Aula 10 DNArecombinante ClonagemGenica

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DNA recombinante in a nutshell
Biologia Molecular Aplicada 
A tecnologia do DNA recombinante
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Teoria bem fundamentada
• Por volta do início da década de 
70, os fundamentos básicos da 
teoria já haviam sido propostos 
solidamente por Crick, Watson e 
C&A
• Assim, os cientistas passaram a se 
perguntar: será que o material 
genético e o processo de 
expressão podem ser 
manipulados?
• Ciência X (Bio)Tecnologia
A descoberta da DNA ligase
• 1960: recombinação de 
DNA ocorre em células
– Reparo de danos ocorridos 
por luz UV
• 1967, Martin Gellert
– Extratos de E. coli produziam 
fagos lambda circulares
– Purificação da DNA ligase!
• Circularização de genomas
Paul Berg
• Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda
– Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele
• Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os 
juntos, utilizando DNA ligase
– Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente 
moléculas de DNA
• Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos 
corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus
• Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia 
molecular
• Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica de 
ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA 
recombinante”
Paul Berg, 1926-
Fago λ
SV40
Endonucleases de restrição
• 1968, Paul Arber sugere a existência de 
enzimas existentes em bactérias que atuassem 
como proteção à infecção por fagos
– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios 
específicas
– Endonuclease R
• 1968
– Meselson & Yuan: EcoRI
• 1970
– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta 
em H. influenzae -- HindIII
– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta 
DNA exógeno mas não DNA celular
– Descoberta do sítio específico de corte pela 
enzima (AAGCTT)
Mapa de restrição
• 1971 - Kathleen Danna and Daniel 
Nathans
• Ensaio de digestão: Usam a 
endonuclease R (EcoRI) para 
cortar o DNA do fago SV40
• Fragmentos tinham tamanho 
constante e, logo, podiam ser 
facilmente separados em uma 
eletroforese!
– Verificado o fato de que a enzima 
corta em sítios específicos
Ec
o
R
I
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H
in
d
II
I
De novo, Berg
• 1972, Berg’s lab
– Janet Mertz and Ronald Davis 
descobrem que a endonuclease R1 
produzia quebras espaçadas entre as 
duas fitas, gerando extremidades 
coesivas idênticas e complementares
• Extremidades unidas e encubadas com 
DNA ligase poderiam gerar moléculas 
de DNA híbridas!
Extremidades 
cegas
Extremidades 
coesivas
Ensaio de digestão
• Adicione DNA + tampão + 
endonuclease de restrição
• Deixe digerindo num banho a 
determinada temperatura por 
determinado tempo
• 1 unidade de enzima de restrição 
digere 1 μg DNA em 1h00
• Caixa de truques do biólogo 
molecular contém: DNA ligase + 
enzimas de restrição + ...
Vetores de clonagem
• ~1970: Trabalho com plasmídeos
• Peças de DNA circulares e não cromossomais
encontradas em bactérias
– E às vezes trocadas por elas
• 1970
Descobriu um método segundo
o qual uma E. coli adquiriria um 
plasmídeo conhecido como pSC101
• pSC101: contém um gene que 
confere resistência ao anti-
biótico tetraciclina
Stahen Cohen, 1936-
Plasmídeo encontra 
Endonucleases
• Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de 
restrição
• Trabalharam com dois plasmídeos, 
– P1 confere resistência a tetraciclina
– P2 confere resistência a kanamicina
• Experimento
– Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição
– Incube-os com DNA ligase
– Teste a presença de bactérias duplamente 
resistentes no meio
• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro 
organismo recombinante feito propositalmente por 
um ser humano
Herbert Boyer, 1936
P1
P1/2
P2
Ec
o
R
I
Ec
o
R
I
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R
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o
R
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K
K
T
T
Digestão + 
ligação
Cohen & Boyer
• 1973
– Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e 
verificaram que os genes estavam ativos nas 
bactérias depois de várias gerações
– Como as bactérias reproduziam-se rapidamente, 
poderiam ser utilizadas para produzir genes de 
grandes mamíferos em larga-escala
– Constroem um organismo capaz de combinar e 
replicar a informação genética de diferentes 
espécies!
O que, então, era possível fazer?
• Era possível pegar o DNA de 
qualquer espécie, picotá-lo e 
inseri-lo em uma bactéria que o 
amplificaria milhões de vezes
• A era da engenharia e da 
manipulação genética tem 
início...
• Mas o que se pode fazer? Até 
onde podemos chegar?
– Verdade seja dita: ninguém sabe 
ao certo...
Engenharia genética
• Pode-se aumentar a expressão de 
um gene bacteriano
• Pode-se fazer bactérias produzir 
genes de qualquer espécie
– Expressão em levedura, células 
de mamíferos
• Produzir vírus transgênicos, 
produzir vírus contendo toxinas
• Terapia gênica, knockout gênico
• Que medo!?
Discussões éticas
• 1974
– Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda e
se arrependeu) alerta para o perigo da 
biotecnologia e sugere uma moratória
• 1975
– Conferência Asilomar
– Moratória de 16 meses ao DNA recombinante
– Bomba atômica da biologia?
• Watson acha que a natureza já fez muitos 
mais experimentos, por muito mais tempo 
e muitos mais jeitos do que podemos 
imaginar e nada de muito significativo 
aconteceu...
– Se fosse causar algum dano, a natureza 
per se já teria causado...
Joshua Lederberg
• 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima) 
• 1960
Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que 
a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologia
Lederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos
• 1974, Asilomar
Defendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina 
terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala, 
processos de fermentação, produção maciça de antibióticos
• 1978, Genentech
Produção da primeira insulina humana
O DNA recombinante hoje
• Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um 
com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir 
interações entre genes, expressar proteína em larga escala, 
etc)
• DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante 
em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo
• Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda...
– Será que Watson está certo?
Plantas transgênicas
• Genes de resistência a patógenos
– Resistência a inseticidas (Roundup)
– Aumento da produtividade, desequilíbrio 
ecológico
• Aumento nutricional
– Adição de determinado aminoácido torna 
alimentos mais nutritivos
– Banana vacina
• Rotulação!
• Prejuízo ecológico da monocultura
– A maior parte do prejuízo ecológico vem 
da simples monocultura
– A engenharia genética adiciona um nível 
de prejuízo ecológico ligeiramente maior
• É preciso diferenciar a tecnologia de 
transgênicos de seu abuso pela indústria 
do capital
– Produção de insulina, hormônio de 
crescimento, etc.
Clonagem de genes
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Pra quê clonar genes?
• Amplificar milhares de vezes apenas este gene
• Realizar um estudo individual da função de genes
• Identificar mutações que modifiquem a função deles
• Entender a ação enzimática da proteína produzida 
• Verificar com quais outros genes ele interage
• Produzir a proteína em larga-escala
• Montar genomas completos
• Produzir organismos transgênicos de interesse
• Etc etc etc etc
Clonagem de fragmentos de DNA
• Enzimas
– enzimas de restrição
– DNA polimerases
– DNA ligase/Topoisomerases
– Fosfatases• Vetores
– Plasmídios
– Fagos
– Cosmídeos
– BACS/YACS
– Vírus, bacteriófagos
• Hospedeiros
– Escherichia coli
– Levedura
– Células animais
– Células vegetais
Vetor plasmidial
• Origem de replicação
• Gene repórter
• Sítio múltiplo de clonagem
Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo
• Produção da molécula 
de DNA recombinante
• Plasmídeo + DNA 
cortado do organismo 
de interesse
• Ligação das 
extremidades coesivas
DNA Ligase
• Realiza a ligação fosfodiéster
• E agora, quem dirá de qual organismo é esta molécula?
Ensaio de digestão e subclonagem
Kb
1 2 PM
0,5
1,0
2,0
Clivagem do inserto clonado 
no vetor com enzima de restrição
- + EcoRI
Clonagem de fragmentos de DNA
INSERTO: Fragmento de DNA
VETOR ou veículo de clonagem:
-plasmídeo
-bacteriófago
-cosmídeo
-cromossomo artificial de bactéria (BAC)
-cromossomo artificial de levedura (YAC)
Ligação enzimática: Ligase de DNA
Amplificação do clone em bactérias
inserto
fragmento de DNA 
ligado ao vetor
bactéria 
transformada
introduzir nas células: 
transformação e seleção
construção
Objetivo:
Obter muitas 
Cópias do gene 
pretendido
Transformação
• Inserção do 
plasmídeo 
em bactérias
• Replicação bacteriana
• Produção em massa 
da proteína 
recombinante!
Métodos de 
transformação bacteriana
A transformação natural descrita por Griffiths, em 
1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um 
evento raro.
Permeabilização com CaCl2
-- Choque térmico
Eletroporação
-- Choque elétrico
Gene gun
-- Bombardeamento
• Plasmídeos pequenos são mais facilmente 
incorporados pela célula bacteriana 
competente.
• DNA linear é pobremente incorporado, talvez 
pelo fato de sofrer degradação pelas 
enxonucleases presentes no espaço 
periplasmático.
Seleção de clones
Será que 
entrei?
• Bactérias são colocadas em meio nutritivo
com antibiótico para que cresçam e 
amplifiquem nosso DNA do inserto
• Gene repórter
– Reporta se a 
transformação 
aconteceu
– Bactérias não-
transformadas
não sobrevivem
– Gene de resistência
a algum antibiótico
Seleção de recombinantes
Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem 
que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor 
fechado é preciso um novo teste de gene repórter.
Keywords
• Conceitos-chave para a tecnologia do DNA 
recombinante:
– Vetor
• Sítio múltiplo de clonagem
• Genes repórteres
– Inserto
– Endonucleases de restrição sítio-específicas
– Digestão, ligação, clonagem
http://www.youtube.com/watch?v=acK
WdNj936o&feature=related
Material Suplementar
• Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas aqui para a 
realização do trabalho de fim de curso: 
http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/
• http://www.nature.com/milestones/miledna/timeline.html
• http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnology
• http://www.nature.com/scitable/topicpage/Recombinant-
DNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513
• http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-
Enzymes-545