Aplicações e métodos e metodologias imunológicas no diagnóstico aula 4

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Aplicações e métodos e metodologias imunológicas no diagnóstico, pesquisa e epidemiologia. Aula 4.
Imunoensaio de precipitação: é o mais simples de reação AG-AC; não precisa de marcador, é um resultado qualitativo e é visível a olho nu é branco ou leitosa. Se for por meio automatizado uso a nefelometria. Alguns fatores são interferentes por exemplo a proporção de reagentes tem que ser proporcional para evitar o efeito pró zona. Controle de temperatura e pH, e levar em consideração a força iônica do meio para avaliar a afinidade e avidez do AC-AG para me fornecer um resultado ideal. 
Efeito pró-zona: a qtdade de AG e AC vão estar presentes para que ela aconteça ela tem que ser proporcional pq se eu tiver excesso de AC ou AG eu vou formar um campo de forças negativas ou positivas que ao invés de atrair serão repelidos. Se eu for repelir então terei AG e AC será um resultado falsamente negativo quando deveria ser positivo. Boa parte dessa falta de ligação efetiva devido o excesso de AC é denominado de efeito pró zona. E toda vez que eu tiver um excesso de AG eu denomino de pós zona. a zona central é a zona de equilíbrio é onde possui a qtdade de AC e AG proporcional para que haja a ligação ideal. Para que entre no ponto de equivalência é necessário que seja feito a diluição seriada da amostra. Começa de pelo menos ½. Promovendo a equivalência da amostra. 
Métodos de precipitação: 
- QUALITATIVOS: Imunodifusão simples; Imunodifusão dupla; Imunodifusão dupla em duas dimensões; Reação de imunoeletrodifusão; Imunoeletroforese, Western Blotting ( só vejo positivo ou negativo; reagente ou não reagente; presente ou ausente)
- SEMI QUANTITATIVOS: Imunodifusão radial simples mede um halo; Imunodifusão radial duplamede o halo que essa difusão precipitou; Eletroimunodifusão de dimensão simples
- QUANTITATIVOS: Nefelometria dosagem de todas as proteínas do soro.
Imuno difusão: 
Eu coloco AG em um poço e Ac em outro poço numa plaquinha onde tem gel ágar no meio. Ag e Ac migram para o meio elas reagem precipitam e caem. Como mostra na figura ao lado. Soro do paciente de um lado e do outro o Ag que reage com o Ac do paciente. 
No caso da imunoeletroforese eu utilizo para frações presentes nas IG (alfa ou beta) que compõe as porções da hemoglobina glicada por exemplo eu consigo dosar. Uso de fita de poliacrilamida aplica a amostra e faz o diferencial de potenciação ( troca de carga iônica) onde quem é mais pesado anda menos e mais leve anda mais. 
AC: imunoglobulina, gamaglobulina( a função gama são onde geralmente todos os AC migram), proteína. Para quantificar isso ele transforma em gráfico utilizando matemática. Transforma o pico em volume e após isso em um numero. Para diagnóstico preciso saber se está presente ou não já no prognóstico eu preciso saber se reduziu ou não. 
No western blotting seja um exame altamente específico. Detectar os AC dirigidos contra as ptn que realmente existem lá. É um fita de nitrocelulose você aplica a amostra ela começa a correr e vc coloca uma solução tampão. Esta solução permite que os AC deste paciente diluído entre na zona de equivalência e comecem a precipitar exatamente naquela proteína para qual este AC foi desenvolvido. No caso do hiv olha a p24 – soro convertido para o vírus Hiv. Teste qualitativo altamente especifico que confirma diagnóstico. Repetição com 30 dias. Sorologias ou diagnóstico ou confirmatórios
Imunodifusão radial simples: semiqantitativo.usa o paquímetro para fazer a medição que coloca o AG ou soro do paciente puro oudiluido no poço vazio. Aí espero migrar. Uso para alguns imuno ensaios celuloplasmineo ou para pacientes associados a isso. Doença de Wilson. O teste de imunodifusão radial simples permite determinar a concentração de uma amostra de antígeno. O soro específico é incorporado a agarose que recobre uma lâmina de vidro. Em orifícios feitos na agarose, são adicionadas diferentes concentrações do antígeno.
A lâmina é incubada por 24/48 horas. Observa-se o halo de precipitação em volta dos orifícios.
imunodifusão radial dupla: Neste método qualitativo, os dois componentes, antígeno e anticorpo, difundem-se radialmente em todas as direções, a partir de orifícios no meio gelificado e se encontram formando linhas ou arcos de precipitação correspondentes aos imunocomplexos possíveis desta interação, ou seja, cada arco corresponde a um par de imunocomplexo antígeno-anticorpo. As linhas de precipitação poderão ser visualizadas com corante após lavagem das proteínas solúveis do meio gelificado com tampão apropriado. A técnica permite a comparação simultânea, por exemplo, de vários sistemas antigênicos contra o mesmo sistema de anticorpo de reatividade e especificidade conhecidas, desde que a interação antígeno-anticorpo tenha atingido a zona de equivalência e que esteja em quantidade suficiente para formar turvação ou precipitado visível. 
Nefelometria: 
	- Lei de lamber bier: a luz incidente é sempre menor que a luz emergente porque parte dela é absorvida e só consigo ler a que atravessa a cubeta. O tipo de fonte de luz me oferece comprimento de ondas distintos. Alguns leem no visível e outros no IV. 
-Essa fonte de luz é responsável pela emissão de luz e eu preciso selecionar o comprimento de onda. O comprimento de onda é feito através de um seletor é um disquinho que ai permitir só o comprimento de onda que só vai me permitir o comprimento de onda q me interessa. Se tiver no 0° é a especfotometria ( colorido, límpida e translucida) resultado em densidade ótica. No 30° turbidimetro o detector vai ter a capacidade de ler substancias turvas são mais sensíveis. No 90° a luz incide lateralmente e superiormente e ela é desvia 90°. Entçao pode por uma substancia leitosa que vai ler. Pq ela precipitou e só consigo ler assim. Sensibilidade é mais sensível de todos. As aplicações são distintas vai depender da reação da amostra. 
Imunoensaio de aglutinação: Utiliza partículas inertes como marcadores ex. latex; Ag ou Ac podem estar ligados às partículas não interferem na ligação de AG-AC ( suporte para imunogenicidade); Quando as partículas são substituídas por hemácias – técnica hemaglutinação; Resultado qualitativo; Visualização a olho nu. 
Aglutinação direta: antígeno ou um hapteno ligado a uma partícula de látex anticorpo. Quando eu colocar o soro da paciente que possui o AC eu vou ter um reação Ag- Ac efetiva e acontece. 
Aglutinação reversa ou indireta: o Ac está ligado ao látex e eu pesquiso a presença de AG na amostra do paciente. Ex.: pcr prática. 
Inibição de aglutinação: eu te lendo um resultado que é teoricamente revertido. Utilizada em pesquisa da fção beta do hormônio hcg que é indicativo não só de gravidez mas de outras coisas ao longo do semestre. Eu tenho na urina o hormônio solúvel e tenho um Ac contra esse hormônio e nas partículas de látex que existem disponíveis no kit partículas de látex com hcg mimético artificial colocado para reagir. Esse AC ele tem mais afinidade pelo hcg solúvel que existir na minha amostra mas se ele não tiver presente esse AC se liga ao hcg mimético que estão no kit disponíveis. Se elas se ligarem as minhas partículas de látex vou promover uma inibição de aglutinação. Se aglutinar significa que não tem meu antígeno de interesse. Mais avidez. Aconteceu aglutinação resultado negativo. Inibiu aglutinação a pessoa está gravida. 
Hemaglutinação: se tem hemácia precitpitada no fundo significa que eu não tenho Ac contra aquele antígeno. Mas se eu tiver um manto turvo é positivo. 
Imunoflorescencia: pode investigar tanto o antígeno como o anticorpo.
Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo (excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível); A reação é feita em lâminas de microscopia; Leitura Microscópio de fluorescência; Principaisfluorocromos:
– fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) verde. 
– rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT) vermelho 
Imunofluorenscencia Direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortesde tecidos, etc. • Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele. Nesse caso quando há um AC marcado com essa substância fluorescente se ligando ao AG diretamente. 
Indireta: eu tenho um AG que tá presente eu uso AC do soro do paciente que vai reagir e em seguida, vou usar um conjugado que é um AC marcado com uma subst. Fluorescente. ( AC marcado/secundário) vai reconhecer a proção fc ( cte). Desse AC classe específica, então consigo classificar igg, ige e igm especifica para aquele AG. 
Posso marcar AC com imuno fluorescência para marcar o receptor CD8 fitc ou CD4 tritc.