Fisiologia Osmose

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PRÁTICA – FISIOLOGIA 1
OSMOSE E HEMÓLISE EM HEMÁCIAS HUMANAS
O interior das hemácias é constituído de um ambiente cujo “caldo” possui concentração osmolar constante e próximo de 0,3 Osmol/L ou 300 mOsmol/L, cuja osmolaridade é mantida através de fluxos contínuos de diversas substâncias que entram e saem através da membrana celular, além da atividade da bomba de Na/K. O meio extracelular (compartimentos plasmático e intersticial) também é regulado por vários mecanismos que mantém a fluidez próximo de 300 mOsm/L.
Muito do metabolismo energético é direcionado para a manutenção da homeostase osmótica destes compartimentos, mantendo as pressões osmóticas praticamente iguais e constantes nesses compartimentos separados por membranas celulares e, assim, a integridade da forma e do tamanho celular é mantida por fluxos osmóticos contínuos de saídas e entradas de água.
A homeostase osmótica é violada se forem, por alguma razão, gerados gradientes de concentração de solutos altamente permeáveis através da membrana celular. Assim, a entrada dessas substâncias na célula irá aumentar a osmolaridade gerando um gradiente de pressão osmótica a favor da entrada de água na célula e, dependendo da magnitude, uma ruptura da membrana celular.
Um tipo celular muito utilizado como modelo experimental são as hemácias (eritrócito ou glóbulo vermelho), células sanguíneas que contém moléculas de hemoglobina. Portanto, no caso de hemácias, a ruptura da membrana celular é denominada hemólise, ocorrendo a liberação de hemoglobinas para o meio extracelular. Tal fenômeno pode ser visualizado ou até mensurado por meio de técnica espectrofotométrica. 
OBJETIVOS
Geral
Hemólise em hemácias humanas.
Específicos
- Gerar gradientes de hipotonicidade a partir de uma solução “mãe” isotônica de NaCl 0,9% (0,15 M ou 0,3 Osm) e avaliar o efeito dessas soluções no grau de hemólise.
- Observar o fenômeno de hemólise (solução límpida de cor avermelhada).
- Construir a curva de fragilidade osmótica: Índice de hemólise versus osmolaridade a partir de dados obtidos por espectrofotometria.
- Determinação da resistência globular mínima e máxima (RGmín e RGmáx). 
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
- Conforme indicado na Tabela 1, pipetar e transferir para os 12 tubos numerados, os volumes da solução “mãe” de NaCl 0,15 M (0,3 Osm) e de água destilada. Observar visualmente o grau de hipotonicidade induzido por essas soluções. Observe que o volume total em cada tubo é 5,0 mL e o grau de hipotonicidade das soluções é dado pela osmolaridade ou pressão osmótica das soluções contidas nos tubos de 1 a 12.
- Pipetar e transferir para cada tubo, 20 µL de sangue (pipeta automática com ponteiras amarelas). Agitar cada tubo e observar o que acontece.
- Centrifugar os tubos (só um grupo vai fazer isso) durante 5 minutos a 2000 RPM.
- Coletar os sobrenadantes, transferir para cubetas no espectrofotômetro e fazer leituras de absorbância no comprimento de onda 545 nm, comprimento de onda específico para detecção da hemoglobina.
- O Índice de hemólise (em %) é obtido pela razão:
 
 (Absorbância dos tubos/Absorbância do tubo 12) x 100
Tabela 1. Gradientes de hipotonicidade. Volumes da solução de NaCl 0,15 M, volumes de água destilada, molaridade, osmolaridade e pressão osmótica (π).
	Tubos
	Volume NaCl
	Volume água
	mmol/L
	mOsmol/L
	 π (atm)
	 1
	 5,0 mL
	 0,0 mL
	 150
	 300
	 7,3
	 2
	 4,0 mL
	 1,0 mL
	 120
	 240
	 5,8
	 3 
	 3,5 mL
	 1,5 mL
	 105
	 210
	 5,1
	 4
	 3,0 mL
	 2,0 mL
	 90
	 180
	 4,4
	 5
	 2,8 mL
	 2,2 mL
	 84
	 168
	 4,1
	 6
	 2,6 mL
	 2,4 mL
	 78
	 156
	 3,8
	 7
	 2,4 mL
	 2,6 mL
	 72
	 144
	 3,5
	 8
	 2,2 mL
	 2,8 mL
	 66
	 132
	 3,2
	 9
	 2,0 mL
	 3,0 mL
	 60
	 120
	 2,9
	 10
	 1,5 mL
	 3,5 mL
	 45
	 90
	 2,2
	 11
	 1,0 mL 
	 4,0 mL
	 30
	 60
	 1,4
	 12
	 0,0 mL
	 5,0 mL
	 0
	 0
	 0,0
ATIVIDADE
1) conceitue tonicidade e osmolaridade.
Osmolaridade - representa o número de partículas de uma solução por litro, ou seja, é concentração total de todos os solutos na solução.
Tonicidade - A capacidade de uma solução extracelular de fazer a água mover-se para dentro ou para fora de uma célula por osmose a tonicidade de uma solução está relacionada à sua osmolaridade.
2) No contexto definido acima, então é possível uma solução ser isoosmótica, porém hipotônica?
Sim, pois mesmo que a osmolaridade no meio intracelular seja igual ao do meio extracelular, isso não impede que a tonicidade seja diferente, podendo até ser hipotônica e promover a passagem de solvente para o meio intracelular, por conta de sua solubilidade.
3) uma solução hiperosmótica pode ser hipotônica? 
Sim, pois nesse caso haverá um meio muito concentrado (hiperosmótico), mas ele pode agir como hipotônico dependendo da sua solubilidade.
4) construir um gráfico no Excel intitulado “Curva de fragilidade osmótica em hemácias humanas”. Digitar os valores de osmolaridade (mOsmol/L) das soluções na coluna A e, na coluna B, os índices de hemólise (%), calculados segundo a equação dada acima. Selecionar as colunas, inserir gráfico de dispersão, escolha um que liga os pontos de modo “suave”. Assim, tem-se o Índice de hemólise versus osmolaridade. 
5) analisando o gráfico, determinar visualmente a resistência globular mínima e a máxima (RGmín e RGmáx) de hemácias normais.
		R: 	RGmin: ≈ 210
			RGmax: ≈ 120
6) um paciente com suspeitas de uma hemoglobinopatia do tipo “anemia falciforme”, a curva de fragilidade osmótica estaria deslocada para a direita ou para a esquerda em relação à curva obtida de um paciente não falcêmico? Para fins de auxílio ao diagnóstico de anemia falciforme, a RGmín seria menor ou maior do que o obtido em sangue coletado de um indivíduo normal?
No caso da anemia falciforme, a hemácia terá formato de foice, logo, a parede da hemácia vai ficar mais rígida, a curva vai se deslocar para a esquerda, pois ela vai hemolisar depois pois terá maior dificuldade. O RGmin seria menor, pois é mais rígido.