Provas Bioquímicas

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METABOLISMO BACTERIANO: 
PROVAS BIOQUÍMICAS 
 
OBJETIVOS DA PRÁTICA 
 Conhecer os princípios das provas 
bioquímicas utilizadas na identificação de 
espécies microbianas. 
 
 Executar técnicas e interpretar resultados 
de identificação de espécies bacterianas 
através de provas bioquímicas. 
Introdução 
 Por que realizar essa prática? 
 A identificação de bactérias requer a 
observação e apreciação de caracteres 
morfológicos, culturais, metabólicos ou 
bioquímicos, antigênicos ou sorológicos, 
genéticos, ecológicos, etc. 
 As colorações simples, diferenciais ou 
estruturais, mesmo se combinadas com 
diferentes tipos de cultivo e observação das 
características das colônias, não são 
suficientes para a identificação de bactérias 
isoladas. 
 Devem-se utilizar outras técnicas ou 
metodologias que, combinadas com as outras 
características descritas anteriormente, 
possibilitem determinar com precisão qual a 
bactéria com que se está trabalhando e/ou 
pesquisando. 
 
Principais testes usados para 
identificação bacteriana 
◦ Fermentação de carboidratos 
◦ Teste da catalase 
◦ Teste de utilização de citrato 
◦ Liquefação de gelatina (gelatinase) 
◦ Produção de H2S (gás sulfídrico) 
◦ Teste do indol 
◦ Teste do vermelho de metila (VM) 
◦ Teste Voges-Proskauer (VP) 
◦ Hidrólise do amido. 
 Embora não fundamentado em reações 
bioquímicas, o teste de motilidade é de 
grande utilidade na distinção de gêneros e 
espécies bacterianas. 
 
Introdução 
 Identificação bacteriana 
 Provas bioquímicas: utilização de 
carboidratos, proteínas, lipídeos, etc. 
 Coliformes termotolerantes 
 Confirmação de E. coli- Teste IMViC (Indol, 
Vermelho de metila, Voges-Proskauer e 
Citrato) 
IMViC 
 Teste com finalidade de diferenciar e 
identificar bactérias entéricas de natureza 
patogênica ou não, que atuam 
principalmente como contaminantes da 
água e dos alimentos. 
Detecção de gêneros em testes para coliformes, seus habitats 
fecais ou não fecais e sua enteropatogenicidade potencial 
para o homem. 
MEIOS DE CULTURA 
 
 Meio SIM (Sulfeto-Indol-Motilidade): 
peptona (contém o aminoácido 
triptofano), extrato de carne, ferro 
peptonizado, tiossulfato de sódio e ágar. 
 
 Meio Clark-Lubs (meio para VM-VP): 
peptona, dextrose, fosfato de potássio. 
 
 Meio citrato de Simmons: citrato de sódio, 
sulfeto de magnésio, fosfato de dipotássio, 
fosfato de amônia, cloreto de sódio, ágar, 
azul de bromotimol. 
 
 Gelatina Nutritiva 
 
 
PROVA DO INDOL 
  Objetivo: determinar a capacidade do micro-
organismo degradar o aminoácido triptofano 
até indol. 
 
 Princípio: bactérias que possuem a enzima 
triptofanase são capazes de degradar 
triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico 
e amônia. O indol se acumula no meio e 
pode ser detectado pela adição do reativo de 
Kovacs (paradimetilaminobenzaldeído). 
PROVA DO INDOL 
 
 O reativo de Kovacs (0,5 mL) contém 
um aldeído (p-dimetilaminobenzaldeído) 
que reage com o indol havendo o 
desenvolvimento de uma cor vermelha. 
PROVA DO INDOL 
 
 Procedimento: Transferir micro-
organismo a ser testado para o meio SIM. 
 Após incubação a 35oC ± 2oC/ 48h, 
adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs 
em cada tubo. 
 Observar se há formação de anel rosa na 
superfície do meio. 
 
Prova do Indol- RESULTADO 
Positivo: presença de coloração vermelha na superfície do meio. 
PRODUÇÃO DE H2S 
 Objetivo: demonstrar o processo 
bioquímico de produção de sulfeto de 
hidrogênio (gás sulfídrico) por bactérias. 
 
 Princípio: algumas bactérias são capazes 
de hidrolizar aminoácidos sulfurosos e 
produzir H2S. Esse produto pode ser 
evidenciado pela adição de compostos 
inorgânicos com ferro. 
PRODUÇÃO DE H2S 
 A enzima redutase do tiossulfato 
convertem o tiossulfato em sulfito com 
liberação de sulfeto de hidrogênio. 
 
 Na reação positiva a produção de gás 
sulfídrico em presença de sais de ferro 
(presentes no meio SIM) forma sulfeto 
insolúvel de cor negra. 
PRODUÇÃO DE H2S 
 Procedimento: transferir o micro-
organismo a ser testado para o meio SIM 
(semi-sólido), introduzindo a agulha de 
inoculação no centro do meio de cultura 
 Incubar a 35oC ± 2oC /24 a 48 h. 
 Após incubação, observar a presença de 
um precipitado escuro. 
PRODUÇÃO DE H2S 
 Triptofano +água ácido pirúvico + 
H2S + amônia 
 H2S + íon férrico sulfeto ferroso 
(precipitado negro) 
 Resultado: 
◦ Positivo para produção de H2S: presença do 
precipitado escuro no meio. 
◦ Negativo para produção de H2S: ausência do 
precipitado escuro no meio. 
 
MOTILIDADE 
 Não é classificado como prova bioquímica 
e sim fisiológica. 
 
 Resultado positivo: micro-organismos 
deslocam a linha de inoculação turvando 
o meio. 
Prova Vermelho de Metila 
 O teste VM visa identificar se a bactéria é 
capaz de produzir ácidos estáveis como 
produtos finais de fermentação. Na 
fermentação ácido-mista da glicose são 
produzidos ácido lático, ácido acético, 
ácido fórmico que reduzem o pH para 4,4. 
Prova Vermelho de Metila 
 Objetivo: determinar a capacidade dos 
micro-organismos para utilizar a glicose com 
produção e manutenção de concentrações 
altas de produtos finais ácidos. 
 
 Nesta prova o indicador de pH, vermelho de 
metila, detecta a presença de grandes 
concentrações de produtos finais ácidos, pois 
tem um ponto de viragem baixo. 
Prova Vermelho de Metila 
 A adição do indicador de pH (vermelho de 
metila) revela a acidez do meio. 
 
 A pH 4, o vermelho de metila adquire cor 
vermelha, o que indica uma reação 
positiva. 
 
Prova Vermelho de metila 
 
 
 Procedimento: transferir o micro-
organismo a ser testado para o meio Clark 
e Lubs (pH 7/ 7,2). 
 Incubar a 35oC ± 2oC /48h. 
 Após incubação, adicionar 4 a 5 gotas do 
indicador vermelho de metila e observar a 
coloração final do meio. 
 
 
Prova Vermelho de metila- 
RESULTADO 
Resultado positivo para produção de ácidos orgânicos: vermelho. 
Em meios acidificados, pH menor que 4, indicador torna-se vermelho. 
Em meios com pH maior ou igual a 6, indicador adquire cor amarela. 
Prova Voges-Proskauer (VP) 
 O teste VP identifica organismos capazes de 
produzir acetoína a partir de degradação da 
glicose através da via butilenoglicolítica. 
 
 Na fermentação butilenoglicólica são 
gerados produtos neutros, como o 
butilenoglicol, cujo o precursor é a acetoína. 
Prova Voges -Proskauer 
 
 Objetivo: determinar a capacidade dos 
micro-organismos de produzirem produtos 
finais não ácidos ou neutros a partir da 
fermentação da glicose, como o 
acetilmetilcarbinol (acetoína) que é oxidado 
a diacetil. 
 Princípios: a produção de compostos não-
acídicos, como acetoína, podem ser 
identificados pela adição ao meio de cultivo 
dos reagentes de Barrit (soluções A e B). 
 
 
Prova Voges -Proskauer 
 
 Procedimento: transferir o micro-organismo 
a ser testado para o meio Clark e Lubs (pH 7/ 
7,2). 
 Incubar a 35oC ± 2oC /48h. 
 Após incubação, adicionar a cada tubo 15 
gotas do reagente A de Barrit (-naftol a 5%) 
e 5 gotas do reagente B de Barrit (solução de 
KOH a 40%), agitar vigorosamente o tubo, 
deixar em repouso por 15 a 20 minutos e 
observar o resultado. 
 
 
Prova Voges -Proskauer 
 
 A adição do reagente de Barrit (solução de 
alfa-naftol e metanol absoluto e solução de 
KOH) permite detectar a presença de 
acetilmetilcarbinol (acetoína), poisocorre a 
formação de um complexo rosa/vermelho 
que dá essa cor ao meio de cultura. 
 O desenvolvimento de uma cor 
rosa/vermelha na cultura, após a adição do 
reagente de Barrit representa uma prova 
positiva. 
 
 Glicose ácido pirúvico acetoína 
 Acetoína diacetil complexo 
vermelho (Prova de Voges-Proskauer 
positiva). 
 Prova Voges –Proskauer- RESULTADO 
Prova do Citrato 
 
 Permite diferenciar micro-organismos com 
base na sua capacidade de utilizar o citrato 
como única fonte de carbono. 
Ex: Enterobacter aerogenes e Salmonella 
typhimurium 
 
 A bactéria que utiliza citrato como fonte de 
carbono também é capaz de utilizar os sais 
orgânicos de amônia como única fonte de 
nitrogênio. 
Prova do Citrato 
 O produto final do metabolismo desses 
sais é a amônia, que eleva o pH do meio. 
 
 Indicador de pH: azul de bromotimol. 
 
 O aumento do pH é percebido pela 
mudança de cor de verde para azul. 
 
 
 
Prova do Citrato 
 
 Esta capacidade depende da presença da 
enzima citratase. 
 
 Só ocorre na ausência de carboidratos 
fermentáveis 
 
Prova do Citrato 
 Procedimento: transferir o micro-organismo 
a ser testado para o meio ágar citrato de 
Simmons, em tubo inclinado (maior 
concentração de O2). 
 
 Incubar a 35oC ± 2oC /48h. 
 
 Após incubação, observar as culturas 
contidas no tubo, avaliando a presença ou 
ausência de crescimento e as alterações na 
cor do meio de verde para azul. 
 
 
Prova do Citrato -RESULTADO 
 
+ - 
PROVA DA GELATINASE 
 Princípio: Determina a habilidade do 
micro-organismo de produzir enzimas 
proteolíticas (gelatinases) que 
liquefazem/hidrolisam gelatina. 
 
PROVA DA GELATINASE 
 Reação positiva: se a 
gelatina foi hidrolisada 
pela gelatinase, o meio 
mantém-se líquido após 
refrigeração. 
 Reação negativa: Se o 
micro-organismo não 
possui gelatinase, o 
meio volta a solidificar 
durante o período em 
que está no refrigerador. 
 
+ 
- 
PROVA DA GELATINASE 
 Objetivo: demonstrar que algumas 
bactérias hidrolisam o amido por 
produzirem uma enzima extracelular: a 
amilase. 
 Princípio: a ação dessa enzima pode ser 
evidenciada, cultivando-se a bactéria em 
meio de cultura contendo amido. 
 
PROVA DA AMILASE 
 Objetivo: demonstrar que algumas 
bactérias hidrolisam o amido por 
produzirem uma enzima extracelular a 
amilase. 
 Princípio: a ação dessa enzima pode ser 
evidenciada, cultivando-se a bactéria em 
meio de cultura contendo amido. 
 
PROVA DA AMILASE 
 Procedimento: 
◦ Adicionar 0,2% de amido de milho ao 
meio (Ágar Nutritivo). 
 
◦ Inocular as culturas a serem testadas na 
placa, com o auxílio de uma alça de 
inoculação estéril, em pelo menos duas 
estrias eqüidistantes. 
PROVA DA AMILASE 
◦ Incuba-se a placa a 35ºC/48 horas. 
 
◦ Após o período de incubação, adicionar 
várias gotas de lugol sobre as linhas 
estriadas na superfície do ágar. 
 
 
PROVA DA AMILASE-Resultado 
Positivo: área ao redor da linha de crescimento apresenta-se clara. 
Negativo: o meio torna-se azul/escuro, sem regiões claras ao redor 
da linha de crescimento. 
PROVA DA CATALASE 
 Verificar a positividade do teste em uma 
lâmina de vidro comum contendo uma 
porção do material fresco a ser 
analisado, em tubos de ensaio com a 
cultura ou mesmo em placas de Petri 
com colônias viáveis. 
PROVA DA CATALASE 
 
 A formação de bolhas após adição do 
peróxido de hidrogênio indica a 
positividade do teste, ou seja a presença 
da enzima catalase. 
 
PROVA DA CATALASE 
Procedimento: 
◦ Tubos de ensaio ou placas de Petri com Ágar 
Nutritivo são inoculados com as culturas a 
serem testadas. 
◦ Incuba-se a 35ºC por 18-24 horas. 
◦ Após o período de incubação, adicionar 
algumas gotas de peróxido de hidrogênio 
(Água oxigenada-H2O2) e observa-se a 
formação ou não de bolhas. 
 
PROVA DA CATALASE 
 
Positivo: formação de bolhas indica a presença da enzima catalase. 
Negativo: sem formação de bolhas. 
Fermentação de Carboidratos 
 
 Procedimento: 
◦ Carboidratos a serem testados (Glicose, 
Lactose, Sacarose e Manitol) são 
adicionados ao meio líquido Caldo 
Vermelho de Fenol e são distribuídos em 
tubos de ensaio contendo tubos de 
Durham. 
 
 
Fermentação de carboidratos 
◦ Com o auxílio da alça de inoculação, as 
bactérias são transferidas para o meio 
de cultura. 
 
◦ Incuba-se a a 35ºC por 24-48 horas. 
 
◦ Após o período de incubação, observar 
a coloração do meio e a presença ou 
ausência de bolhas no interior do tubo 
de Durham. 
 
 
 
 A verificação deste teste é visual, se a 
bactéria fermentar o carboidrato 
presente no meio haverá produção de 
ácidos ou ácidos + gás. 
 
Fermentação de carboidratos-
RESULTADO 
 
 
Positivo para gás: formação de bolhas no interior do tubo de Durham 
Positivo para ácido: meio de cultura na cor amarela. 
Negativo para gás: sem formação de bolhas. 
Negativo para ácido: meio de cultura na cor vermelha. 
 
RESULTADOS 
 Execução do procedimento seguindo 
as técnicas assépticas e observando a 
metodologia a ser seguida. 
 Após o período de incubação, anotar 
os resultados na tabela, comparar com 
os dados da literatura para fazer a 
identificação dos micro-organismos 
testados. 
 
Tabela para resultados 
Gelatinase