Métodos para identificação de parasitos do sangue e

Prévia do material em texto

Métodos para identificação de 
parasitos no sangue e tecidos 
Ana Maria do Nascimento Cardoso 
1 
Tópicos a serem discutidos 
• Introdução e importância do EPS 
 
• Coleta de Sangue 
 
• Métodos e corantes 
 
• Exame parasitológico de Tecidos. 
 
• Métodos sorológicos 
2 
Introdução 
• Diagnóstico de diversas doenças parasitárias: 
 
 
• Malária; 
• Fialariose; 
• Doença de Chagas Aguda; 
• Babesiose. 
 
Formas 
parasitárias no 
sangue 
3 
Coleta do Sangue 
 Locais: 
• Polpa digital do anular esquerdo 
• Lóbulo da orelha 
 
 Limpeza da superfície 
 Pequena punção na pele 
 Compressão 
 
• Outros testes: punção venosa 
 
5 
Métodos 
A fresco 
Meios de cultura 
Esfregaço 
corado 
Xenodiagnóstico 
Inoculação em 
animais 
6 
Métodos 
• Direto 
 
1. Gota é colocada no centro da lâmina; 
2. Coberta com lamínula; 
3. Examinada imediatamente. 
 
 
• Gotas de salina: retarda a coagulação. 
7 
• Em esfregaços: 
 
 
 
 Gota delgada 
 Gota espessa 
 
 
Métodos 
Identificação de vários parasitos 
Diagnóstico epidemiológico 
8 
Esfregaço em gota delgada 
• Secar por agitação 
• Corar pelo Giemsa ou Leishman 
9 
Esfregaço em gota espessa 
1. 5 mm3 de sangue 
recém colhido no 
centro de uma lâmina 
2. Espalhar o 
material (1 cm2) 
7. Secar e 
visualizar 
6. Lavar com 
água destilada 
5. Repouso: 30 
minutos 
4. Corar: Giemsa 
3. Secar em 
temperatura 
ambiente (10 a 12 
horas) 
1. Profa. Deane – Pesquisa de Plasmodium: 
10 
Esfregaço em gota espessa 
2. Pesquisa de microfilárias: 
1. Utilizar 60 a 80 
mm3 de sangue 
2. Espalhar o 
sangue (4cm 
x1,5 cm) 
8. Lavar com 
água destilada 
6. Coloração pelo 
Giemsa (2 min) 
5. Fixação com 
metanol (2 min) 
7. Repouso(30 min) 
3.Secar (10 a 
12 horas) 
4.Desemoglobinização 
com água destilada 
(10 minutos) 
9. Deixar secar 
ao ar 
10. Examinar ao 
microscópio 
11 
• Giemsa 
• Solução estoque: 
 
 
 
 
 
 
• Para utilização: 
• 3 gotas de corante estoque: 2 ml de solução tampão (pH 7,2) 
Coloração 
12 
Solução tampão (pH 7,2) 
• Solução - estoque A: Fosfato dissódico 
• - Dissolver 11,866 g em 1 L de água destilada 
 
• Solução - estoque B: Fosfato monopotássico 
• - Dissolver 9,073g em 1 L de água destilada 
 
 
• Na hora de usar: 72,5 mL da solução A + 27,4 mL da solução B. 
 
 
13 
Manter em 
geladeira 
• Após feito o esfregaço: 
 
• Fixar pelo álcool metílico: cinco gotas /2 min; 
 
• Preparar o corante: 3 gotas do corante / 2ml de solução – 
tampão; 
 
• Cobrir o esfregaço; 
• Repouso: 20 a 30 min; 
• Escorrer o corante e lavar em água corrente; 
• Deixar secar; 
• Examinar ao microscópio. 
 
14 
Coloração 
• Leishman 
 
 
 
• Azul de metileno 
• Eosina 
Dissolver em 100 
ml da álcool 
metílico 
Agitar 
frequentemente 
por 3 dias 
15 
Coloração 
• Leishman 
• Após feito o esfregaço: 
 
• Seis ou sete gotas de corante; 
• Deixar agitar (fixar) por 15 segundos; 
• adicionar 12 a 14 gotas de solução-tampão; 
• homogeneizar,; 
• Repouso por 20 minutos; 
• Escorrer o corante e lavar em água corrente; 
• Deixar secar; 
• Microscópio. 
16 
• Exame do creme leucocitário 
 
• Pesquisa de flagelados é facilitada; 
• Grande volume de sangue; 
• Separação dos componentes por 
centrifugação; 
 
• Os leucócitos acumulam-se numa 
faixa estreita creme leucocitário 
• É nele onde os flagelados se 
concentram 
Concentração de hemoparasitos 
17 
Concentração de hemoparasitos 
• Exame do creme leucocitário 
 
• Punção venosa (10 ml) com 
anticoagulantes; 
 
• Centrifugar entre 1. 500 a 2.000 
rpm; 
 
• Com uma pipeta capilar, retirar o 
creme leucocitário; 
 
• Prepara o esfregaço e corar pelo 
Giemsa, ou examinar a fresco. 
18 
Concentração de hemoparasitos 
• Exame do creme leucocitário 
• Outro procedimento: 
 
• Centrifugar o sangue em baixa rotação (5 min); 
 
• Pipetar o sobrenadante , transferindo para outro tubo de 
centrifugação 
 
• Recentrifugar em alta velocidade durante 15 min. 
 
• Examinar o sedimento ao microscópio. 
19 
Método: Inoculação em animais 
• Método indireto; 
• Inoculação do patógeno em animal 
suscetível; 
 
 
• Separar as cepas de Tripanosoma cruzi 
no sangue dos pacientes em fase aguda. 
 
• Pesquisas científicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
• Hemocultura: 
 
• Sangue como um meio de cultura para patógenos. 
 
• Coleta 
• Centrifugação 
• Termorregulação 
 
 
 
• Utilizada em pacientes chagásicos submetidos à quimioterapia. 
 
Meios de cultura 
21 
 Meio LIT (LIVER INFUSION TRIPTOSE) 
 
 Mais utilizado 
22 
 Outros meios de cultura : 
 
 
 Meio de Bonacci; 
• Composição: peptona, cloreto de sódio, gelose e caldo de carne 
 
 Meio de NNN (Neal, Novy e Nicolle): 
• Mantimento e isolamento de espécies de Leishmania e cepas de 
Trypanosoma cruzi. 
• Composição: ágar, NaCl, água destilada e sangue. 
 
 
 
23 
Xenodiagnóstico 
 
• Diagnóstico indireto da Doença de Chagas Aguda / crônica; 
 
• Triatomíneos se infectam sugando o sangue do paciente; 
• Ninfas no 4° ou 5° estádio  Mantidas em jejum por 1 
semana; 
• Criadas em laboratório e alimentadas com sangue de aves. 
 
• Natural 
• Artificial 
24 
Xenodiagnóstico 
• Natural 
 
Ao final da primeira semana, proceder com o exame de fezes dos 
insetos 25 
Xenodiagnóstico 
 
• Artificial (in vitro) 
• Colher 10 ml de sangue com 
anticoagulante num preservativo de látex 
sem lubrificante; 
 
• Prender à borda de um cristalino, onde 
se encontram os triatomíneos; 
 
• Cobrir com pano escuro ou guardar em 
um armário 
 
• Utilizar espécie endêmica ou várias para 
um melhor diagnóstico. 
 
 
REY, Luís. Parasitologia. 4.Ed.Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan.2008.910p 
26 
Exame parasitológico de tecidos 
• Punção aspirativa: 
• Dois tipos: 
 
• Punção Aspirativa por Agulha Fina (PAAF) 
• Core biopsy 
27 
 
• Uma amostra de células é coletada com a agulha e então 
retirada; 
• Esfregaços em lâminas de vidro para microscopia 
 
• Fixação 
• Coloração (Giemsa ou Leishman) 
• Visualização 
28 
Exame parasitológico de tecidos 
• Pode ser aplicada no diagnóstico parasitológico de LVA; 
 
• Permite a observação direta de formas amastigotas; 
 
• Esfregaços: 
• Linfonodo, medula óssea, baço, fígado 
• Punção aspirativa esplênica: + sensibilidade 
• + risco ao paciente 
 
Punção aspirativa 
29 
Métodos Sorológicos 
• ELISA (Ensaio imunoenzimático) 
 
 
 
• Reação antígeno - anticorpo 
• Coleta do material parasitológico – sorológico; 
• Reações enzimáticas – antígeno / anticorpo; 
• Peroxidase; 
• Vários métodos => direto, indireto, por competição. 
 
30 
ELISA INDIRETO 
1. Adiciona-se 
antígeno 
específico 
2. Adiciona-se 
o soro do 
paciente 
3. Forma-se 
o complexo 
ag-ac 
4. Lavagem. 
Retirar o excesso de 
anticorpos que não 
se ligaram 
5. Adiciona-se uma 
antiglobulina ligada 
uma enzima 
6. Nova 
lavagem 
7. Adiciona- se 
o substrato 
para a enzima 
31 
ELISA DIRETO 
• Neste caso, ao invés do antígeno, teremos oanticorpo 
específico no fundo da amostra; 
• O anticorpo irá se ligar com o antígeno, se presente no soro.. 
32 
Método ELISA 
 
• Leitura e quantificação: 
 
• Espectrofotômetro 
33 
Imunofluorescência indireta (RIFI) 
• Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a 
moléculas reveladoras 
• chamadas fluorocromos. 
 
• Visualização em microscópio de 
fluorescência 
 
 
1. Por em contato anticorpos 
marcados a um antígeno figurado; 
2. Incubação 
3. Lavagem 
4. Visualização 
34 
• Pesquisa de antígeno 
 
• Incubar o soro com anticorpo 
específico 
• Lavagem 
• Incubação com antiimunoglobulina 
• Lavagem 
• Exame em microscópio de 
fluorescência 
35 
Imunofluorescência indireta (RIFI) 
• Pesquisa de anticorpos 
 
• Antígenos padronizados  Lâmina de vidro 
 
• Soro problema: 
 
 
• Lavagem; 
• Incubação com conjugado fluorescente; 
• Antiimunoglobulina 
• Exame microscópico 
 36 
1. Diluir 2. Adicionar à lâmina 3. Incubar 
Imunofluorescência indireta (RIFI) 
37 
Fotomicrografia de teste sorológico de 
imunofluorescência indireta, evidenciando 
formas tripomastigotas fluorescentes de 
Trypanosoma cruzi. 
Imunofluorescência indireta (RIFI) 
Hemaglutinação (HA) 
• Reações de aglutinação (floculação celular) 
• Consequência visível de reação Ag-Ac: 
 
• Ag constituído ou transportado por partículas de grande porte: 
 
• Hemácias 
 
 
 
• Elevada sensibilidade 
38 
39 
Fatores que interferem 
40 
Hemaglutinação 
41 
Obrigada!!! 
42