COPROCULTURA AULA PRATICA

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1. Coleta da amostra e transporte 
Coletar amostra, sempre que possível, antes da antibioticoterapia. Coletar a 
amostra do sítio anatômico onde o microrganismo suspeito possa ter mais chance de ser 
isolado. Fazer antissepsia antes de coletar as amostras. Aguardar 72 horas após 
mudança da antibioticoterapia para coletar novas amostras do mesmo sítio de infecção. 
Deve-se utilizar frascos e meios de transporte apropriados. Enviar a amostra ao 
laboratório o mais breve possível, onde se estiver em temperatura ambiente em até duas 
horas, após duas horas, refrigerar e processar dentro de vinte e quatro horas e se colhida 
com preservativo(ácido bórico), enviar em temperatura ambiente e processar em vinte e 
quatro horas. 
Em situações onde o próprio paciente irá realizar a coleta (por exemplo: urina, 
fezes), instruí-lo de maneira clara e certificar-se de que ele entendeu as orientações, 
coletando o jato médio comumente com a amostra retida pelo paciente por pelo menos 
três a quatro horas antes da coleta. Já quando é qualquer jato coletar por saco 
coletor(crianças), paciente com sonda, punção supra púbica. 
2. Microscopia 
Na microscopia é analisado a lâmina, vendo o arranjo do microorganismo, 
formato e principalmente se são gram positivo ou gram negativo, característica que é 
dada pela diferença na parede celular, com os gram positivos possuindo uma camada 
mais espessa de peptideoglicano e as gram negativas com camada de mureina mais fina 
e lipopolissacarideos. Na lâmina é adicionado 10uC da amostra, que seca e realiza a 
fixação no fogo para então fazer a coloração de gram. 
Na coloração de Gram é realizada da seguinte forma: 
 Fixar o material por calor ou com o uso de metanol 
 1 minuto 
 esfregar 
 (Lugol) e deixar por 1 minuto 
 
 (70 mL): acetona (30 mL) para 
descorar 
 
 Cobrir com fucsina por 40 segundos 
 Lavar c 
 
3. Meios de isolamento 
3.1. CLED 
O meio Ágar Cled é um meio de cultura enriquecido, destinado ao isolamento e 
cultivo de diversos microrganismos, recomendado para amostras de urina, fornecendo 
uma boa diferenciação colonial, com características diagnósticas nítidas. Permite, 
portanto, a cultura e contagem de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, 
 p “ é ” Proteus spp. Este tem como principio de ação a 
lactose, que facilita a detecção de coliformes contaminantes fermentadores da mesma e 
que são facilmente reconhecidos pela mudança de coloração do meio (verde para o 
amarelo). 
No procedimento deve-se inocular a amostra por estrias através de esgotamento 
da alça de platina, obedecendo os critérios internos do laboratório acerca das condições 
de assepsia e esterilidade do local de trabalho. Incubar a placa inoculada a 35 ± 2ºC por 
24 horas. Após incubação, observar as placas. 
Por ser um meio quantitativo, não havendo crescimento bacteriano, constata-se 
amostra isenta de bactérias. Caso ocorra o crescimento bacteriano, realizar a contagem do 
número de colônias e multiplicar pelo fator de diluição ou pelo volume relativo da alça. 
Este procedimento visa obter o número de colônias/ml. 
Exemplo: nº de colônias contadas: 25 
Calibração da alça= 1,0×10-³ ml 
nº de colônias/ml=25×10³=25.000 colônias/ml 
3.2. Mac Conkey 
Trata-se de um meio de cultura seletivo e a concentração dos sais biliares, são 
responsáveis pela inibição de microorganismos Gram positivos, apresentação redução 
quando há relação com outros meios entéricos. Justamente por isso, também é uma 
 “ ”, j , q p 
determinados microorganismos, sendo eles Gram negativos. 
Neste meio, as bactérias Gram negativas produzem colônias com coloração rosa e 
as bactérias que são incapazes de realizar a fermentação, são incolores. A distinção das 
cores é bem evidente, marcante, justamente para facilitar todo o processo e evitar falhas 
em determinados estudos laboratoriais. Podemos classificar da seguinte maneira: colônias 
rosadas (ou avermelhadas) são formadas por bactérias fermentadoras de lactose. 
 
4. Identificação 
4.1. Gram negativos 
4.1.1. EPM 
Produção de gás: a enzima hidrogenilase fórmica (formiase) desdobra o ácido 
fórmico (um dos ácidos produzidos durante a fermentação da glicose) em CO2 e H2-. O 
Gás é evidenciado pela presença de bolhas, rachaduras e/ou deslocamento do meio da sua 
posição original no tubo. 
Produção de H2S: a enzima tiossulfato-redutase age sobre o tiossulfato de sódio, 
produzindo H2S, o qual é evidenciado através da reação com o citrato férrico amoniacal, 
que originará um sulfeto de ferro insolúvel de cor negra. 
Hidrólise da uréia: a uréase desdobra a uréia em CO2 e NH3, o qual se dissolve 
sob a forma de carbonato de amônia, alcalinizando o meio. Neste caso, a base do meio 
fica azul ou verde-esverdeada (reação fraca). 
 
 
Triptofano desaminase: a enzima L-triptofano desaminase (LTD) promove a 
desaminação oxidativa do aminoácido L-triptofano, convertendo-o em acetato-
ácido(ácido indol-pirúvico), o qual reage com sais de ferro originando um composto 
cíclico de cor verde escura. Outro aminoácido muito utilizado no teste é a fenilalanina, 
cujo produto final da desaminação é o ácido fenilpirúvico. A desaminação ocorre em 
aerobiose, sendo observada no ápice do meio EPM. 
 
Figura 1: Teste EPM 
 
Figura 2: Teste da fenilalanina desanimase (tubo 1 e 2) e Úreia de 
Christensen (tubo 3 a 5) 
4.1.2. Mili 
Motilidade: a bactéria móvel cresce além da linha de inoculação, turvando parcial 
ou totalmente o meio; enquanto a bactéria imóvel cresce somente onde foi inoculada, 
deixando o meio translúcido. 
Indol: a enzima triptofanase age sobre o triptofano, resultando na liberação do 
indol. Esta reação é evidenciada pela adição dos reativos de Kovacs e de Ehrlich (p-
dimetilamino-benzaldeído), produzindo uma coloração vermelha. 
 
Figura 4: Teste do indol 
 
Lisina descarboxilase (LDC): a LDC promove a remoção do CO2 da lisina, 
produzindo uma amina(cadaverina) e alcalinizando o meio, que adquire a cor púrpura em 
toda a sua extensão. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire a cor amarela 
nos seus dois terços inferiores. 
 
 
Figura 5: Teste Mili 
 
4.1.3. Citrato 
 Citrato de sódio é um composto orgânico simples encontrado como um dos 
metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxilicos (ciclo de Krebs). Algumas bactérias 
podem obter energia utilizando o citrato como única fonte de carbono. Esta característica 
é importante para a identificação de alguns membros de Enterobacteriaceae: E. coli é 
citrato negativo, enquanto as espécies de Enterobacter e Klebsiella são positivas. O meio 
a ser empreagado para o teste inclui citrato de sódio e fosfato de amônia como única 
fonte de carbono e nitrogênio e deve ser isento de proteínas e carboidratos. As bactérias 
que produzem a enzima citratase e conseguem utilizar o citrato como única fonte de 
carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo amônia, alcalinizando o 
meio. O indicador utilizado é azul de bromotimol, que em PH ácido é amarelo e em PH 
alcalino é azul. 
 
Figura 6: Teste do citrato 
 
4.2. Gram positivo 
4.2.1. Teste da catalase 
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2), sendo 
muito utilizado na diferenciação de Staphylococcus e Streptococcus. O teste é executado 
pela transferência de colônia para uma lâmina de microscopia e adição de uma gota de 
agua oxigenada a 3%. O aparecimento imediato de borbulhamento na superfície da 
suspensão indica reação positiva, indicando serem Staphylococcus. 
Como algumas bactérias possuem outras enzimas diferentes da catalase, capazes 
de decompor o peroxido de hidrogênio,a formação reduzida de pequenas bolhas após 20 
segundos não é considerado reação positiva. Além disso, deve evitar hemácias, que 
também produzem catalase e podem ocasionar reações falso-positivas. 
 
Figura 7: Teste da catalase 
4.2.2. Teste da coagulase 
O teste da coagulase verifica a capacidade de microorganismos reagirem com o 
plasma e formarem um coagulo, já que a coagulase é uma proteína com atividade similar 
a protrombina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina. 
Para o teste, utiliza plasma de coelho, que na presença de coagulase, irá formar 
coágulos no tubo. 
Ele é usado para separar as espécies de Staphylococcus de importância clinica (S. 
aureus), que é coagulase positiva, das demais espécies do gênero (por serem coagulase 
negativa). 
 
Figura 8: Teste da Coagulase 
4.2.3. Teste da DNAase 
O teste da DNAase é usado para detectar a degradação do DNA contido no meio 
de cultura por bactérias que possuem a enzima extracelular desoxirribonuclease, 
responsável pela reação. 
O teste é útil para diferenciar Staphylococcus aureus dos demais tipos 
bacterianos. Ao utilizar o meio Ágar DNAse, deve-se acrescentar uma quantidade de HCl 
para revelar a atividade enzimática. 
Um alo transparente em volta da colônia indica reação positiva. Caso não haja 
atividade dessa enzima, o HCl reagiu com o ácido nucleico intacto, formando um 
precipitado em todo ágar. 
 
Figura 9: Teste da DNAse 
4.2.4. Teste da Novabiocina 
O teste é fundamentado na propriedade de S.saprophyticcus ser resistente á 
novabiocina. Diferencia, presuntivamente, esta espécie de outros estafilococos coagulase-
negativos, os quais são suscetíveis á novobiocina. Para o teste na concentração de 5 µg. 
 
Figura 10: Teste da Novabiocina 
4.2.5. Teste da optoquina 
O teste diferencia presuntivamente amostras de Streptococcus pneuminiae 
(pneumococos) de outros Streptococcus sp. α-hemolíticos. A optoquina (5 µg) ou 
cloridrato de etil-hidrocupreína, um derivado de quinina, inibe seletivamente o 
crescimento de S. pneumoniae, produzindo halos de inibição entre 14 a 18mm. 
É utilizado na diferenciação do S.pneumoniae de outros estreptococos 
αh í , incubação do teste deverá ser em 5% CO2, pois 8% das cepas não 
crescem em temperatura ambiente, além da atmosfera com 5% CO2 aumentar a 
especificidade do teste, apesar de não chegar a 100%, pois existem cepas que são 
resistentes à optoquina. Para aumentar a acurácia na identificação do S.pneumoniae deve 
ser associado ao teste de bile solubilidade 
 
Figura 11: Teste da optoquina 
4.2.6. Teste da bíli solubilidade 
O teste da solubilidade na bíli baseia-se na constatação da lise das células de 
Streptococcus pneumoniae quando tratadas com uma solução a 10% de desoxicolato de 
sódio, enquanto os outros estreptococos e os cocos Gram-positivos não são solúveis na 
bílis. A lise ocorre porque os microrganismos solúveis na bílis contêm uma amidase 
autolítica que, quando activada pelos sais biliares, efectua a clivagem da ligação entre a 
alanina e o ácido murâmico na parede celular. 
Teste da bile solubilidade é utilizado na identificação do S.pneumoniae e pode ser 
realizado em tubo ou direto na placa com a cepa isolada. O teste tem como princípio 
básico a lise celular, resultado da diminuição da tensão entre o meio e a membrana 
celular, e do desarranjo da membrana celular bacteriana, causados pelos sais biliares. 
 
Figura 12: Teste da bili solubilidade 
4.2.7. Teste de PyR 
O teste PYR consegue identificar, de modo presuntivo, os estreptococos B-
hemolíticos do grupo A (S. pyogenes) e algumas espécies de Enterococcus. Os 
Enterococcus, possuem pyrrolidonilarilamidase (enzima), no qual hidrolisa a amida do 
substrato (L-pirrolidonil- β - ), β-naftilamida livre, produzindo uma 
coloração vermelho brilhante ao se adicionar o reagente composto p-dimetil-
aminocinamaldeído a 0,01%. O teste pode ser realizado em tubo contendo caldo 
adicionado do reativo PYR ou com papel de filtro impregnado com o reativo. Em todo 
caso, é necessário adicionar o reagente revelador para preceder à leitura do teste. A fim 
de visualizar, a figura 1 demonstra o teste em questão. 
 
Figura 13: Teste de PYR (+ e -). 
 
4.2.8. Teste CAMP 
O fator CAMP é um composto (semelhante à proteína) produzido pelos 
 p β-hemolíticos do grupo B (Streptococus agalactiae), no qual é capaz de 
 β-hemolisina (produzida por Straphylococcus aureus), 
 β-hemólise. As amostras são inoculadas em 
placa ágar sangue em estrias, de modo que forme um ângulo reto com a linha de 
inoculação do estafilococo. O teste positivo é evidenciado pelo alargamento da zona de 
hemólise, apresentando a forma de ponta de flecha na área de intersecção das duas 
estrias. Tal fenômeno é verificado tanto com isolados hemolíticos quanto não-hemolíticos 
de estreptococos do grupo B. Na figura abaixo é possível ver o teste de CAMP. 
 
Figura 13: Teste de CAMP 
 
4.2.9. Teste da biliesculina 
Para a identificação presuntiva de espécies de Enterococcus e Streptococcus do 
grupo D (S. bovis e S. equinus), utiliza-se o teste da bile-esculina, em que se baseia na 
capacidade destas bactérias hidrolisarem a esculina em presença de bile (4% de sais 
biliares ou 40% de bile). Entende-se por esculina um derivado da cumarina glicosídica 
(6- β-glicosídeo-7-hidroxicumarina). AS duas partes da molécula (glicose e 7-
hidroxicumarina) são ligadas por uma ponte de éster através de oxigênio. Para se realizar 
o teste, a esculina é incorporada ao meio contendo bile. As bactérias que são bile-esculina 
positivas tem a capacidade de crescer na presença de sais biliares. A hidrólise da esculina 
resulta na formação de glicose e de um composto conhecido como esculetina. Este reage 
com citrato férrico do meio, formando um complexo preto difundível, indicando a 
positividade do teste. As figuras seguintes representam o mecanismo de reação de bile-
esculina e o teste positivo para Entereococcus. 
 
Figura 14: Mecanismo de reação de bile-esculina. 
 
Figura 15: Teste da tolerância ao sal e bile-esculina de Entereococcus (positivo). 
 
4.2.10. Teste do NaCl 
Utiliza-se a prova de tolerância ao sal para a identificação de bactérias tolerantes 
aos meios hipertônicos (diferenciar Enterococcus spp. De Streptococcus spp. do grupo 
D.). O meio empregado na prova é composto por glicose, NaCl (6,5%) e uma substância 
indicadora de pH (púrpura de bromocresol), em que o crescimento bacteriano com 
fermentação da glicose produz acidificação do meio e, consequentemente, variação da cor 
púrpura para amarelo (teste positivo). Vale destacar que a concentração do sal varia 
dependendo do grupo de bactérias a ser analisado. A indicação de mudança de coloração 
é demonstrada na figura 4. 
REFERÊNCIAS: 
TRABULSI., 
PROLAB, Materiais para diagnóstico. Ágar Macconkey: entenda sobre sua 
composição e modo de preparo. 2019. Disponível em: 
https://www.prolab.com.br/blog/curiosidades/agar-macconkey-entenda-sobre-sua-
composicao-e-modo-de-preparo/. Acesso em: 20/03/2021. 
MBIOLOG Diagnósticos. Ágar Cled. Disponível em: 
http://www.mbiolog.com.br/site/?page_id=208. Acesso em: 20/03/2021. 
ANVISA. Modulo 4: Gram positivos. Disponível em: 
https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modu
lo4/id_sta4.htm. Acesso em: 20/03/2021.