TESTES SOROLÓGICOS resumo

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TESTES SOROLÓGICOS
Rápidos e simples, são empregados na prática diária, no diagnóstico de rubéola congênita, diagnóstico da infecção pós natal e para determinar o estado imunitário. O ensaio imunoenzimático (ELISA) e a inibição da hemaglutinação (IHA) são os principais m étodos utilizados atualmente.
A IHA, baseia-se na capacidade do vírus de aglutinar hemácias e na propriedade de inibição desta pelo anticorpo específico. É uma reação trabalhosa, com inúmeras variáveis (hemácias , antígenos , inibidores específicos , temperatura e pH) e de custo e levado. O método ELISA é mais sensível, específico e rápido. Por isso, a tendência atual é substituir a IHA pelo ELISA.
Teste MAC - Elisa para Dengue:
Qual a sensibilidade e especificidade diagnóstica do teste sorológico imunoenzimatico-MAC-ELISA coletado após o 6º dia do início dos sintomas? 
Sorologia: os testes sorológicos complementam o isolamento do vírus ou, quando isso não é possível servem como um meio alternativo de diagnóstico. Existem várias técnicas que podem ser utilizadas no diagnóstico sorológico dos vírus do dengue, incluindo os de inibição de hemaglutinação (HI - Clarke & Casals, utilizando-se uma bateria com 6 flavivírus, 1 alphavírus e 1 bunyavírus), fixação de complemento (FC), neutralização (N) e ELISA de captura de IgM (Mac-ELISA, desenvolvido pelo CDC de Porto Rico). Os três primeiros exigem amostras pareadas de soro de casos suspeitos e a confirmação é demorada.
A Mac-ELISA é o exame mais útil e rápido para a vigilância, porque requer somente uma amostra de soro na maioria dos casos e o exame é simples e rápido. Baseia-se na detecção de anticorpos IgM específicos aos quatro subtipos do vírus do dengue. O anticorpo IgM anti-dengue se desenvolve rapidamente: após o quinto dia do início da doença. Na maioria dos casos, tanto nas - primo infecções quanto nas reinfecções, os anticorpos IgM são detectáveis.
MAC ELISA
O teste sorológico para dengue clássico inclui o MAC (-ELISA). Este ensaio utiliza dengue antígenos específicos de todos os quatro sorotipos (DEN 1-4) para a captura de anti-dengue IgM anticorpos específicos em amostras de soro. A maioria dos antígenos utilizados para este ensaio são derivados da proteína de envelope. Algumas das limitações do presente ensaio é a especificidade desses antígenos e reactividade cruzada entre outros flavivírus circulantes. Estas limitações devem ser contabilizados quando se trabalha em regiões onde a co-circulam vários flavivírus. Detecção de IgM não é útil para a determinação de sorotipo devido a reatividade cruzada do anticorpo se mesmo durante a infecção primária.
A resposta imune adquirida na sequência de uma infecção por dengue consiste na produção de anticorpos IgG e IgM dirigidos principalmente contra as proteínas do envelope do vírus. A resposta imune varia dependendo se o indivíduo tem uma dengue (primeira primária ou infecção de outros flavivírus) versus um secundário (tinha dengue ou outra infecção flavivirus no passado) infecção por dengue. Em geral, o diagnóstico da dengue depende do phasestage da infecção. O cronograma geral de uma infecção primária de isolamento do vírus ou de identificação, a detecção de IgM seguido por detecção de IgG é a seguinte:
A infecção por dengue primária é caracterizada por uma lenta e resposta de anticorpos de baixo título. Anticorpos IgM é o isotipo de imunoglobulinas primeiro a aparecer. IgG anti-dengue é detectável em baixo título no final da primeira semana da doença, e aumenta lentamente. Em contrapartida, durante uma infecção secundária, os títulos de anticorpos ascensão extremamente rápida e amplamente o anticorpo reage com muitos flavivírus. Altos níveis de IgG são detectáveis, mesmo na fase aguda e sobem drasticamente ao longo do processo de duas semanas. A cinética da resposta de IgM é mais variável. Níveis de IgM são significativamente mais baixos em infecções por dengue secundárias e, portanto alguns anti-dengue IgM reações falso-negativos são observados durante infecções secundárias. Segundo a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) Orientações 80% dos casos de dengue foram detectados anticorpos IgM detectável por cinco dias de doença, e 93-99% dos casos IgM detectável por seis a dez dias de doença, que pode então permanecer detectável por mais 90 dias. 
MAC-ELISA tornou-se uma importante ferramenta para o diagnóstico da dengue rotina, MAC-ELISA tem uma sensibilidade e especificidade de aproximadamente 90% e 98%, respectivamente, mas apenas quando utilizados cinco ou mais dias após o início da febre (ou seja, na fase de convalescença). Diferentes formatos, como ELISA de captura, captura ultramicroELISA, dot-ELISA, AuBioDOT captura de IgM e sondas têm sido desenvolvidos. Soros, sangue em papel filtro e saliva (mas não na urina) são úteis para detecção de IgM se as amostras são tomadas em fase de convalescença da doença (Vasquez et al., 2006). Uma variedade de diferentes kits comerciais está disponível com variável sensibilidade e especificidade. Diagnóstico da dengue se torna ainda mais difícil porque os anticorpos IgM dengue também reagem de forma cruzada, em certa medida com outros flavivírus, como o vírus da encefalite japonesa, LES, WNV e YFV.
Hemagglutination Inhibition Test (HAI): Principle, procedure, result and interpretations
Principle:
The nucleic acids of various viruses encode surface proteins that agglutinate the red blood cells (RBC) of a variety of species.  For example; Influenza virus particles have an envelope protein called the hemagglutinin, or HA, which binds to erythrocytes , causing the formation of a lattice. This property is called hemagglutination. Reaction of viral hemagglutinins with red blood cells results in a lattice of agglutinated cells which settle irregularly in a tube or microtiter well. Unagglutinated cells settle in a compact button.
 Hemagglutination phenomenon is almost commonly used for diagnosis of infection produced by Orthomyxoviruses, paramyxoviruses, and the abroviruses-togaviruses (including rubella), flaviviruses, and bunyaviruses.
The presence of virus in infected cell cultures can be detected by hemagglutination; the identity of the virus or of antibodies in a patient’s serum can be determined by specific inhibition of that hemagglutination. Although influenza viruses can be detected by hemadsorption test, typing of the isolate is done most efficiently by hemagglutination inhibition (HAI). Reagents and conditions for the test vary by virus.
The basis of the HAI assay is that antibodies to that particular virus (for example-influenza virus) will prevent attachment of the virus to RBC. Therefore hemagglutination is inhibited when antibodies are present.
HAI Titer: The highest dilution of serum (Ab) that prevents hemagglutination is called the HAI titer of the serum.
If the serum contains no antibodies that react with influenza virus, then hemagglutination will be observed in all wells.
Likewise, if antibodies to the virus are present, hemagglutination will not be observed until the antibodies are sufficiently diluted.
The HAI test may be complicated by the presence of non-specific inhibitors of viral haemagglutination and naturally occurring agglutinins of the erthrocytes. Therefore, the sera should be treated before use or false positive or negative results may arise.
Materials and Reagents:
Red cells from an appropriate species (Chicken, goose, guinea pig, trypsinized human O) collected in Alsever’s solution or heparin
Diluent (e.g. Bovine albumin veronal buffer) at appropriate pH
Solutions to remove nonspecific hemagglutinins from serum
Infected cultural fluid or standard antigen (e.g preparation of influenza virus) for serology
Procedure
Obtain a preparation of virus (e.g. influenza viruses) with known HA titer or determine its HA titer
Prepare two-fold dilutions of patient/test serum to be tested e.g. from 1:4 to 1:1024.
Add a fixed amount of virus to every well of a 96-well plate, equivalent to 4 HA units (varies according to virus),except for the serum control wells.
The plate is then allowed to stand at room temperature for 60 minutes (time varies according to specific requirements).
Add red blood cells (RBC) and incubate at 4oC for 30 minutes.
Read the wells.
Results/interpretation
The highest dilution of serum (Ab) that prevents hemagglutination is called the HAI titer of the serum.. A smooth or jagged shield of cells or an irregular button indicates agglutination. Observation of movement of the button of red cells when the plate is tilted may help to clarify the end point.
This virus sample has an HAI titer of 1280, which means that the greatest dilution of antibody that still blocked hemagglutination from occurring was at 1280 dilution. At this dilution, the antibodies were still capable of recognizing and binding to the antigens on the virus.
Quality Control
Known positive serum
Known negative serum
Serum and cells without antigen (to detect nonspecific agglutination)
Back titration of hemagglutination activity of the antigen (to ensure that 4 hemagglutinating virus (HAU) were tested)