Standardization of bulb and root sample sizes for the Allium cepa test

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RESUMO 01
BARBÉRIO, A.; VOLTOLINI, J. C.; MELLO, M. L. S.. Standardization of bulb and root sample sizes for the Allium cepa test. Ecotoxicology, [s.l.], v. 20, n. 4, p.927-935, 5 fev. 2011. Springer Nature. http://dx.doi.org/10.1007/s10646-011-0602-8.
O objetivo deste estudo que embase este resumo foi propor números padrão e estatisticamente relevante de amostras de bulbos e raízes para ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade que utilizam o teste de Allium cepa. Ele foi alcançado através da comparação dos índices mitóticos e parâmetros que nós designamos como "anomalias mitóticas" e que não incluem aberrações cromossômicas numéricas e estruturais como classicamente definidas.
Umas das decisões mais importantes a serem tomadas ao se compara dados biológicos quantitativos é a determinação do tamanho da amostra, pois ela pode influenciar decisivamente no objetivo do estudo e na sua análise estatística. Assim determinar o tamanho da amostra é de grande importância, pois exceder o tamanho necessário da amostra pode ser prejudicial em relação ao gasto desnecessário de tempo, recursos humanos e financeiros. Entretanto uma amostra muito pequena pode levar a inconsistências. Portanto, existe um tamanho amostral ideal para cada tipo de análise e a identificação desse tamanho amostral deve preceder a coleta de dados.
O teste para monitorar efeitos potencialmente citotóxicos e genotóxicos promovidos por poluentes na água, no ar e no solo com o uso de Allium cepa (cebola) tem alta sensibilidade, uma execução fácil e rápida. No entanto, não houve padronização do tamanho amostral ideal dos bulbos e de suas raízes para serem analisados neste teste. Após revisarem 44 artigos publicados nas últimas três décadas, descobriu-se que os estudos usaram em médias seis bulbos (com um intervalo entre dois e onze), de uma a vinte raízes, uma média de 1.700 células para investigação do micronúcleo (com um intervalo de 500–5000) e 490 células para análise de aberrações cromossómicas (com um intervalo de 50–3000).
A terminologia de aberração cromossômica usada em experimentos citogenéticos geralmente compreende alterações cromossômicas designadas como aberrações numéricas (euploidia e aneuploidia) e estruturais (deleções, inversões, duplicações e translocações). No entanto, em experimentos envolvendo o teste de A. cepa, outros parâmetros também foram considerados ferramentas importantes para informar sobre anormalidades cromossômicas induzidas por agentes citotóxicos ou genotóxicos: a viscosidade cromossômica, a ponte anáfase, a mitose, a ocorrência de metáfases e anafases multipolares e até a micronucleação podem ser consideradas. A viscosidade cromossômica geralmente ocorre por agentes altamente tóxicos, geralmente de um tipo irreversível, e provavelmente leva as células à morte. Os micronúcleos podem ser derivados de cromossomos alinhados incorretamente durante a metáfase. A variação no tipo e frequência de aberrações cromossômicas e as outras anormalidades mencionadas quando induzidas por substâncias tóxicas podem fornecer informações sobre sua atividade de danos.
O índice mitótico demonstra o crescimento celular e é considerado como um parâmetro importante na determinação da taxa de crescimento da raiz da planta e é muito utilizado como referência no comprimento da raiz no teste de A. cepa, como por exemplo, diminuindo em valor com concentrações crescentes de metais tóxicos.
Os experimentos deste artigo foram realizados conforme descrito por Fiskesjö (1989) no protocolo Invittox de número 8, com modificações. Assim quarenta bulbos de cebola de tamanho variando 3 – 3,5 cm de diâmetro foram utilizados. Os bulbos tiveram seu anel de primórdios radiculares suspensos em frascos preenchidos com solução de Hoagland, por 48 h, a fim de demonstrar sua viabilidade para o crescimento radicular, pré-crescimento, quando as raízes recém-emergidas tinham 1,5 a 2,0 cm de comprimento e os potes foram mantidos protegidos da luz solar direta.
Dez bulbos de A. cepa foram então submetidos durante 24 h a cada um dos seguintes tratamentos: (1) solução de Hoagland como controle negativo, (2) 15 µg/l metilmetanossulfonato como controle positivo e (3) amostras de água utilizadas do rio Paraíba do Sul. Os parâmetros físico-químicos e microbiológicos para a água destes rios foram obtidos de relatórios oficiais mensais da CETESB.
As pontas radiculares com 2 a 3 mm de comprimento foram removidas dos bulbos e fixadas em uma mistura absoluta de etanol e ácido acético glacial (3:1, v/v) por 5 min. Seis raízes de cada bulbo foram submetidas à reação de Feulgen ''em bloco'', usando hidrólise ácida em HCl 4 M a 25ºC por 75 min. Após este tempo a hidrólise foi interrompida com um banho rápido em 0.1 M HCl frio, as raízes foram imediatamente imersas no reagente de Schiff por 40 min em temperatura ambiente, seguido por tratamento com água sulfurosa, três banhos por 5 min cada, e água destilada. Em seguida, cada raiz foi esmagada entre uma lâmina e uma lamínula com duas gotas de ácido acético a 45% e a lamínula foi removida em nitrogênio líquido. As amostras foram imersas em etanol a 70% por 5 min, secas ao ar, contrastadas brevemente por 5 segundos, com solução verde rápida em pH 2,7, enxaguadas em água destilada, secas ao ar, clareadas em xileno e montadas em bálsamo do Canadá.
As observações foram feitas usando um microscópio de luz com uma objetiva acromática e 10X de aumento. A seleção foi baseada em coloração profunda e sobreposição celular desprezível. A frequência de células contendo micronúcleos foi estimada em 2.000 células por raiz (10.000 células por bulbo). Anormalidades mitóticas foram estimadas em aproximadamente 100 células em metafase e anáfase por raiz (500 células por bulbo).
Os dados para cada parâmetro foram classificados e a igualdade dos rankings populacionais foi calculada comparando-se dois a dez bulbos e duas, três, quatro e cinco raízes com o teste de Kruskal-Wallis (α = 0,05). Todos os dados foram previamente testados utilizando os testes de Shapiro-Wilk e Levene e revelaram não ser distribuídos normalmente; as variâncias para as diferentes populações diferiam umas das outras. Para evitar não seguir as suposições básicas do teste, executou-se o teste Kruskal-Wallis no software Statistica e a escolha de quais bolbos e raízes foram comparados foi obtida por sorteio.
Assim não foram encontradas diferenças significativas ao comparar os valores das anormalidades mitóticas e das células micronucleadas entre vários números de bulbos de A. cepa em cada um dos tratamentos com diferentes soluções aquosas, incluindo a água coletada no rio Paraíba do Sul. De duas ou dez lâmpadas foram comparadas, os resultados não diferiram. Esse achado pode significar que até um ou dois bulbos poderiam ser escolhidos como representativos da condição experimental investigada. Para aqueles parâmetros com grande variabilidade devido a sua baixa frequência (por exemplo, micronúcleos), conclui-se que o tamanho da amostra deve ser igual ou superior a três bulbos para fins de segurança e porque a maioria dos relatórios mencionados usou mais de dois bulbos. Assim como nos resultados dos bulbos, os resultados obtidos a partir das raízes não diferiram com tamanhos de amostra variáveis. Conclui-se também que uma amostra de raiz é suficiente para verificar os efeitos da poluição com o teste de A. cepa, visto que vários estudos anteriores usaram apenas uma raiz.
Conclui-se com base nos resultados estatísticos obtidos neste estudo que apenas um bulbo e uma raiz podem ser considerados como tamanhos de amostra adequados para detectar danos cromossômicos com o teste de A. cepa. No entanto, para usar softwares estatísticos disponíveis para comparação de amostras com confiança e presumindo a ocorrência de variabilidade genética para o organismo teste, os autores propõem que três bulbos e três raízes sejam usados como tamanhos amostrais.