Imunologia clínica

Prévia do material em texto

IMUNOLOGIA CLÍNICA
IMUNIDADE:
Se refere a todos os mecanismos utilizados pelo corpo como proteção contra agentes ambientais que são estranhos ao corpo.
Imunidade Inata: já existe, independente se nosso organismo está sofrendo uma agressão ou não, mesmo antes de ter contato com microorganismos. Ela não responde de maneira diferente, responde da mesma maneira a diferentes grupos de microorganismos agressores.
É específica para determinados padrões que são compartilhados por microorganismos diferentes. Não responde especificamente para microorganismos individuais.
Principais componentes: fagócitos: macrófagos e neutrófilos, barreiras epiteliais, células NK e proteínas complementares.
Imunidade Adquirida: ela responde e se desenvolve em resposta a uma agressão. Temos células de linfócitos B, Linfócitos T, TCD4 E TCD8, PLASMÓCITOS.
Características dos dois tipos de respostas.
Diversidade da imunidade inata é limitada porque as células neutrófilos e macrófagos por exemplos vem de uma mesma linhagem germinal e já na adquirida essas células sofrem uma recombinação e cada células vai ter um receptor especifico. Ou seja a inata está restrita a linhagem germinal.
Não existe memória imunológica na imunidade inata, por isso ela responde da mesma maneira sempre. Já na imunidade adquirida quando há um contato com o agente agressor geram células de memória até haver o próximo encontro com uma resposta mais eficiente.
TIPOS DE IMUNIDADE ADQUIRIDA: HUMORAL OU CELULAR
Muitos patógenos podem desencadear as duas respostas. Uma não exclui a outra, mas geralmente uma vai predominar.
HUMORAL: responde a MO extracelulares que estão presentes nos linfócitos B e a partir desse reconhecimento eles vão ser secretados. Mecanismo efetor são os anticorpos e tem a capacidade de eliminar MO.
CELULAR: dois tipos de linfócitos, tem o MO que foi fagocitado e o linfócitos T help vai estimular esse macrófago para destruir esses MO. Tem também os MO intracelulares, temos a célula infectada tcd8 que vai reconhecer essa células e destrui-lá (não significa que eles ajam sozinhos). 
CARACTERÍSTICAS DAS RESPOSTAS ADQUIRIDAS
Especificidade: garante que os antígenos distintos desencadeiam respostas específicas.
Diversidade: permite que o sistema imunológico responda uma grande variedade de antígenos
Memória: leva a uma acentuação das respostas posteriores ao mesmo antígeno
Especialização: gera respostas que são apropriadas para a defesa contra tipos diferentes de microorganismos.
Autolimitação: retorno ao estado basal (homeostasia) permite que o sistema imune responda a exposição a novos antígenos.
Tolerância a antígenos próprios: previne o dano ao hospedeiro durante a resposta a antígenos estranhos.
APLICAÇÃO DA ESPECIFICIDADE, MEMÓRIA E AUTOLIMITAÇÃO 
Se eu tenho no meu organismo células inativas na espera do antígeno para serem ativadas, num determinado momento se eu entro em contato com o antígeno X, ocorre a ativação dessas células, ocorre uma proliferação de células e proteínas em grande quantidade. A partir do momento que cessa essa agressão, o meu sistema imune volta ao equilíbrio, mas o estado basal já não é o mesmo, pois tem as células B de memórias do antígeno X. Se em determinado momento eu entrar em contato novamente com o antígeno X e Y, a resposta ao X é primeiro devido ser um segundo contato com esse antígeno, a resposta é mais rápida e mais intensa por ser uma resposta secundária em relação a resposta ao antígeno Y que seria primária. E o estado basal se modifica novamente.
FASES DAS RESPOSTAS ADQUIRIDAS
Fase reconhecimento é onde ocorre o encontro do antígeno com a sua célula especifica as células vão se expandindo e se diferenciando em células efetoras que é a fase de ativação A fase efetora é onde a ação ocorre, eliminação de antigenos vem a fase de declínio que seria a apoptose e ai temos a manutenção com a as células de memória. 
VISÃO GERAL DO SISTEMA IMUNOLÓGICO 
linfócito B: neutralização do microorganismo, fagocitose, ativação do complemento.
linfócito T auxiliar: ativação dos macrófagos, estimula a inflamação, ativação dos linfócitos T e B.
linfócito T citotóxicos: destruição da célula infectada
linfócito T regular: supressão da resposta imunológica.
células NK (ela é um linfocito TCD8): destruição das células infectadas.
RECOMBINAÇÃO VDJ 
O sucesso da resposta imune está na capacidade de reconhecer e apresentar um grande número de antígenos diferentes: diversidade de anticorpo disponíveis;
O repertório de anticorpo é gerado durante o desenvolvimento das células B por rearranjos do DNA;
A região variável é codificada por mais de um segmento gênico.
A cadeia leve, cada domínio V é codificado por dois segmentos gênicos: segmento gênico variável e segmento gênico de junção;
As regiões V da cadeia pesada são codificadas por 3 segmentos gênicos: V, J e segmento gênico de diversidade D.
Fração variável é única para cada anticorpo, região que dá especificidade para o anticorpo, é constante e vai ser igual de acordo com a classe. 
temos blocos gênicos com diferentes cromossomos e dentro desse bloco os genes vão se ligar aleatoriamente para gerar variabilidade.
diferenças isotópicas - igG / igA – anticorpos;
diferenças alotípicas - igG/igG - diferença genética;
diferenças idiotípicas - igG/ igG – especificidade;
Principais funções efetoras, trocas de isotipos - figuraa
IgM- ativação do complemento;
IgG - resposta de fagócitos dependentes do receptor Fc; ativação do complemento; imunidade neonatal.
IgE - imunidade contra helmintos e hipersensibilidade;
IgA- Imunidade mucosa;
SOROLOGIA: Parâmetros
TESTES SOROLÓGICOS: são técnicas que tem como finalidade a detecção e a quantificação de antígenos e anticorpos ou outras substâncias que desempenham o papel de antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, ácidos nucleicos, citocinas, receptores de células.
IMPORTANCIA DOS TESTES:
Diagnósticos de certeza: demonstração do patógeno ou seus produtos no hospedeiro;
Métodos imunológicos: podem ser diretos ou indiretos;
Suprem deficiências dos métodos parasitológicos/microbiológicos;
Pesquisa de antígenos, anticorpos e imunocomplexos;
São rápidos e de simples execução.
DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL:
elucidação de processos patológicos com sinais e sintomas clínicos confundíveis
diferenciação da fase da doença - pesquisa de diferentes classes de anticorpos
diagnosticar doenças congênitas
selecionar doadores de sangue
selecionar doadores e receptores para transplantes
avaliar prognóstico da doença
avaliar a eficácia da terapêutica
avaliar imunidade específica adquirida ou induzida
verificar o agravamento da patologia
INQUERITOS SOROEPIDEMIOLOGICOS
Estabelecer a prevalência da doença
Verificar a erradicação da doença
Verificar a reintrodução de novos casos
DIAGNOSTICO INDIVIDUAL:
Como critério de cura
Na definição da etiologia da doença
Na seleção de doadores de sangue
obs: direto - antigeno / indireto – anticorpo
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO DE UM TESTE SOROLÓGICO
Validade intrínseca do teste:
avaliação da especificidade, sensibilidade e eficiência.
Validade extrínseca do teste:
avaliação da reprodutibilidade, acurácia e precisão;
acurácia = exatidão.
TABELA DE VALIDAÇÃO INTRÍNSECA (dupla entrada)
Sensibilidade
% VP
quando eu tenho um resultado verdadeiramente positivo dentre todas as amostras doentes.
quanto mais sensível mais falso negativo vai existir.
Especificidade
% VN	
quantas amostras onde não havia doença e quantas vezes o teste foi capaz d dar aquela amostra como negativa.
quanto mais específico ele for, menos falso positivos vai existir.
Eficiência
são todos os resultados verdadeiros entre todas as possibilidades de resultados;
calcula quantas vezes o teste acertou;
combinação entre especificidade e sensibilidade; 
quanto mais próximo de 1, melhor; 
para validar um teste tem que levar em consideração a prevalência da doença na população. 
→ Valores preditivos positivos:*proporção de doentes entre os positivos do teste;
*probabilidade de doença quando o resultado é positivo;
*vai depender da prevalência da doença na população e quando for maior a prevalência, maior a chance de positivo.
→ Valor preditivo negativo
*proporção de não doentes entre os negativos do teste;
*probabilidade de não doença quando o resultado é negativo.
*qual a probabilidade dele ser realmente negativo;
EXERCÍCIO
População de 2000 pessoas, com sensibilidade de 95% e especificidade de 95%. 
Prevalência =1%
Prevalência = 20%
OBS: pega o valor total de participantes e calcula o numero de doentes com a prevalência. Depois se calcula o numero com a sensibilidade de doentes e com a especificidade o numero de não doentes. 
OBS: os testes são utilizados para determinar dados epidemiológicos da população. 
	PREVALÊNCIA
	PREVALÊNCIA SOROLÓGICA
	PREVALÊNCIA VERDADEIRA
	% doentes em uma população (VP+FN) -> prevalencia = VP+FN / VP+VN+FP+FN
	% positivos pelo teste ( VP+FP) -> Ps = VP+FP / VP+VN+FP+FN
	Relação entre Ps, E e S -> PV = Ps+E-1 / S+E -1
VALIDAÇÃO EXTRÍNSECA 
Precisão
Determina se existe concordância dos resultados obtidos quando um mesmo teste é feito várias vezes;
Mede o erro acidental do método;
Erro experimental acumulado;
Resultado do segundo teste tem que concordar com o primeiro ai se tem um resultado preciso - é exato quando todos os valores estão próximos do alvo. 
Exatidão ou acurácia
Determina a capacidade do teste em fornecer resultados muito próximos ao verdadeiro valor do que se está medindo;
Permite detectar erro sistemático (tendência dos resultados de se desviarem em uma dada proporção ao valor real);
Exatidão é quando todos os valores estão próximos entre si.
Reprodutibilidade
Obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra biológica, quanto feitos por pessoas ou em locais diferentes;
Intrateste: repetição do teste ao mesmo tempo, em triplicata;
Interteste: repetição da mesma amostra em dias diferentes;
Interobservadores: concordância entre observadores.
Cut off (limiar de reatividade) 
Determina o ponto de corte – titulo;
Média dos resultados obtidos de não doentes + n X desvpad;
Acima: positivos;
Abaixo: negativos;
Título do anticorpo é o último valor da diluição que ainda se entra anticorpo;
Porém existe os desvios pessoas não doentes que tem o titulo maior;
Teste ideal é quando a curva no gráfico não tem interseção (quanto menor melhor);
Se diminui o ponto de corte de 40 para 20 ele fica mais sensível ou especifico? fica mais sensível, e os resultados os falsos positivos ia aumentar porém o falso negativo ia diminuir;
Se jogar pra 80 ai o teste será mais especifico e ai vai aumentar o número de falso negativos;
Para um banco de sangue se utiliza teste mais sensíveis por que é melhor ter mais falso positivos do que falso negativo;
Para laboratório sanguíneo, utiliza teste mais especifico.
TESTES SOROLÓGICOS 
RESPOSTA IMUNE HUMORAL
Interação reversível
complementaridade especificidade;
Ligações não covalentes: pontes de hidrogênio, ligações iônicas, interação hidrofóbicas (a ligação entre anticorpo e antígeno não é fraca por que são várias ligações isso a torna estável);
Fatores que interferem na ligação entre Ag e AC.
Especificidade dos anticorpos
Afinidade dos Ac;
Avidez dos Ac;
Concentração dos Ac e antígenos;
Classe dos anticorpos envolvidos;
Pureza dos antígenos utilizados.
Afinidade
Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo);
Depende da complementaridade entre as moléculas;
baixa afinidade: tende a dissociar com facilidade;
Alta afinidade: ligações fortes e mais duradouras.
 Avidez
Força de interações total entre Ag e Ac;
Interações múltiplas Ac - epítopos (Ag complexo) soma das afinidades de todos os epítopos envolvidos;
Baixa afinidade pode ser compensada por alta avidez;
Pode se ter epítopos diferentes = reconhecidos por mais de um tipo de anticorpo;
Somatório das afinidades, avidez compensa e deixa a ligação mais estável
Reação cruzada 
Dois Ag diferentes apresentam epítopo semelhantes;
Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas ou sequencia/ estruturas similares;
Pode ser por semelhança entre propriedades químicas, então ele pode se ligar a um anticorpo que não é dele;
Quando se tem organismos da mesma família que tem propriedades muito parecidas por exemplo teste de kit da positivo tanto pra leish quanto pra cruzi pois eles possuem a mesma proteinas isso influencia na especificidade do teste;
Ex: leishmanias X trypanossoma cruzi. 
Metodologias que utilizam
detecta a formação de antígeno e anticorpo;
Reagente não marcados: reação de precipitação reação de aglutinação reação de floculação;
Reagente marcados: RIA, ELISA, imunoflorescência, western blot • 
Reagentes não marcados: Detectam/ quantificam as consequências da ligação Ag-Ac.
Reação de precipitação: Quantificação de precipitados produzidos pela reação antígeno-anticorpo;
Forma um imunocomplexo ( rede de anticorpos e antigenos) esta rede se precipita dentro de uma reação e ai é possível sua visualização;
Interação: Ac-Ag solúvel forma uma rede que pode desenvolver um precipitado visível;
Anticorpos bivalentes + antígenos multivalentes = precipitado;
Reação quantitativa: concentração de Ac, concentração crescimento Ag;
Rede se forma quando se tem uma zona de equivalência = rede de equimolaridade (forma o máximo de imunocomplexos);
Efeito pró-zona: quando se tem excesso de anticorpo em relação ao antígeno (isso não deixa formar a rede, pq fica muito anticorpo livre no sobrenadante) ocorre em alguns testes como de uvtrl de sifilis por conta de muito anticorpo (quando se tem isso, vc dilui o soro para diluir os anticorpos) obtem-se tem o resultado falso negativo quando se tem esse efeito;
Quando se tem mais antígeno se desfaz a rede;
IMUNODIFUSÃO
 
Reação de prestação em gel (difusão das moléculas no gel para formar os imunocomplexos); 
Simples: o Ag ou o Ac permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde até que ocorra a precipitação do complexo somente um deles se movimenta/ difunde no gel;
Dupla: tanto o Ag quanto o Ac se movem, um em direção ao outro até haver a precipitação nenhum dos dois está fixo;
Imunodifusão pode ser linear (unidirecional) ou radial (bidirecional) depende do movimento e da direção que a difusão ocorre no gel;
Utiliza uma matriz de agarose;
Ag+ AC= linha de precipitação visível.
	RADIAL SIMPLES (MANSINI)
	LINEAR SIMPLES (MANSINI)
	DUPLA RADIAL (OUCHTHERLONY)
	DUPLA LINEAR
(OUCHTHERLONY)
	Ag e Ac fixos coloca os Ac no gel de agarose e nesse mesmo gel, faz-se um poço onde insere-se o Ag (apenas o antígeno se difunde) a medida que ele encontra um anticorpo forma o precipitado. 
Quantitativa:
Curva padrão com pelo menos 3 concentrações conhecidas do padrão (diâmetro x título);
Consegue quantificar os antígenos pela formação do anel de precipitação;
Faz uma curva padrão utilizando o diâmetro do anel com a quantidade de antígeno no pocinho quando mais antígenos maior o tamanho do anel relação do anel com o antígeno - Method: Ab in gel; Ag in a well - Interpretation: diâmetro (ao quadrado) do anel com a porporcional à concentração. - Quantitative: ig levels (se joga os valores na equação da reta e isso geral um gráfico).
	Análise qualitativa e quantitativa;
O antissoro é incorporado ao gel de agarose e a mistura é colocada em um tubo - após a gelificação, o Ag é colocado no topo da coluna tubo é selado e observado por 1 semana Ag é colocado em cima do gel com anticorpo (Ag em direção ao Ac). 
	Dupla por que coloca-se um pocinho de Ac e varia os Ag’s. várias linhas de precipitação serão formadas e elas se fundirão, formando um arco de precipitação (as linhas vão coalescer e formar arco coalescente) se tiver duas linhas isso mostra que o Ac não está puro (ou seja, dois imunocomplexos diferentes). 
As soluçõescom Ag e Ac são colocadas em orifícios no gel em placas de petri cada linha em um espectro de precipitação corresponde a um par Ag-Ac;
Permite a comparação de vários sistema antigênicos, colocados em orifícios adjacentes, contra um mesmo sistema de Ac. 
	Identificação de Ag’s = Ac de reatividade conhecida; 
É dupla por que tem um gel em uma lâmina de vidro e dois poços (um com Ag e o outro com Ac) os dois se difundem. 
	Halo de precipitação (mostra o encontro de antígeno e anticorpo). 
	Tubo. 
	Arco de precipitado. 
	Linha de precipitação. 
	
	
	
	Quadro amarelo. 
São três padrões possíveis da dupla linear:
Reação de identidade (coalescente): indica a presença de determinantes antagônicos idênticos forma arco coalescentes.
Reação de não identidade (interseção): indica a presença de determinantes antagônicos não-relacionados forma um X entre as reações e não se unem e sim se cruzam não tem identidade entre eles.
Reação de identidade parcial (esporão): indica a presença de determinantes antagônicos parcialmente relacionados forma um esporão pq tem a formação do arco coalescente porém se tem uma outra linha de precipitação que é o esporão. Na rotina: doenças auto-imunes como artrite reumatóide, esclerose sistêmica - é uma analise qualitativa.
 Pode ser utilizado para avaliações semiquantitativas (ex: titulação de Ags ou de Acs);
 Podem-se caracterizar Ags de vários agentes infecciosos empregando-se anticorpos de especificidade e reatividade conhecidas;
se tiver reação até 1 para 8, então o título é 8. 
TÉCNICAS QUE UTILIZAM ELETROFORESE
se utiliza precipitação junto com eletroforese para agilizar o resultado;
migração de partículas carregadas em um solvente condutor sob influencia de um campo elétrico;
fatores que governam a migraçõa: carga, tamanho, forma, concentração, pH do solvente, temperatura, intensidade do campo elétrico (influenciam na migração).
Eletroforese de proteínas: 
Utiliza-se um gel aonde se aplica a amostras nos buraquinhos do topo e vai colocar um eletrodo positivos e negativo e gerar uma voltagem com a aplicação de uma corrente para a proteína migrar pelo gel elas tem que passar pela malha as maiores migram menos que a menores (migram mais lentamente);
basicamente se a utiliza para separar as proteínas por tamanho e por sua carga (por conta da voltagem aplicada).
Eletroimunodifusão
Associa a imunodifusão a eletroforese, promovendo aumento de velocidade de precipitado do complexo Ag-Ac no gel de agarose difundem-se impulsionados por uma voltagem;
Eletroimunodifusão dupla unidimensional:
Eletroforese do antígeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direções opostas a partir de orifícios separados, resultando na precipitação em um ponto intermediário entre as suas origens;
Nem sempre da pra fazer essa técnica, pra isso tem que saber as cat do antígeno e ele deve ser mais eletronegativo;
Esse método requer que o antígeno e o anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas.
Eletroimunodifusão simples unidirecional: 
eletroforese em foguete;
antissoro especifico para Ag que se quer quantificar é incorporado ao gel de agarose;
O ph do gel é escolhido de modo que o antígeno fique com a carga negativa e os anticorpos não migrem;
Precipitação se forma nas margens laterais dos limites de Ag;
Conforme o Ag vai precipitando sua concentração diminui e as margens laterais convergem para uma ponta;
Distância total de migração do Ag é diretamente proporcional a concentração do antígeno.
 IMUNOELETROFORESE
Separação dos componentes por eletroforese (antígenos se separaram de acordo com o tamanho e a carga, menor migra mais rapido, migra mais);
Imunodifusão (reconhecimento de antígeno e anticorpo - ai coloca o anticorpo no pocinho);
Imunoprecipitação (e ai cada um forma uma linha de precipitação de acordo com o seu anticorpo);
Ex: doenças autoimunes (saber que tipos de anticorpos a doença está produzindo);
Protína de Bence jones, proteínas no liquor: consegue comparar vários conjuntos de antígenos e anticorpos numa técnica só.
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ac+Ag particulado (figurado - está na superfície de partículas como bactérias/ hemácias ou sintética) aglutininas agregação visível de partículas;
Agregado visivel, consegue observar a aglutinação;
Efeito pró-zonas;
Formação de agregados visíveis como resultado da intenção de Acs específicos e partículas insolúveis, que contêm determinantes antagônicos em sua superfícies.
1 estágio: ligação das moléculas do Ac ao Ag de superfícies;
2 estágio: colisões entre as partículas: Acs ligados a uma partícula se ligam a Ags de outras.
Direta: partículas com determinantes antagônicos naturais (hemácia, bactérias);
Indireta ou passiva: partículas inertes ou células antagonicamente não relacionadas (Ex: latex, hemácias de carneiros);
Necessita de 500x menos Acs que a precipitação;
IgM é 750x mais eficiente que IgG pq é muito maior e forma complexo com mais facilidade;
Diagnostico de doenças causadas por vírus, bact, protozoários e fungos, doenças autominues, detecção de hormônios, tipagem sanguínea de grupos e Rh, etc;
Se tiver aglutinando células (superfície de partículas) precisa de menos quantidade para ser visível, o que gera um teste mais sensível, se fosse só antígeno e anticorpo precisaria mais para ver pois é muito menor do que uma célula por exemplo. 
Aglutinação direta:
Células ou partículas insolúveis;
Ac = aglutinação;
Detecção de Ags – titulação;
Ex: tipagem ABO, leptospirose, toxoplasmose, salmonelose, brucelose.
Inibição da hemaglutinação direta:
Certos Ags virais espontaneamente aglutinam hemácias;
Os anticorpos, se presentes, revestem as partículas virais;
Ex: rubéola (pintinhos), sarampo (macaco), influenza (galinha e carneiro);
Utiliza-se isso para fazer diagnostico;
Pega o soro do paciente e adiciona na reação o virus do sarampo por exemplo: se no soro do paciente tiver anticorpos contra o sarampo ele se liga nas partículas virais adiciona a hemácia do macaco (que aglutina com o contato do vírus) e não forma uma aglutinação resultado é positivo (tem a doença) (se ele não tem o anticorpo na hora que colocar a hemácia que aglutina ai vai aglutinar);
Se aglutinar é porque não tem anticorpos na amostra - positivo: inibição da aglutinação.
 Aglutinação passiva
Ag solúveis associados a outras superfícies (partículas de látex ou superfície de hemácias);
Coloca antígenos de interesse e conjuga (adsorver) eles com as partículas (fique ligado na superfície da partícula);
Partícula sensibilizada: antígenos adsorvidos na superfície dela promove aglutinação da mesma forma;
Quando não aglutina forma um botão, quando aglutina forma tapete
Inibição da aglutinação passiva (indireta)
Detecção de Ags solúveis (competição);
Reagentes do kit (anticorpos- HCG + conjulgado - latex);
Procedimento do teste: pega urina e adiciona o anticorpo do kit se tiver antígeno (GRAVIDA) forma o complexo aí se coloca o conjugado que é o latex sensibilizado e ai não vai aglutinar: hormônio liga aos anticorpos então quando colocar o latex não tem com quem ligar porque já foi ocupado ai não ocorre a aglutinação.
Aglutinação de cristais de colesterol - VDRL (sífilis)
 Cristais de colesterol sensibilizados com lecitina e cardiolipina;
 Floculação forma grupos muito finos precisa de microscópio para visualizar.