Questão de aprofundamento III

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1) O método de Sanger consiste na produção de cadeias a partir do DNA em 
que se deseja sequenciar, com auxílio de um primer, pela DNA polimerase. 
Inicialmente, o DNA é desnaturado gerando as cadeiras molde para a síntese in 
vitro. Para a síntese é necessário que se adicione desoxinucleotídeos 
trifosfatados/dNTPs (dATP, dTTP, dGTP e dCTP) à solução, porém juntamente 
a eles também é adicionado dideoxinucleotídeos trifosfatados/ddNTPs (ddATP, 
ddTTP, ddGTP e ddCTP), que diferentemente dos dNTPs, são modificados, sendo 
cada grupo marcado com substâncias fluorescentes e não apresentam o grupo 
hidroxila que é necessário para estabelecer a ligação fosfodiéster com o 
nucleosídeo seguinte. Dessa forma, há a formação de fragmentos de DNA uma 
vez que ocorre a terminação da polimerização logo que um ddNTP é incluído 
aleatoriamente. Portanto, a incorporação desses marcadores com diferentes cores 
permite a diferenciação dos fragmentos de cadeia por sua respectiva 
fluorescência. Assim, através de uma eletroforese é possível fazer a separação dos 
fragmentos pelo seu peso molecular, que também identifica a fluorescência das 
bandas que atravessam um trecho do gel iluminado por um feixe laser. Deste 
modo, é possível indicar a sequência obtida da cadeia de DNA complementar à 
cadeia molde. 
Já o método de Maxam & Gilbert (não é muito usado atualmente) utiliza a 
própria molécula-alvo que é clivada diretamente. Primeiramente, o DNA alvo é 
marcado com isótopos radioativos, como 32P ou 35S. Em seguida, desnatura-se o 
DNA separando-o em duas cadeiras. O DNA é colocado em 4 tubos, onde cada 
um terá reações químicas específicas para a degradação de um ou dois 
desoxinucleotídeos, quebrando as cadeias em fragmentos, e consequentemente 
com a marcação do radioisótopo que precede ao desoxinucleotídeo degradado. 
Após isso, é feito a eletroforese em gel do conteúdo de cada tubo separadamente, 
separando os fragmentos por tamanho e indicando assim a sequência que 
corresponde a cada base degradada. 
Logo, os dois métodos se diferenciam pelo primeiro ser através de uma 
síntese enzimática, cujo crescimento da fita é interrompido pela adição de 
dideoxinucleotídeos, e o segundo por degradação química, onde substâncias 
químicas cortam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos. 
Parabéns. <3 
 
 
 
 
2) 
 
d) O gráfico acima mostra que quanto maior o peso molecular do fragmento de DNA, 
menor será a distância migrada pelo mesmo, a exemplo que o fragmento de menor peso 
com 1000 pares de bases se distanciou mais (5,8cm) e o fragmento com 23130 pares de 
bases se distanciou menos (2cm). Este fato foi visto na aula prática de eletroforese, sobre 
a corrida de corantes em gel de agarose. 
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1
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4
5
6
7
1 10 100 1000 10000 100000
D
is
tâ
n
ci
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m
ig
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d
a 
(c
m
)
Peso molecular (bp)
Distância migrada em função do peso molecular