6 eletroforese gel rot prof

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Programa de pesquisas aplicadas sobre a melhoria do ensino público no Estado de São Paulo - FAPESP 
Parceria USP-São Carlos e EESOR 
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AAttiivviiddaaddeess ddee aappooiioo eemm 
BBiioollooggiiaa CCeelluullaarr ee MMoolleeccuullaarr 
Aluno: _________________________________________ nº ______ série:_________ 
 
 
Técnicas de manipulação de DNA: “Tesouras de DNA” e “Eletroforese em gel” 
 
 
PARTE A: TESOURAS DE DNA 
 
As enzimas de restrição são proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou 
restringir a invasão de um DNA estranho, cortando o DNA invasor em diversos fragmentos 
sem função. 
 Elas reconhecem e cortam locais específicos da molécula de DNA (chamados de sítios 
de restrição). O sítio é geralmente formado por uma seqüência de 4 a 8 pares de bases 
nitrogenadas, chamados palíndromo (iguais em sentidos opostos). 
Em biotecnologia, elas podem ser usadas para cortar (digerir) um DNA de interesse. 
 
Por exemplo, a seqüência a seguir corresponde ao sítio de restrição da enzima EcoRI. 
 
5’ GAATTC 3 
3’ CTTAAG 5’ 
 
Esta enzima reconhece estes 6 pares de bases e corta a fita dupla do DNA entre as bases 
G e A. Veja o esquema abaixo: 
 ↓↓↓↓ 
 Sítios de clivagem: 5’ ...G AATTC... 3’ 
 3’…CTTAA G... 5’ 
 ↑↑↑↑ 
 Após a clivagem, o DNA separa-se em pedaços cujas extremidades são: 
 
5’ …G AATTC… 3’ 
3’ …CTTAA G... 5’ 
 
 
Exemplos de sítios de restrição de algumas enzimas: 
 
 ↓↓↓↓ ↓↓↓↓ 
HindIII: 5’ AAGCTT 3’’ BamHI: 5’ GGATCC 3’ 
 3’ TTCGAA 5 3’ CCTAGG 5’ 
 ↑↑↑↑ ↑↑↑↑ 
 
 ↓↓↓↓ ↓↓↓↓ 
SmaI: 5’ CCCGGG 3’ DraI: 5’ TTTAAA 3’ 
 3’ GGGCCC 5’ 3’ AAATTT 5’ 
 ↑↑↑↑ ↑↑↑↑ 
Simulação 1 
 
 
 
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Os esquemas do anexo 1 representam duas moléculas de DNA dupla fita. As linhas 
verticais entre os pares de base representam as pontes de hidrogênio. 
1. Vamos simular a atividade da enzima EcoRI. Procure ao longo da seqüência da fita 
de DNA (tira 1) o sítio de restrição da EcoRI. Simule cortes usando o lápis para fazer o 
contorno do referido corte, exatamente entre as bases G e A do sítio de restrição em ambas as 
fitas. Agora, recorte o DNA, separando os pedaços cortados pela enzima de restrição. 
2. Repita o procedimento com a tira 2, desta vez simulando a atividade da DraI. 
 
 
PARTE B: ELETROFORESE EM GEL 
 
Simulação 2 
 
Nos esquemas do anexo 2 (próxima página) observam-se duas representações de uma 
molécula de DNA de 15.000 pares de bases. Cada representação mostra a localização dos 
sítios de restrição de duas enzimas: a EcoRI e a DraI. As linhas verticais representam os sítios 
de clivagem. Os números entre os sítios de clivagem correspondem ao tamanho (em pares de 
bases) dos fragmentos gerados pela digestão do DNA com a referida enzima. 
 
Com uma tesoura, corte nos locais dos sítios de clivagem. Você deve ter percebido que 
os pedaços de DNA originados a partir da digestão com estas enzimas têm tamanhos (em 
pares de bases) diferentes. 
 
Para separar estes “pedaços” você poderia utilizar a técnica de eletroforese em gel, já 
explicada na aula introdutória. Para isso, vamos utilizar o Esquema do gel de eletroforese, 
na próxima página. Tente construir o perfil que suas digestões mostrariam no gel. Como você 
já sabe o tamanho dos pedaços originados com a digestão das duas enzimas utilizadas (EcoRI 
e DraI), indique-os no Esquema do gel de eletroforese, pintando com um lápis e tendo como 
referência a escala de tamanho. Compare os dois perfis. O que você observa? 
 
 
Anexo 1 
Tira 1 
 
5’ – T A G A C T G A A T T C A A G T C A – 3’ 
 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 
3’ – A T C T G A C T T A A G T T C A G T – 5’ 
 
Tira 2 
 
5’ – A T A T G G C T C T T T A A A G G A – 3’ 
 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 
3’ – T A T A C C G A G A A A T T T C C T – 5’ 
 
 
 
 
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Esquema do gel de eletroforese 
 
 EcoRI DraI 
 Poços de amostras → 
Escala de 
tamanho 
em pares 
de bases 
 
8.000  
 
 
 
6.000  
 
 
 
 
 
4.000  
 
 
 
3.000  
 
 
 
 
 
2.000  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anexo 2 
Sítios de clivagem da enzima EcoRI 
 
 
4.000 3.500 2.500 5.000 
 
 
Sítios de clivagem da enzima DraI 
 
 
1000 8000 6000 
 
 
 
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PLANO DE AULA - ROTEIRO PARA O PROFESSOR 
 
Eletroforese em gel: migração de fragmentos de DNA 
 
 
 
Introdução 
 
Nas últimas quatro décadas, nosso conhecimento sobre a estrutura e função do DNA e 
sobre os processos bioquímicos que as células utilizam para modificar essa estrutura e 
cumprir suas funções tem crescido consideravelmente. Esse vasto conhecimento nos permitiu 
a manipulação do DNA fora do ambiente celular. Por exemplo, podemos clivar o DNA em 
fragmentos específicos, separar e isolar esses fragmentos, uni-los novamente, copiar o DNA e 
determinar sua seqüência de bases. Estamos fazendo uso de nossa experiência em 
manipulação de genes para aprofundarmos ainda mais nossos conhecimentos sobre como os 
processos básicos da vida são executados e como podemos fazer uso destes produtos em 
nosso cotidiano. 
Nas próximas aulas, usaremos modelos e simulações para aprender as técnicas 
utilizadas pelos cientistas para analisar o DNA e produzir moléculas recombinantes: digestão 
por restrição, eletroforese em gel etc. 
A eletroforese em gel pode ser utilizada para se fazer mapas de restrição, que é um 
diagrama de uma molécula de DNA mostrando as posições relativas dos sítios de clivagem 
das várias enzimas. O mapa pode ser feito clivando o DNA com duas ou mais enzimas de 
restrição, individualmente e em mistura. Depois, comparam-se suas migrações eletroforéticas, 
possibilitando assim a construção de mapas de restrição. 
Uma outra aplicação bastante conhecida é na identificação de pessoas: em testes de 
paternidade, identificação de criminosos etc. O DNA das pessoas, depois de tratado (por 
clivagem), pode ser separado pela eletroforese, e comparado com outros DNAs, como o do 
suposto filho ou pai, DNA recolhido na cena de um crime etc. Como a informação genética 
contida em cada DNA é única para qualquer indivíduo, se as amostras de DNA apresentarem 
idêntico padrão eletroforético significa que são da mesma pessoa. 
 
Pré-requisitos 
 
Para estas atividades é necessário que o aluno conheça a composição do material 
genético, principais funções e estruturas. 
 
Duração 
 
Aproximadamente 100 minutos. 
 
Público alvo 
 
Segundo e terceiro anodo ensino médio. 
 
 
 
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Eletroforese em gel: migração de fragmentos de DNA - procedimentos 
 
 
Coloca-se o DNA e a enzima de restrição em um pequeno tubo e deixa a enzima agir. 
Como não é possível usar corantes químicos para se verificar a digestão, utiliza-se o processo 
chamado eletroforese em gel, a fim de que se possa visualizar os fragmentos de DNA. 
 Os grupos fosfato do DNA são carregados negativamente. Assim, quando as 
moléculas são colocadas em um campo elétrico, elas migram para o pólo positivo, pois 
possuem cargas opostas. 
 Para que esta migração ocorra, é necessário um gel de agarose. Dissolve-se o pó de 
agarose em água fervente, colocando-o em um suporte adequado e, depois de resfriado, 
endurece, como se fosse uma gelatina. Durante este processo, um pente é colocado no gel 
ainda líquido para, após o endurecimento, formem-se “buracos” no gel, onde serão aplicadas 
as amostras. Estes buracos são chamados de poços de amostra (fig. 1). 
 
 
Fig. 1. Fazendo um gel de agarose. (A) Para fazer um gel, a solução de agarose quente é vertida em uma 
bandeja e o pente é colocado no lugar adequado. (B) Depois que a agarose esfria e endurece, o pente é removido, 
deixando marcas no gel, chamadas de poços de amostra. Amostras são aplicadas nos poços antes da eletroforese. 
 
 Na eletroforese, o gel solidificado é colocado em uma cuba com uma solução salina 
(tampão). Quando a corrente é aplicada, entre as extremidades da cuba, as moléculas de DNA 
começam a migrar (fig. 2). 
 
Fig. 2. Na eletroforese, o gel é colocado em uma cuba com solução salina e uma corrente elétrica é 
aplicada. O DNA migra para o pólo positivo. 
 
 
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 Em um mesmo intervalo de tempo, moléculas maiores de DNA migram-se com mais 
dificuldade do que as menores. Desta forma, moléculas menores “correm” mais rápido do que 
as maiores (fig. 3) . 
 
Fig. 3. Em corridas de eletroforese, o DNA menor sempre ganha! 
 
Após um certo tempo, desliga-se a corrente elétrica e coloca-se o gel em uma solução 
corante de DNA, então ele pode ser observado sob a forma de faixas (bandas). Cada banda é 
composta por um tamanho de moléculas de DNA. 
 Por fim, utiliza-se radiação ultravioleta para se observar às bandas de DNA. 
 Moléculas coradas com brometo de etídio, na presença de UV, brilham. Obs.: o 
brometo de etídio é carcinogênico. Use luvas quando manipular a solução. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referência bibliográfica: 
KREUZER, H.; MASSEY, A. Engenharia Genética e Biotecnologia. 2a. ed, Porto Alegre: ArtMed, 2002.