanhos de fragmentos que podem ser separados nesse processo 
(BLOOM, Mark V. et al. 1996). 
A migração de moléculas de DNA no gel de agarose depende da voltagem aplicada. 
A voltagem aplicada a um gel gera um campo elétrico com uma força que é definida pelo 
comprimento do gel e pela diferença de potencial entre as suas extremidades (V/cm). A 
velocidade de migração do DNA é proporcional à voltagem. Quanto maior a voltagem, 
maior a velocidade de migração. Porém, em voltagens muito altas as moléculas maiores 
migram com uma velocidade proporcionalmente maior do que as menores (BLOOM, 
Mark V. et al. 1996). 
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Moléculas de DNA com mesmo peso molecular, mas com configurações espaciais 
diferentes, migram com velocidades diferentes em um gel. Assim, moléculas circulares 
superenroladas, moléculas circulares mas relaxadas por causa de cortes em uma cadeia e 
moléculas lineares apresentam migração diferencial (BLOOM, Mark V. et al. 1996). 
 
2. Objetivos 
 Realizar a preparação do gel de agarose; 
 Compreender o procedimento de eletroforese e executá-lo. 
 
3. Materiais e métodos 
Para a preparação do gel de Agarose, pesou-se 0,4 g de agarose (0,8%) em um 
erlenmeyer, e então, adicionou-se 50 ml da solução tampão TBE 1, homogeneizando a 
solução, e após a homogeneização, o erlenmeyer foi levado ao microondas, 
primeiramente duas vezes por 15 segundos, e duas vezes por 5 segundos, estando a 
solução translúcida, foi vertida na cuba de eletroforese e o pente foi colocado, para formar 
os poços aonde seria depositada a amostra. 
O DNA purificado de Escherichia coli foi retirado da geladeira para realizar o 
processo da eletroforese. Primeiramente com a micropipeta foram colocados 2 μL do 
corante GelRed em um papel de nitrocelulose, em seguida foram adicionados 6 μL da 
solução com ácidos nucleicos à alíquota de GelRed no papel de nitrocelulose. Após, sem 
retirar a micropipeta, fez-se a ressuspenção dos dois compostos com movimento up and 
down. O resultante de 8 μL da mistura de GelRed e solução com DNA foi cuidadosamente 
aplicada no poço do gel de agarose, afim de não romper as paredes do gel. Em seguida a 
aplicação dos materiais preparados por outros grupos e a solução tampão, os eletrodos da 
cuba de eletroforese foram ligados. 
A placa de gel foi analisada quarenta minutos depois do início da eletroforese e foi 
posteriormente levada ao transiluminador para melhor visualização através da incidência 
de raios UV. 
Quadro 1. Materiais e Reagentes. 
Materiais Reagentes 
Micropipetador (1-10 μL) e ponteiras Agarose 0,8% 
Eppendorf de 1,5 ml TBE 1x 
Cuba de eletroforese Corante GelRed® 
Papel de nitrocelulose Gel de Agarose 
Erlenmeyer DNA purificado de e. coli 
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Proveta 
Microondas 
 
4. Resultados e discussão 
A matriz usada comumente na separação de moléculas de DNA com tamanhos 
variando entre 100 e 30.000 pares de bases é o gel de agarose, uma forma de ágar 
altamente purificada. A matriz porosa do gel de agarose serve como uma peneira 
molecular através da qual as moléculas movem-se com velocidades diferentes, 
inversamente proporcionais ao seu tamanho. Assim, quanto menor for a molécula, maior 
será a distância que ela percorre em um determinado período de tempo (BLOOM, Mark 
V. et al. 1996). O gel de poliacrilamida apresenta algumas desvantagens. Entre elas, 
destaca-se o fato da poliacrilamida em solução, isto é, quando não polimerizada, ser 
neurotóxica. Assim, a preparação do gel exige certa cautela. Além disso, a preparação é 
mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para 
ajudar na polimerização e mais tempo para que a polimerização ocorra propriamente 
(CORRÊA, E. M. & POSSIK, P. A.) 
Como a eletroforese tem como fundamento o movimento das partículas de acordo 
com o seu potencial elétrico, é necessário que o meio seja mantido tamponado para que 
haja eficiência do método. Assim, é utilizada a solução tampão TBE 1x, sendo uma 
solução de Tris-Ácido Bórico-EDTA, em que o Tris e o ác. Bórico tamponam a solução, 
evitando assim a protonação dos ácidos nucleicos mantendo seu potencial elétrico. Além 
disso, o EDTA EDTA se a liga a íons que atuam como co-fatores para enzimas que 
degradam o DNA, desse modo protegendo-o (BLOOM, Mark V. et al. 1996). 
Geralmente para esta técnica, utiliza-se o brometo de etídio como corante, mas, pelo 
seu caráter mutagênico, outras alternativas ao seu uso surgiram, como o GelRed, que tem 
se destacado por não ter ação mutagênica. Sua estrutura ainda não é de conhecimento 
público por estar sob processo de patente, porém sabe-se que sua massa molar é pelo 
menos 3 vezes maior do que a do primeiro. Comumente, o brometo de etídeo, e mais 
recentemente o GelRed são utilizados segundo diferentes protocolos, utilizados no gel de 
agarose antes da polimerização do mesmo, em banho, após a eletroforese ou diretamente 
na amostra. Apesar de ser considerado mais seguro para o método, estudos apontam que 
pela sua maior massa, sua aplicação direta na amostra pode retardar a corrida do DNA na 
eletroforese (BRESSANI, 2010). 
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Após o término da corrida, não foi possível visualizar as bandas de DNA (alelos), no 
transiluminador, assim como com a irradiação de luz UV também não foi possível 
visualizar a presença de ácidos nucleicos, o que significa que o processo de extração não 
resultou no produto esperado. Durante o processo de extração, o excesso de resfriamento,o pouco tempo de centrifugação que gerou uma precipitação incompleta do pellet, ou a 
demora na execução de algumas etapas são algumas das causas de erro. 
Outra cauda de erro importante é o rompimento da integridade dos poços de gel de 
agarose, no momento da aplicação da amostra para a corrida. Quaisquer defeitos causados 
na forma dos poços de aplicação dos géis de agarose, durante a modelagem do gel ou 
durante a aplicação das amostras, podem ser causa importante de problemas na 
eletroforese. Para que haja a formação de bandas de DNA bem definidas após a migração 
é necessário que as moléculas de DNA de mesmo tamanho entrem no gel exatamente ao 
mesmo tempo. Qualquer fator que deforme a face interna anterior do poço e que tire esta 
face da posição de perpendicularidade em relação ao campo elétrico vai alterar o aspecto 
das bandas de DNA formadas (BLOOM, Mark V. et al. 1996). 
 
5. Bibliografia 
BLOOM, Mark V. et al. Laboratory DNA science: an introduction to recombinant 
DNA techniques and methods of genome analysis. Benjamin/Cummings Publishing 
Company, Inc., 1996. 
CORRÊA, E. M. e POSSIK, P. A. (“Biologia Molecular – Técnicas Moleculares | 
AC&amp;T”, [s.d.]). Disponível em: < 
http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-
molecular-tecnicas-moleculares/ > Acesso em: 02/09/2018. 
COX, M. M.; DOUDNA, J. A.; O’DONNELL, M. Biologia Molecular: Princípios e 
Técnicas. Tradução de Gaby Renard et al.. Porto Alegre: Armtmed, 2012. 216 p. 
BRESSANI, F. A. et al. Comparação de diferentes protocolos para visualização de 
DNA separado por eletroforese em gel de agarose utilizando-se os corantes 
fluorescentes brometo de etídeo e GelRed. ENCONTRO NACIONAL SOBRE 
MÉTODOS DOS LABORATÓRIOS DA EMBRAPA, 15., 2010, Pelotas, RS. Novas 
perspectivas para os laboratórios da Embrapa. Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 
2010. 
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