RELATÓRIO DE PP1 MICRO (1)

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Curso: Técnico em Química 
Disciplina: Práticas Profissionais I 
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA
Nome dos alunos: Gabriele Barboza dos Santos/ Andresa Veiga Campos/ Gabriela Espírito Santo
Turma: Módulo III – 2018/1
Turno: Tarde
Nome do Professor (a): Cíntia Neves Barreto Carneiro 
Local: Laboratório de Microbiologia
Data da Experiência: 22/05/18; 05/06/18; 12/06/18; 
SUMÁRIO
TÍTULO DA EXPERIÊNCIA________________________________ 2
OBJETIVOS ____________________________________________ 2
FUNDAMENTOS TEÓRICOS_______________________________ 2
MATERIAIS, VIDRARIAS E UTENSÍLIOS______________________ 3
EQUIPAMENTOS_________________________________________ 4
REAGENTES USADOS____________________________________ 4
MEIOS DE CULTIVO_______________________________________ 4
AMOSTRAS______________________________________________ 5
PROCEDIMENTOS________________________________________ 5
REAÇÕES_______________________________________________ 6
CÁLCULOS E/OU RESULTADOS_____________________________ 7
CONCLUSÕES____________________________________________ 7
ESQUEMAS______________________________________________ 8
ATIVIDADES DEVERIFICAÇÃO_______________________________8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_____________________________
ANEXOS__________________________________________________
ASSINATURA DOS AUTORES DO RELATÓRIO___________________
TÍTULO DA EXPERIÊNCIA
Análise bacteriológica da água.
OBJETIVOS
Conceito de Unidade Formadora de Colônia (UFC);
Metodologia das diluições seriadas para amostras de alimentos;
Metodologia de contagem em placas para a determinação da concentração de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos mesófilos em alimentos;
Pesquisar e quantificar coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli em água;
Contribuir para a avaliação da qualidade microbiológica de uma amostra de água;
Praticar a técnica de quantificação por fermentação em tubos múltiplos e cálculo do número mais provável (NIMP);
Identificar características morfológicas de colônias de bactérias do grupo coliforme desenvolvidas em agar eosina azul de metileno EMB;
Identificar a bactéria do grupo coliforme pesquisada através de provas bioquímicas;
Comprovar a presença de enzimas que diferenciam a E. coli das demais Enterobactérias.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Determinação do número de células viáveis pela contagem de colônias em placas
	
 A contagem de bactérias heterotróficas, também conhecida como contagem padrão de placas, é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água, particularmente como uma ferramenta para acompanhar
variações nas condições de processo, no caso de águas minerais, águas de piscinas ou eficiência das diversas etapas de tratamento, no caso de águas tratadas. Permite ainda verificar as condições de higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. (Silva et al., 2005).
 O método de contagem em placas é uma técnica geral de enumeração de microrganismos, que pode ser utilizado tanto para a contagem de heterotróficos como microrganismos, como também para a contagem de outros grupos, gêneros ou espécies, como Enterococcus, Pseudomonas, coliformes totais ou fecais. E. coli e outros. Essa versatilidade é decorrente do princípio do método, que se baseia na premissa de que cada célula ou pequenos agrupamentos de células presentes em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura solidificado adequado, uma colônia visível. O que determina a
seleção do grupo a ser contado é a seleção dos meios de cultura (meios de
enriquecimento, meios seletivos, meios diferenciais) e condições de inoculação
(temperatura e atmosfera), selecionando o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar. Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares,tétrades, cachos, cadeias, etc.), não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células. A relação correta é feita entre o número de colônias o número de “unidades formadoras de colônia” (UFC), que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos.
Há três procedimentos básicos para a contagem de microrganismos em placas:
Plaqueamento em profundidade (“pour plate”) – permite a inoculação de até 2mL da amostra ou suas diluições, indicado para a análise de amostras com contagens acima de 100 UFC/mL, por que a inoculação de diluições permite abranger uma faixa ampla de variação. Limite de detecção= 1 UFC/mL.
Plaqueamento em superfície (“spread plate”) – limita o volume inoculado a 0,1mL da amostra ou sem diluições, mas permite uma melhor visualização das características das colônias na superfície, além de facilitar a transferência para outros meios de cultura. Limite de detecção= 10 UFC/mL.
Filtração em membrana – permite analisar maiores volumes, concentrado os microrganismos presentes no volume inoculado, indicado para amostras com contagens abaixo de 1 UFC/mL.
Os meios mais utilizados para contagem de heterotróficos são:
Agar para contagem de microrganismos ou agra padrão para contagem de microrganismos (APC) – também chamado de agar triptona glicose extrato de levedura (TGE) – utilizado para o plaqueamento em superfície e em profundidade. Amplamente utilizado.
Agar R2A – utilizado para os três métodos, é um meio de menor valor nutritivo em comparação com o APC, mas apresenta uma taxa de recuperação melhor do que o APC, resultando em maiores contagens. 
 Para a contagem de bactérias heterotróficas nas amostras de água, será utilizada a técnica de contagem por plaqueamento em profundidade. Nessa técnica, uma quantidade conhecida de inóculo é colocada numa placa de Petri, seguindo-se adição de Ágar Padrão para Contagens fundido, que é misturado com o inóculo através de movimentos rotatórios. A solidificação do meio fixa os microrganismos no gel. 
 A amostra original é diluída várias vezes para que o número de colônias presentes na placa fique compreendido entre 30 e 300. Dentro desses limites a contagem pode ser precisa e a possibilidade de interferência do crescimento de um microrganismo com o de outro é mínima. As colônias são contadas contra um fundo escuro ou sobre uma tela iluminada com uma grande lente de aumento, num aparelho chamado contador de colônias. 
Método de determinação do número mais provável (NMP) de coliformes totais, ermotolerantes e Escherichia coli em amostras de corpos d’água ou de efluentes, pela técnica dos tubos múltiplos
Técnica do Número Mais Provável (NMP)
 A determinação do NMP de coliformes em uma dada amostra é efetuada a partir de aplicação da técnica de tubos multipolos. Esta técnica é baseada no princípio de que as bactérias presentes em uma amostra podem ser separadas umas das outras por agitação, resultando m uma suspensão de células bacterianas individuais, uniformemente distribuídas na amostra original e consiste na inoculação de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma série de tubos.
 A técnica do NMP é uma forma de se estimar o número de microrganismos presentes na amostra. É baseada na probabilidade estatística de certo número de microrganismos estarem presentes na amostra quando ocorre uma série de resultados positivos.
 Esta estimativa é obtida pelo preparo de diluições decimais sucessivas decrescentes da amostra e a transferência de alíquotas destas diluições para uma série de três ou cinco tubos contendo meio de cultura adequado.
 No caso da análise de coliformes, o resultado positivo é evidenciado pela presença de gás no interior do tubo inverto do (tubo de Durhan), contido no interior do tubo com meio de cultura.
 O método do NMP é, portanto, uma forma indireta de medida, em contraste com a técnica de plaqueamento que pode ser considerada como um método direto.
Definições
Para efeito deste método são adotadas as seguintes definições:BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME - termo habitual "coliforme" compreende a bactéria Escherichia coli e diversas espécies pertencentes a outros gêneros da família Enterobacteriaceae. Praticamente falando, os "coliformes" são os microrganismos que se detectam pelas “provas para coliformes”. Este grupo de bactérias apresenta as seguintes características em comum: são bactérias na forma de bastonete, Gram-negativas; não esporuladas, que fermentam a lactose com produção de gás em 48h a 35°C.
BACİLOS - Designação dada a certas bactérias que se apresentam sob a forma de bastonetes.
COLORACAO DE GRAM – coloração diferencial através da qual as bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, dependendo da retenção ou não do corante cristal violeta.
ESPOROS - Corpúsculos esféricos ou ovoides que se formam em certas bactérias mais resistentes aos efeitos do calor, dessecação, congelamento, drogas deletérias e radiações do que as próprias células que os formam. 
COLIFORMES TOTAİS (GRUPO COLIFORME) -Bacilos Gram-negativos não
formadores de esporos, aeróbicos ou anaeróbicos facultativos, que fermentam a lactose com produção de gás e ácido dentro de 48 horas a 35 (±0,5)°C. Neste grupo estão incluídos 4 (quatro) gêneros da família Enterobacteriaceae:
Citrobacter,Enterobacter, Escherichia, Klebsiella. 
COLIFORMES FECAIS (COLIFORMES TERMOTOLERANTES) - Coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de gás e ácido em 24 horas a 44,5 (±0,2) °C. O principal componente desse grupo é a Escherichia coli.
NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - Estimativa da densidade de bactérias em uma amostra, calculada a partir da combinação de resultados positivos e negativos, obtidos mediante a técnica dos tubos múltiplos.
CALDO LACTOSADO (CL) e CALDC LAURIL SULTADO TRİPTOSE (CLS) - Meio de enriquecimento no qual as concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o crescimento de bactérias do grupo coliforme
CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE BILE (C.L.V.B.B) - Meio seletivo em que se obtém a inibição de bactérias Gram-positivas e de esporulados fermentadores de lactose, permitindo desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme.
MEIO DE ENSAIO CONFIRMATÓRİO (MEIO DE E.C) - Meio seletivo para detecção de coliformes fecais (termotolerantes), em que os sais biliares inibem o crescimento de formas esporuladas e de bactérias Gram-positivas. A incubação a 44,5 (±0,2) °C impede o desenvolvimento de coliformes que não são de origem fecal.
Aplicabilidade
 Este método se aplica a amostras de corpos d'água e de efluentes líquidos acondicionadas e preservadas de acordo, com o MN-707.
Interferências
 Cloro residual e metais pesados, se presentes na amostra, podem levar a resultados falsos. Cloro residual deve ser neutralizado e os metais pesados quelados no momento da coleta.
A temperatura da amostra e o tempo decorrido entre a coleta e a análise também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve ser mantida entre 4 e 10°C; até o início da análise, que deverá ocorrer, preferencialmente, dentro de 8 horas para águas não cloradas e 24 horas para águas cloradas.
Resumo da técnica
 A determinação do NMP de coliformes lotas pela técnica dos tubos múltiplos
ensaios: presuntivo e confirmatório. Em casos especiais pode ser acrescentado o ensaio completo.
ENSAIO PRESUNTIVO - Consiste na semeadura de volumes determinados de
amostra de água em série de 5 tubos de C.L ou C.L.T que são incubados a 37 (±0,5)°C durante 24 ou 48 horas, ocorrendo enriquecimento de organismos fermentadores da lactose, se prova presuntiva positiva para a presença de bactérias do grupo coliformes.
ENSAIO CONFIRMATÓRIO - Consiste na inoculação, em tubos de C.L.V.B.B, para coliformes totais, ou em tubos de Meio de E.C., para coliformes fecais, de porções das amostras que apresentaram resultado positivo no ensaio presuntivo.
ENSAIO COMPLETO - Consiste em isolar colônias de coliformes a partir de culturas de caldo E.C. e Caldo V.B. em meios de cultivo seletivos para coliformes como agar eosina azul de metileno (agar EMB), agar Mackonkey, agar Endo.
 MEIOS DE CULTURA - Poderão ser utilizados os meios de cultura prontos, encontrados no comércio sob a forma de pó desidratado, ou então preparados no laboratório, a partir dos ingredientes-básicos que devem ser de alta pureza.
Ensaio Completo – Identificação Morfológica e bioquímica das bactérias do grupo coliforme.
 Embora seja possível uma identificação preliminar das enterobactérias, baseada nas características das colônias e nas reações bioquímicas ocorridas no meio de isolamento pode-se dispor de uma variedade de provas diferenciais e de numerosos esquemas de identificação final de espécies de enterobactérias. Não é possível aqui discutir todas as provas. Entretanto iremos destacar algumas provas bioquímicas muito empregadas na identificação das enterobactérias.
MATERIAS, VIDRARIAS E UTENSÍLIOS 
- 5 micropipetas de 100 μl;
- 2 micropipetas de 1000 μl;
- 2 micropipetas de 10 μl;
- Fita para autoclavagem;
- Barbante;
- Fósforo;
- Papel Kraft;
- Papel de filtro;
- 6 estantes de madeira para tubos de ensaio;
- 5 estantes de metal para tubos de ensaio;
- 7 Becker de alumínio de 1L para descarte;
- 5 Becker de polietileno;
- 11 espátulas metálicas do tipo caneleta;
- 5 Becker de vidro de 100mL;
- 5 bastões de plástico;
- 5 dispensadores de 10mL;
- 6 frascos de reagentes de 500mL;
- 22 placas de Petri;
- Tesoura;
- Caneta;
- 6 telas de amianto;
- 6 Tripés;
- Bico de Bunsen;
- 8 pipeta graduada de 10mL;
- Ponteiras de 10mL;
- Ponteiras de 100μl;
- Ponteiras de 1000μl;
- Ponteiras de 10μl;
- 16 tampas metálicas para tubos;
- 2 lâminas;
- 1 alça de nichrome;
- 1 estante de madeira para lâminas;
- 6 Becker de vidro de 500mL;
- 6 Becker de vidro de 100mL;
- 64 tubos de ensaio 160x50;
- 74 tubos de Durhan;
- 64 tampas rosqueáveis para tubos de ensaio;
- 5 macropipetadores;
- 1 proveta de 100mL;
- 8 tubos de ensaio de 9mL;
- 1 proveta de 500mL;
- 2 cartelas quanti – Tray 97 poços;
- 1 molde quanti – Tray 97 poços;
- Lâmpada ultravioleta de 365 nm;
- Etiqueta adesiva;
- Pipeta Pasteur;
- Papel absorvente;
- 2 mangueiras de silicone;
- 1 Kitassato;
- 1 pinça metálica;
- 3 bastões de vidro;
- 3 dispensadores;
- 1 Sistema de filtração Millipore;
EQUIPAMENTOS
- Balança semi-analítica digital – 220V;
- Bomba á vácuo – 220V;
- Capela de fluxo laminar – 220V;
- Seladora Quanti – Tray – 220V;
- Estufa bacteriológica – 
- Autoclave vertical – 
- Geladeira Consul – 110V;
- Lâmpada ultravioleta de 365nm;
REAGENTES USADOS 
- Solução de Azul de bromotimol
- Cloreto de sódio P.A – NaCl
- Cloreto 2,3,5 trifeniltetrazólio – Val: DEZ/ 2014; FAB: DEZ/2009;
- Solução de vermelho de metila
- Paradimetilaminobenzaldeído
- Solução salina 0,5%m/v
MEIOS DE CULTIVO 
Agar para contagem de microrganismos (APC)
Triptona 5,0
Extrato de levedura 2,5
Glicose 1,0
Agar 9,0 (solidificar o meio)
pH 7,0
Caldo de laurel sulfato/triptose (CLST)
Triptose 20,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Lactose 5,0 (fonte de carbono e energia)
Fosfato dipotássio 2,75 (tamponar o meio)
Fosfato monopotássio 2,75 (tamponar o meio)
Cloreto de sódio 5,0 (regular a pressão osmótica)
Lauril sulfato de sódio (agente seletivo)
pH 6,8
Caldo Lactosado
Peptona bacteriológica 5,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Extrato de carne bovina 3,0 
Lactose 5,0 (fonte de carbono e energia)
pH 6,9
Caldo EC
Peptona de caseína 20,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Lactose 5,0 (fonte de carbono e energia)
Bile bovina 1,5 (agente seletivo)
Cloreto de sódio 5,0(regular a pressão osmótica)
Fosfato de potássio dibásico 4,0 (tamponar o meio)
Fosfato de potássio monobásico 1,5 (tamponar o meio)
pH 6,9
Caldo Verde Brilhante (CVB)
Bile bovina desidratada 20,0 (agente seletivo)
Verde brilhante 0,0133 (matar os fungos)
Lactose 10,0 (fonte de carbono e energia)
Peptona de carne 10,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
pH 7,2
Agar eosina azul de metileno (EMB)
Peptona de carne 10,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Lactose 5,0 (fonte de carbono e energia)
Sacarose 5,0 (fonte de carbono e energia)
Fosfato monoácido de potássio 2,0 (fornece fosforo)
Eosina y amarela 0,4 (indicador de pH)
Azul de metileno 0,065 (agente seletivo)
Agar 15,0 (solidificar o meio)
pH 7,1
Meio de cultivo SIM
Peptona de caseína 20,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos) 
Peptona de carne 6,6 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Citrato de ferro II amoniacal 0,2
Tiossulfato de sódio 0,2
Agar 3,0 (solidificar o meio)
pH 7,3
Meio de cultivo Citrato de Simmons (CS)
Hidrogenofosfato de amônio 1,0
Hidrogenofosfato de potássio 1,0
Cloreto de sódio 5,00 (regular a pressão osmótica)
Citrato de sódio 2,0
Sulfato de magnésio 0,2
Azul de bromotimol 0,08 (indicador de pH)
Agar 12,0 (solidificar o meio)
pH 6,9 
Meio de cultivo vermelho de metila e Voges Proskauer (VM-VP)
Peptona 7,0 (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Dextrose 5,0
Fosfato deipotássio 5,0
pH 6,9
Triple Sugar Iron Agar
Hidrolisado pancreático de caseína 10,0g
Glucose 1,0g
Hidrolisado péptico de tecido animal 10,0
Sulfato de amónio ferroso 0,2
Cloreto de sódio 5,00 (regular a pressão osmótica)
Tiossulfato de sódio 0,2
Lactose 10,0 (fonte de carbono e energia)
Vermelho de fenol 0,025
Sacarose 10,0 (fonte de carbono e energia)
Agar 13,0 (solidificar o meio)
pH 7,3 ≠ 0,2
Agar m-Enterococcus acrescido de cloreto 2,3,5-trifeniltretazólio
Digestão Enzimática de Caseína 15g
Digestão Enzimática de Farelo de Soja 5g
Extrato de Levedura 5g
Dextrose 2g
Fosfato Dipotássio 4g
Azida de sódio 0,4g
2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio 0,1g
Agar 10g (solidificar o meio)
pH 7,3 ≠ 0,2 a 25 ºC
Agar m-Endo Les
Lactose 9,4g (fonte de carbono e energia)
Triptose 7,5g (fonte de nitrogênio e aminoácidos)
Digestão Enzimática de Caseína 3,7g
Digestão Enzimática de Tecido Animal 3,7g
Cloreto de sódio 3,7g0 (regular a pressão osmótica)
Fosfato de potássio, dibásico 3,3g
Sulfito de sódio 1,6g
Extrato de Levedura 1,2g
Fosfato de potássio, monobásico 1,0g
Fucsina Básica 0,8g
Desoxicolato de sódio 0,1g
Lauril sulfato de sódio 0,05
Agar 15g (solidificar o meio)
pH 7,3 ≠ 0,2 a 25 ºC
Acrescido de: Etanol não desnaturado 20mL para cada 980mL de meio
Meio de cultivo Colilert
AMOSTRAS
Água de piscina, coletada no dia 22/05/18 as 10h
Água mineral, marca: Itabira, coletada no dia 22/05/18 as 12h
Água Tratada, coletada no dia 22/05/18 as 12h
Água de poço 1, coletada no dia 05/06/18 as 09h
Água de poço 2, coletada no dia 05/06/18 as 10h
Água de poço 3, coletada no dia 12/06/18 as 10h
Água do mar, local: Grussaí, coletada no dia 10/06/18 as 17h
PROCEDIMENTOS
CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS HETEROTRÓFICOS AERÓBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIÁVEIS EM PLACAS
Preparação da amostra 
Homogeneizar a amostra antes da retirada de unidade analítica, invertendo a embalagem 25 vezes. O intervalo entre a mistura da amostra e a retirada de unidade analítica não deve ultrapassar 5 minutos.
Diluição seriada da amostra
 Transferir assepticamente uma porção de 1 mL da amostra para 9 mL de água de diluição (solução de cloreto de sódio 0,5% m/v ou tampão fosfato com cloreto de magnésio). As diluições subsequentes são obtidas de maneira similar transferindo-se 1,0 mL da diluição anterior de 9 mL de diluente.
 Obs: O número de diluições requeridas dependerá do nível de contaminação esperada, de forma a resultar em placas com 30 a 300 colônias.
 Obs: Na transferência de volumes entre as diluições, usar sempre uma pipeta diferente para cada solução.
 Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar vigorosamente o tubo, invertendo 25 vezes ou sugar e liberar o líquido no tubo de ensaio com a própria pipeta, por 5 vezes.
 Obs: Não flambar pontas de pipeta, ponteiras e nem soprar a gota que fica no final.
Inoculação
 Distribuir 1,0 mL das amostras e de cada diluição em placas de Petri separadas, estéreis e vazia, abrindo as placas apenas o suficiente para referir a pipeta, próximo ao bico de Bunsen. Depositar o inóculo fora do centro da placa, pois facilita a posterior mistura com o meio de cultura.
Adição do meio de cultura
 Verter nas placas inoculadas,15 mL a 20 mL do meio de cultura previamente fundido e resfriado 50-55°C. Misturar o inóculo com meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimento em forma de oito (4 vezes). A mistura do meio de cultura inóculo deverá ocorrer imediatamente após a adição do meio.
 Obs: e os meios foram esfriado submetendo frasco lavagem externa em água corrente, o mesmo deverá ser enxuto para não respingar água de resfriamento nas placas.
 Incubação 
 Aguardar a completa solidificação do meio de cultura, inverter as placas incubar a 35 mais ou menos 0,5°C por 48 horas.
 Obs: Recomenda-se que a contagem padrão em placas seja efetuada com utilização de placas em duplicadas, nas várias diluições.
MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) DE CLIFORMES TOTAIS, TERMOTOLERANTES E Escherichia coli EM AMOSTRAS DE CORPOS D’ÁGUA OU DE EFLUENTES, PELA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS
Ensaios
Ensaio Presuntivo
A - Preparação dos meios de cultivo
 Preparar 60 mL de C.L. ou C.L.T. de concentração dupla e distribuir por 5 tubos de ensaio de 18 x 180 mm contendo tubos de Durhan. Colocar tampas de alumínio nos tubos, agrupá-los, envolvendo-os em papel Kraft e autoclave-los.
Preparar 110 mL de C.L. ou C L.T. de concentração simples e distribuir:
9,0 mL por 5 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan;
9,9 mL por mais 5 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
 Agrupar os tubos de acordo com o volume que contêm, procedendo conforme o descrito para os tubos de C.L. de concentração dupla.
 B – Inoculação dos meios preparados 
 Homogeneizar a amostra de água através de movimento circular do frasco por no mínimo 25 vezes. 
Dispondo de pipetas estéreis ou micropipetas com ponteiras estéreis de 10-1/10mL, transferir assepticamente para cada um dos 5 tubos de C.L. de concentração dupla,10 ml de água a analisar.
 Os tubos que contêm 9 mL de meio, deverão receber 1 mL de água e os que contêm 9,9 mL de meio receberão 0,1 mL de água.
5 tubos de 10 mL de C.L. conc. Dupla) 10 mL de água
5 tubos com 9,0 mL de C.L. (simples) 1 mL de água
5 tubos com 9,9 mL de C.L. (simples) 0,1 mL de água
 Incubar em estufa bacteriológica previamente regulada para 37°C, por 48 h, observando a cada 24 h para verificar se há produção de gás. 
Cuidados:
Verifique se todos os tubos de ensaio estão com tubos de Durhan;
Certifique-se que os tubos de Durhan estão com a boca voltada para baixo;
Os tubos de 10 mL devem estar acondicionados em tubos de ensaio de 18x180 mm.
Analisando os tubos de caldo do ENSAIO PRESUNTIVO:Produção de gás: conte o número de tubos com gás, sempre começando pelos tubos que você colocou maior volume de amostra e terminando pelos que você colocou menor volume de amostra;
Aparecimento de coloração no meio: verifique se houve aparecimento de coloração que não é característica do próprio meio. Caso positivo anote qual é a cor, em que local do tubo ela se concentra e tente isolar o microrganismo em Agar APC utilizando a técnica de esgotamento do inoculo;
Formação de película: verifique se houve formação de película nos tubos de ensaio
Anote este dado;
Anotar na tabela as informações obtidas através de tubos do teste presuntivo.
Ensaio confirmatório 
A – Preparação dos meios
 Preparar os meios líquidos (C.L.V.B.B. e E.C.), distribuindo em tubos de ensaio contendo tubos do Durhan. Autoclavar. O volume de meio em cada tubo é de cerca de 5 a 8 mL (tem que ser suficiente para cobrir completamente o tubo de Durhan, não esquecendo que após a esterilização, o meio de cultive preenche o tubo de Durhan, o que faz com que o nível diminua).
 A quantidade de tubos preparados para cada meio, dependerá do número de tubos com gás do teste presuntivo.
B - Inoculação dos meios preparados
 Todos os tubos positivos nas leituras de 48 (± 3) horas do ensaio são
submetidos a confirmação. Marcar os tubos de C.L.V.B.B e os do meio de E.C em número igual ao dos tubos de ensaio presuntivo que apresentaram resultado positivo.
 Agitar cada tubo com resultado positivo e, com alça de inoculação retirar assepticamente o material e inocular nos tubos correspondentes de C.L.V.B.B e E.C evitando a película superficial que se forma no ensaio presuntivo positivo
 Incubar os tubos de C.L.V.B.B inoculados durante 48 (±3) horas a 37 (±0,5)°C considerando positivos os tubos que, após esse período, apresentarem formação de gás no tubo de Durhan invertido. Anotar o resultado na ficha de registro de exames.
 Incubar os tubos de caldo E.C inoculados durante 24 (±2) horas a 44,5(±0,2)°C, em banho-maria, no prazo máximo de 30 minutos após a inoculação. Decorridas 24 h, proceder a leitura e considerar positivos os tubos que apresentaram formação de gás no interior do tubo de Durhan. Anotar o resultado na ficha de registro de exames.
ENSAIO COMPLETO – IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DAS BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME
Obtenção de colônias isoladas de bactérias do grupo coliforme:
 Inocular o meio de cultivo agar eosina azul de metileno (Agar EMB) usando a técnica do esgotamento do inóculo a partir de um tubo de caldo EC que apresentou gás (se possível o tubo correspondente ao menor volume de amostra)
 Repetir o mesmo procedimento utilizando um tubo de caldo verde brilhante que apresentou gás. Incubar as placas a 37°C por 46 h e observar a morfologia das colônias e anotar na tabela.
Preparo de lâmina para observação microscópica:
 Realize esfregaço de uma colónia isolada do procedimento anterior de cada uma das placas de agar Teague (ou agar EMB).
 Lembre-se de deixar o esfregaço secar antes de fixá-lo para evitar formação de aerossóis e a seguir core-os com fucsina não há necessidade de corar por Gram, pois o Agar EMB seletivo e não permite crescimento de bactérias Gram positivas)
 Observe na microscópio óptico utando a objetiva de 100 X, anote a forma e o arranjo da bactéria.
Prova bioquímicas para identificação de coliforme
 Todos os meios utilizados para as provas bioquímicas devem ser inoculados a partir de uma colônia isolada e devem ser inoculados com o mesmo tipo de colônia para que se possa identificar características de uma única espécie. OBSERVAÇÃO: Incubar todos os tubos a 37°C, por um período de 5 dias.
METABOLISMO DE CARBOIDRATOS 
Fermentação de diferentes carboidratos
 As fermentações são reações bioquímicas produtoras de energia em que moléculas orgânicas servem como aceitadores e doadores de electrões. A capacidade dos microrganismos fermentarem hidratos de carbono e os tipos de produtos formados são úteis na sua identificação. Um determinado hidrato de carbono pode ser fermentado originando diferentes produtos finais consoante o tipo de microrganismo envolvido. Estes produtos finais (álcoois, ácidos, gases o
outras moléculas orgânicas) são característicos cos microrganismos e podem ser usados para os identificar.
 Na fermentação, substratos como hidratos de carbono e álcoois sofrem uma
desassimilação anaeróbia, podendo ocorrer produção de compostos orgânicos ácidos que podem ser acompanhados por gases, como hidrogénio ou CO2. Os microrganismos anaeróbicos facultativos são geralmente os chamados fermentadores de hidratados de carbono.
 A degradação fermentativa faz-se habitualmente num meio liquido que contém nutrientes para suporte do crescimento do microrganismo, o hidrato de carbono especifico que serve de substrato para determinar a sua capacidade fermentativa e um indicador de pH (ex. vermelho de fenol ou purpura de bromocresol. Nesse caldo de fermentação existe também um tubo de Durham (pequeno tubo colocado em posição invertida dentro do melo de cultura liquido) que permite detectar a produção de gás.
 Após incubação, a libertação de compostos ácidos, resultantes da fermentação do hidrato de carbono, faz descer o pH o que conduz à mudança da cor original do meio, pois está presente um indicador de pH (reação positiva). Em alguns casos, a produção de ácido é acompanhada pela produção de gás (CO2) que é visível, pois o meio liquido que estava dentro do tubo de Durham é substituído por gás em forma de bolhas. Na fermentação alcoólica ocorre produção gás no tubo de Durham, mas o meio de cultura mantém a cor inicial.
 As culturas que não são capazes de fermentar o hidrato de carbono não conduzem à mudança de cor do meio nem apresentam produção de gás (reação negativa). O fato de não ter havido fermentação do hidrato de carbono não significa ausência de crescimento, pois o microrganismo pode usar outros nutrientes do meio (ex. peptonas) como fonte de energia
 Todas as culturas devem ser observadas às 24 a 48 h, uma vez que uma incubação prolongada pode mascarar a produção de ácido, pois ocorre produção de substâncias alcalinas resultantes da ação enzimática sobre outros substratos.
 São exemplos de provas para identificação de microrganismos as fermentações da glicose, lactose, sacarose, manose, inositol, sorbitol, arabinose, etc.
 Algumas bactérias são capazes de hidrolisar os carboidratos (dissacarídeos até glicose), e metabolizar a glicose até ácidos (com ou sem liberação de gás) e/ou álcoois.
 Carboidrato (manitol, sacarose, lactose, etc.) glicose ác. Pirúvico ácidos, álcoois e gases.
 Meio utilizado: meio de cultura indicador que contém: caldo simples + carboidrato + indicador de pH (indicador de Andrade) + tubo de Durhan.
Meio básico
 Distribuir em volumes de 3mL em tubos 13 x 100mm, incluindo tubos de Durhan, quando indicados. Esterilizar a 120°C, por 15 minutos.
 A concentração dos carboidratos varia de 0,5 a 1,0%. Glicose, manitol, salicina, adonitol e inositol podem ser acrescentados antes da esterilização. O tempo de esterilização para o glicerol limita-se a 10 minutos. Dissacarídeos lactose, sacarose, celobiose) e Carboidratos como arabinose, xilose e ramnose devem ser esterilizados por filtração ou esterilizados separadamente em soluções concentradas a 10% em água, a fim de evitar hidrólise ou caramelização, juntando-se após, assepticamente, aos tubos com o meio básico (0,3ml por tubos).
Indicador andrade
 Dissolver a fucsina em agua e acrescentar hidróxido de sódio. Se depois de várias horas a fucsina não estiver dissolvida, acrescentar 1 ou 2ml de hidróxido de sódio:
a) repicar o microrganismo já isolado (COLÔNIA) para o meio contendo o carboidrato e incubar em estufa a 37°C por 24 horas.
b) Leitura: observar se houve produção de ácidos (viragem da cor do meio) com ou sem produção de gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan).Inoculação dos meios líquidos
PROVA POSITIVA: MUDANÇA DE COR DO MEIO, PRODUÇÃO DE GÁS
PROVA NEGATIVA: NÃO OCORRE ALTERACAO DO pH do meio e nem ocorre formação de gás.
Meio agar citrato de Simmons (prova do citrato)
Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono. Efetua-se no meio de citrato ou meio de Simmons.
 Na ausência de glicose ou lactose fermentáveis, alguns microrganismos são capazes de usar o citrato como única fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presença de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da célula o citrato é degradado pela enzima citrilase, produzindo oxalacetato e acetato. Estes produtos são depois convertidos enzimaticamente em ácido pirúvico e CO2
 O meio de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova é feita em tubos em rampa (meio inclinado uma vez que o O2 é necessário para a utilização do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertação de CO2. Durante esta reação o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sódio (fornecido pelo citrato de sódio) e água para formar carbonato de sódio, que é um produto alcalino. A presença de carbonato de sódio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte.
 Após incubação, as culturas citrato positivo são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da rampa, acompanhado de coloração azul no meio de cultura. Nas culturas citato negativas a cor do meio mantém-se verde e não apresentam crescimento no meio de cultura.
Inoculação do Agar Citrato de Simmons
 Recolher assepticamente uma alçada da colônia (apenas uma colônia) pesquisada e semeá-la por zigue-zague na superfície do bisel, começando pelo fundo até a ponta do meio que está próxima a boca do tubo.
Citrato - incubar a 37° C e após 5 dias, observar o crescimento para verificar se houve viragem do indicador (azul de bromotimol) de verde para azul.
Meio utilizado: Citrato de Sódio + H2O +Indicador de pH (azul de bromotimol). O pH final do meio após preparo: 6.8.
Indicador de pH: azul de bromotimol: verde em meio ligeiramente ácido (6.8) e azul em pH acima de 7,6.
 Muitas bactérias são capazes de utilizar o citrato (áс. orgânico do ciclo de Krebs) como fonte de carbono e energia. A enzima que catalisa a clivagem do citrato recebe várias denominações, dentre elas, citrato permease e citrilase.
 Os produtos de clivagem são acetato e oxaloacetalo, este último sendo subsequentemente convertido em Piruvato e CO2, por uma oxalacetato descarboxilase.
 O piruvato é utilizado pela célula (para seu metabolismo) e o CO2 é liberado no meio de cultura. O CO2 liberado reage então com o sódio (proveniente do sal citrato de sódio incorporado na composição do meio de cultura), formando carbonato de sódio (composto alcalino), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinização. 
PROVA POSITIVA meio de cultivo adquire coloração azulada.
 PROVA NEGATIVA-meio de cultivo permanece com coloração verde.
METABOLISMO DE PROTEINAS
 A decomposição de proteínas liberação de aminoácidos) conduz à produção de substâncias pútridas (de mal cheiro) como: H2S, Indol e escatol e etc. Neste experimento, observaremos a utilização ou não de certos aminoácidos pelas bactérias (necessários ao seu metabolismo), através da detecção da presença de substâncias pútridas.
Meio SIM (Prova do H2S, indol e motilidade)
 Meio de cultura utilizado: Meio SIM. (S=sulfeto; I=indol; M=motilidade)
 Composição: peptona (proteína que serve como fonte de triptofano e cistina) sal de metal pesado (sal de ferro ou chumbo), água e agar.
Inoculação do meio SIM pela técnica da picada central:
 Recolher uma colônia (idêntica a coloria utilizada para a prova anterior) com a agulha de nichrome. Fazer uma picada de 1cm de profundidade no meio.
 Após 5 dias de incubação a 37°C, verificar se a bactéria investigada e móvel ou imóvel, se produziu gás sulfídrico e se produziu indol.
MOTILIDADE
 Para verificar a motilidade basta levantar o tubo de ensaio e observá-lo contra a luz. Crescimento somente na área onde foi feita a inoculação, motilidade negativa; crescimento em outras partes do meio, geralmente o meio fica turvo, motilidade positiva.
PROVA POSITIVA – microrganismo é móvel, crescimento ocorre em todo o meio.
PROVA NEGATIVA – microrganismo é imóvel, o crescimento ocorre somente onde foi realizado a picada.
GÁS SULFÍDRICO - Prova do sulfureto de hidrogénio (H2S)
 Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrogênio (H2S) a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos.
 Muitas proteínas são ricas em aminoácidos sulfurados, como a cisteína. Quando estas proteínas estão presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos que são utilizados como nutrientes. O aminoácido cisteína, na presença da enzima cisteína desulfurase, perde o seu átomo de enxofre que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar H2S. O H2S então produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína. Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela redução de compostos sulfurados inorgânicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contém tiossulfato de sódio alguns microrganismos têm a capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase com libertação de H2S. Os átomos de enxofre atuam como aceitadores de hidrogênio durante a oxidação dos compostos inorgânicos.
 O meio de cultura agar SIM contem peptonas (a cisteína é um dos componentes) e tiossulfato de sódio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4)2SO4) que atua como indicador da presença de H2S. Como o H2S é incolor, e por conseguinte não é visível, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel. A presença deste composto ocorre ao longo da linha de inoculação e indica que houve produção de sulfureto de hidrogênio (reação positiva). A ausência de precipitado negro evidencia uma reação negativa.
 Para verificar se houve produção de gás sulfídrico basta verificar se o meio mudou a cor de amarela para marrom escuro. Meio marrom escuro significa prova do gás sulfídrico positiva, meio amarelo significa prova do gás sulfídrico negativa.
PROVA DO H2S 5 dias
PROVA POSITIVA - meio de cultivo adquire uma coloração preta.
PROVA NEGATIVA meio de cultivo permanece com a coloração original.
Cistina: aminoácido que contém enxofre (S).Degradação da cistina com liberação de H2S.
Ac. Pirúvico: utilizado no metabolismo da bactéria.
H2S: liberado no meio de cultura. O H2S liberado combina-se com o sal de ferro ou chumbo, dando como resultado um precipitado de cor negra.
INDOL
 O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol.
 O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada pela enzima triptofanase.
 Com a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve como marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol.
 Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex: água peptonada, para fazer a sementeira. Após o crescimento pesquisa-sea presença de indol adicionando o reagente de Kovac's (amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado.
 As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.
 Adicionar após incubação, de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs (solução de paradimetilaminobenzaldeido). Se houver liberação do gás indol, formar-se-á um anel vermelho (composto denominado rosindol).
PROVA POSITIVA – aparecimento de um anel vermelho na superfície do meio logo após a adição o reativo de Kovacs.
PROVA NEGATIVA – reativo de Kovacs permanece com a sua cor original (amarelada).
9.3.5.2. Meio Vermelho de metila e Voges Proskauer (Prova do vermelho de metila e voges Proskauer)
Prova do Vermelho de Metila
 Tem como objetivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Efetua-se no meio MR-VP (Methyl Red, Vogel-Proskauer).
 A glicose é o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produção de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimático presente na bactéria.
 Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produção inicial de ácidos orgânicos, há uns (ex. Escherichia coli) que mantêm um pH de 4 até ao fim da incubação, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o último período de incubação convertem esses ácidos a produtos finais não ácidos como o etanol e acetoína, resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubação.
 Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem caixa. A pH 4, o vermelho de metilo vira para vermelho, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6, apesar de ainda ser ácido, como há menos íons hidrogênio, o indicador muda para amarelo e é uma prova negativa.
Prova de Voges-Proskauer
 O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da metabolização da glicose. Efetua-se também no meio MR - VP (Methyl Red, Voges Proskauer).
 A adição do reagente de Barritt's (solução 40% KOH e solução de α-naftol em etanol absoluto) permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol (acetoína) que é percursor da síntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formação de um complexo rosa/vermelho que dá essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15 minutos após a adição do reagente de Barritt's representa uma prova positiva. A ausência dessa cor é uma prova negativa.
Inoculação do Caldo Vermelho de Metila-Voges Proskauer
 Recolher uma alçada da colônia e introduzi-la no meio de cultivo líquido MR-VP, agitá-la no interior do meio. Homogeneizar o meio de cultivo inoculado. Incubar todos os tubos a 37°C.
 Prova do Vermelho da Metila após 48 h, retirar 1 mL (usando pipeta estéril) do cultivo, transferir para outro tubo e acrescentar gotas de vermelho de metila (indicador preparado no máximo uma semana antes do teste). Observar se há viragem do indicador para vermelho. Caso contrário, aguardar mais 24 h e repetir o teste. Só após 5 dias é que se pode confirmar que a prova é negativa. A prova do vermelho de metila é negativa se o indicador apresenta coloração
alaranjada e a prova do vermelho de metila é positiva quando o indicador apresenta a coloração vermelha.
PROVA POSITIVA - meio adquire coloração vermelha
PROVA NEGATIVA - meio adquire coloração alaranjada.
 Prova do Voges Proskauer para a prova do Voges Proskauer - VP, após 24h de incubação retirar 1 mL do cultivo e acrescentar 0,6 mL de alfa-naftol (solução a 5% em álcool etílico ou absoluto) e 0,2 mL de solução aquosa de KOH a 40% m/v. Agitar bem, esperar 15 min. E observar se ocorre desenvolvimento de cor rosa-avermelhada. Caso contrário, repetir o teste no dia seguinte.
PROVA POSITIVA – meio de cultivo adquire coloração vermelho.
PROVA NEGATIVA – meio permanece com a coloração original.
Como alternativa mais conveniente para rotina, juntar para cada mililitro de meio partes iguais (±0,5mL) de:
Solução de affa-naftol a 6% em álcool absoluto – 0,5 mL
Solução aquosa de KOH a 16% - 0,5 mL
Nota: a maioria das Enterobacteriaceaea dá prova de VM e VP opostas, já que o aumento da alcalinidade (reação do vermelho de metila negativa) se deve à produção de acetoína (reação de VP positiva). Desta forma, basta realizar o teste com o indicador vermelho de metila para concluir sobre o resultado das duas provas.
 Prova de agar ferro Kligier (K) ou de agar Triplo Açúcar e Ferro (TSI)
 Esta prova é geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta família de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S).
 Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contêm glicose em pequena concentração (0,1%), lactose em concentração superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de ferro para a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meios diferenciais é que o TSI possui
mais um açúcar, a sacarose, em concentração igual à da lactose (1%).
Ágar tríplice açúcar Usado para determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar carboidratos específicos existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S.
Fermentação da glicose A concentração de glicose no meio é apenas 0,1%, obtendo-se assim uma quantidade relativamente pequena de ácido. Inicialmente, todo meio se torna amarelo devido à degradação da glicose. Após algumas horas, os microrganismos começam a decompor oxidativamente a peptona, produzindo uma alcalinização na superfície do meio. No fundo do tubo, a degradação proteica é insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, e o meio mantém-se amarelo. Todas as enterobactérias fermentam a glicose.
Fermentação da lactose e da sacarose O meio possui uma concentração maior desses açúcares (10%), permitindo que as bactérias que utilizam a lactose com ou sem sacarose, produzam quantidades relativamente alta de ácidos, suficiente para superar a reação alcalina desenvolvida na superfície do meio. O tubo permanece totalmente com a coloração amarela. O indicador de pH do meio é o vermelho de fenol.
Produção de gás Ocorre formação de gás devido à degradação de moléculas de ácido fórmico, sendo evidenciado pelo aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio.
Produção de H2S É evidenciada pelo aparecimento de um precipitado de coloração Negra ( sulfato de Ferro), proveniente da reação de H2S com Sulfato ferro amoniacal contida no meio.
Inoculação dos meios
 Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. É essencial que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h de incubação para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradação das peptonas, formando produtos finais alcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S.
Após incubação podem ser determinadas as atividades fermentativas, a produção de gás e a produção de H2S, podendo ocorrer vários resultados:
Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha):
 Só a glicose foifermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato está presente em concentração mínima, a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio são também usadas na produção de substâncias alcalinas. No cilindro, a reação ácida é mantida devido à tensão reduzida do oxigénio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devida à persistência da formação de ácido no cilindro
Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela)
 Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose, para além da glicose. Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altas concentrações são substratos para a atividade fermentativa continua com manutenção da reação ácida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro).
Produção de gás
 Nota-se pela ocorrència de fraturas no meio de cultura
Produção de H2S
 Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermédia do cilindro. Isto deve-se ao fato do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrogénio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolúvel, precipita.
Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterado (tijolo)
 Não ocorreu fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produção de gás ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condições anaeróbias e/ou aeróbias, resultando
num pH alcalino devido à produção de amónia. Se só ocorrer degradação aeróbia das peptonas, a reação alcalina só é evidenciada na superfície da rampa. Se houver degradação aeróbica e anaeróbica das peptonas, a reação alcalina é visível em todo o meio.
Provas o meio TSI
Púrpura/amarelo (ápice púrpuro e base amarela) = fermentação da glicose (lactose e sacarose negativas).
Amarelo/amarelo (ápice e base amarelos) = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açúcares).
Presença de gás (CO2) = bolhas ou meio fragmentado.
H2S positivo = presença de precipitado negro.
REAÇÕES
Lactose β-galactosidase Ácidos
Ácido fórmico formiase CO2 + H2
Sacarose invertase Ácidos
Citrato citrilase Oxalacetato + acetato oxalacetato Ác. Pirúvico + CO2
 descarboxilase
CO2 + H₂O + Na Na2CO3 (pH alcalino)
Na2S2O3 + H₂O dessulfidrilase Na2SO4 + H2S
Tiossulfato + 4H + 4e- redutase do tiossulfato 2SO3 + 2H2S + metal pesado 
 (precipitado preto)
Cisteína cisteína desulfurase ácido pirúvico + amônia + H2S (+ metal pesado)
Tryptofano triptofanase Ác. Pirúvico e indol
 Prod. pela bact..
Glicose ácido pirúvico ác. fórmico + ác. acético + ác. lático + ác. succínico + etanol (pH 4,4)
Glicose ácido pirúvico 	 2,3 butanodiol + etanol + ác. Lático+ CO2 + H2 (pH 6,0)
Acetoína + α-naftol KOH 40% diacetil + ereatina (coloração rosa/vermelho)
CÁLCULO E/OU RESULTADOS
Cálculos para preparo dos meios de cultivo
E.M.B. T.S.I. Simmons
36g ---- 1000mL 64,5g ---- 1000mL 24,28g ---- 1000mL
x ---- 250mL x ---- 150mL x ---- 150mL
x = 9g EMB x = 9,675g x = 3,642g
S.I.M MR-VP Lactose
30g ---- 1000mL 17g ---- 1000mL 13g ---- 1000mL
x ---- 150 mL x ---- 150mL x ---- 150mL
x = 4,5g x = 2,55g x = 1,95g
Lauril (tubos de 9mL e 9,9mL) Lauril (tubos de 10mL)
35,6g ---- 1000mL 35,6 g x 2 = 71,2g
x ---- 352,4 mL 71,2g ---- 1000mL
x = 12,5454g x ---- 210 mL
 x = 14,952g 
 Caldo E.C. Caldo V.B. A.P.C
 37g ---- 1000mL 40g ---- 1000mL 23,5 g ---- 1000mL
x ---- 150mL x ---- 150mL x ---- 200 mL
x = 5,55g x = 6g x = 4,7g
Solução salina 0,5%m/v Enterococcus
0,5g ---- 100mL 0,1g de ind. ---- 1000mL
x ---- 80mL x ---- 80 mL
x = 0,4 g x =
Ágar m – Endo Les
20 mL de álcool ---- 980mL 51,1g ---- 980mL
x ---- 80 mL x ---- 80mL
x = 1,6 mL x = 4,2g
Número de UFC/100mL na água doce e salgada pela técnica da membrana filtrante
Água doce
Coliformes: nº de colônias x fator de diluição
 29 x 100 = 2900 UFC/mL
 2900 UFC/mL = 290000 UFC/100mL
Escherichia coli = nº de colônias verdes x fator de diluição
 2 x 100 = 200 UFC/mL 
 200 UFC/mL = 20000 UFC/100mL
Água Salgada
Coliformes: 0 UFC/100mL
Enterococcus: 0 UFC/100Ml
Resultados da análise da técnica dos tubos múltiplos, técnica do substrato cromogênico e técnica da membrana filtrante.
Coliformes – Tubos Múltiplos
Bactérias Heterotróficas – Técnica Pour Plate
	
Origem da amostra
	
Contagem do número total de bactérias heterotróficas UFC/1mL
	
Coliformes totais
(NMP/ 100mL)
	
Coliformes Termotolerantes
(NMP/100mL)
	
Legislação
	
Água de piscina
	
0
	
0
	
0
	
Resolução 1398/2008 – controle e vigilância de água de piscina
Coliformes Totais: ausente (0NMP/100mL)
Coliformes Termotolerantes: ausente (0NMP/100mL)
Bactérias Heterotróficas: 100 UFC/1mL
	
Água tratada
	
0
	
0
	
0
	
Portaria MS Nº 2914 DE 12/12/2011 – Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.
Coliformes Totais: ausente (0NMP/100mL)
Coliformes Termotolerantes: ausente (0NMP/100mL)
Bactérias Heterotróficas: 500 UFC/1mL
	
Água Mineral
	
--
	
350
	
13
	
Resolução- RDC Nº 275, de 22 de setembro de 2005
Escherichia coli ou coliforme termotolerante: ausência em 100 mL
Coliformes totais: <1,0 UFC; <1,1NMP em 100mL
Enterococos: <1,0 UFC; <1,1NMP em 100 mL
Pseudomonas aeruginosa: <1,0 UFC; <1,1NMP em 100mL
Clostridios sulfito redutores ou Closdridium perfringens: <1,0 UFC; <1,1 NMP em 100mL
Coliformes – Técnica do Substrato Definido (Cromogênico- Fluorogênico)
	
Origem da amostra
	
Coliformes totais
(NMP/ 100mL)
	
Escherichia coli
(NMP/ 100mL)
	
Classificação quanto a legislação especifica (piscina/tratada/mineral)
	
Classificação quanto a CONAMA 357/2005
(somente para águas naturais)
	
Água de poço 1
	
387,3
	
0
	
-
	
Especial
	
Água de poço 2
	
1,0
	
2,0
	
-
	
I
Coliformes – Técnica da Membrana Filtrante
	
Origem da amostra
	
Coliformes termotolerantes
(E.C)
UFC/100mL
	
Enterococos
UFC/100mL
	
Classificação quanto a balneabilidade
(Resolução CONAMA 274/2000)
	
Classificação quanto a CONAMA 357/2005
(somente para águas naturais)
	
Água doce
(poço 3)
	
20000
	
-
	
ImprópriaIV
	
Água de mar
	
-
	
0
	
Própria- Excelente
	
Especial
CONCLUSÕES
ESQUEMAS
ATIVIDADES DE VERIFICAÇÃO 
Comentar os resultados obtidos. Comente a qualidade da água analisada.
Algumas das águas analisadas apresentam qualidade boa e própria para consumo de acordo com a legislação, já outras estão fora dos padrões exigidos do numero mínimo aceitável de coliformes presentes na água.
Enumerar as razões que fazem dos coliformes bons indicadores de contaminação fecal da água.
-São encontrados normalmente no intestino do homem e animais de sangue quente, dessa forma, são eliminados em grande quantidade nas fezes;
- Sobrevivem em águas poluídas por períodos mais longos que os germes patogênicos;
- Apresentam características estáveis e uniformes;
- É facilmente evidenciado por técnicas laboratoriais padronizadas;
- É inofensivo ao homem e a outros animais;
- Está presente em maior quantidade na água poluída do que as espécies patogênicas.
Os coliformes são patogênicos? Dê exemplos.
Porque é que o meio caldo laurel sulfato triptose permite resultados apenas presuntivos, e o meio EC, CVB e EMB são de confirmação?
Teste presuntivo é para detecção de microrganismo fermentadores de lactose, portanto utiliza-se o Caldo Lauril Sulfato, onde a lactose serve como fonte de carbono ao ser fermentada pelos coliformes, com produção de ácido e gás. O Lauril Sulfato é um inibidor da microbiota acompanhante.
Já o teste confirmativo é para detecção de coliformes totais, onde utiliza-se meio de cultura com inibidores da microbiota acompanhante, principalmente os Gram positivos.
Neste trabalho, como foram distinguidos os coliformes termotolerantes dos restantes? 
Através da utilização de meios e temperaturas adequados para crescimento de termotolerantes e analisando as cores das colônias.
Pesquisar diferenças quanto as provas bioquímicas testadas na pratica entre Escherichia coli e Enterobacter aerogenes. O que são os testes IMViC?
Prova com o caldo VM-VP, para comprovar se há produção de ácido ou acetil metil carbinol a partir da glicose, E.coli positivo para VM e negativo para VP, Enterobacter aerogenes o contrario da Escherichia. Prova com Agar citrato de Simmons se positivo (meio com cor azul) o microrganismo utiliza citrato, E. coli negativa, E. aerogenes positiva. Prova com meio SIM, produção de indol, positiva E. aerogenes, negativa E.coli.
Os testes designados por IMViC (Indol, vermelho de Metil, Voges-Proskauer e
Citrato) constituem uma bateria de quatro testes bioquímicos fundamentais para
diferenciar enterobactérias.
Pesquisar outros métodos para quantificação de coliformes totais e termotolerantes em águas.
Colitag- Este método é usado para detectar a presença de coliforme e E. coli, sendo o tempo estimado em 24 horas. O mecanismo de ação segue o mesmo princípio de Colilert
Faça um organograma que resuma todos os passos da analise realizada pela técnica dos tubos múltiplos.
 
 Teste Confirmativo: 
 Tubos com gás do teste anterior
 
 
 Caldo EC 45ºC/ 24h Caldo Verde Brilhante (VB) 37º/48h
 
 Teste completo:
 Ágar EMB Meios de cultura: Um tubo para cada Meio de cultura: 
Caldo Lactosado
Caldo VM-VP
Agar citrato de Simmons
Agar TSI
Meio SIM
 37ºC por 5 dias
Tubo com gás 
do teste anterior
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 17.ASSINATURA DOS AUTORES DO RELATÓRIO 
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