Resumo de Biologia Molecular

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Resumo de Biologia Molecular
DNA (ácido desoxirribonucleico)
• Os ácidos nucleicos são polímeros lineares de monômeros de nucleotídeos, e os nucleotídeos se unem por ligação fosfodiéster. O DNA é formado por duas fitas polinucleotídicas. Cada nucleotídeo é formado por um grupamento fosfato, um açúcar (pentose - desoxirribose) e uma base nitrogenada, unidos por ligação covalente. As bases nitrogenadas são Adenina, Timina, Citosina e Guanina. Adenina e guanina são purinas e timina, citosina e uracila (RNA) são pirimidinas. O açúcar faz a ligação entre a base nitrogenada e o grupamento fosfato. O primeiro fosfato se liga ao açúcar pelo carbono número 5 do açúcar e o próximo fosfato (de outro nucleotídeo) se liga a molécula de açúcar anterior no seu carbono número 3, criando o padrão 5’3’ na primeira fita e o padrão 3’5’na segunda fita. Essa ligação de um fosfato de um nucleotídeo com o açúcar de outro nucleotídeo é feita pela ligação fosfodiéster. Adenina se liga a timina por duas ligações de hidrogênio e guanina se liga a citosina por três ligações de hidrogênio.
• Nucleosídeos: formados pela união de uma base nitrogenada com uma pentose, porém SEM o grupamento fosfato. São produtos de hidrólise química ou enzimática, ocorrem em quantidade muito pequena na célula.
• Formatos do DNA: O que diferencia esses três tipos de DNA é a espessura, o número de pares de base ao redor da hélice e a exposição das bases ao meio externo
-B-DNA: Tem a dupla hélice mais longa e mais fina. Para completar uma volta na hélice são necessários 10 pares de bases.
-A-DNA: Tem a forma mais curta e mais grossa. Para completar uma volta na hélice são necessários 11 pares de bases.
Em solução, geralmente o DNA assume a conformação B. Quando há pouca água disponível para interagir com a dupla hélice, o DNA assume a conformação A-DNA. Existe uma terceira forma de DNA que difere das duas anteriores, pois seu sentido de rotação é para a esquerda, este tipo de DNA é chamado de Z-DNA. Esta conformação é mais alongada e mais fina do que o B-DNA. Para completar uma volta na hélice são necessários 12 pares de bases. Ocorre em regiões curtas do DNA quando existem muitas sequências de C e G. O DNA, em solução com altas concentrações de cátions, assume a conformação Z-DNA.
-Em eucariotos o DNA tende a assumir a conformação Z-DNA devido à metilação do DNA.
• As propriedades químicas do DNA são: complementaridade das bases nitrogenadas, antiparalelismo que confere a direção da cadeia e a possibilidade de desnaturação e renaturação.
• Cromatina: É um complexo formado por DNA enrolado em proteínas histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4) presente nas células dos eucariontes durante a interfase. Os filamentos de cromatina apresentam regiões menos condensadas, chamadas de eucromatina. Já as regiões onde há maior condensação da cromatina são chamadas de heterocromatina. A eucromatina é a região onde há genes ativos. Já a heterocromatina corresponde às partes do DNA que não estão sendo utilizadas pelas células naquele momento, por isso podem estar condensadas. As histonas H2A, H2B, H3 e H4 unem-se, formando um octâmero proteico denominado nucleossomo, com o DNA dando quase duas voltas nesse octâmero formado por cópias das histonas centrais (todas menos a H1). A histona H1 une os nucleossomos.
Obs: Histonas possuem caráter básico devido a sua composição, ricas em lisina e arginina
Cromosso: DNA super condensado com o auxílio das histonas. Este enovelamento do DNA ajuda o processo de divisão celular.
Cromosso metafásico eucariótico: braço curto, centrômero (parte central mais condensada), braço longo. Cada metade do cromosso é chamada cromátide.
Gene: os genes são pedaços ou segmentos de DNA e que possuem a informação para a produção de uma proteína ou um polipeptídio. O DNA está situado nos cromossomos. No cromossomo, cada gene ocupa uma posição específica que é chamada de Lócus.
Alelos: São os genes que se unem para formar uma determinada característica e se encontram no mesmo lócus nos cromossomos homólogos. Por exemplo, a característica semente amarela, em ervilhas, é codificada pelos alelos VV, se homozigota e Vv, se heterozigota. Os alelos estarão sempre aos pares nos cromossomos, pois um dos alelos é proveniente de um gameta masculino e o outro de um gameta feminino.
• Replicação: -> A região OriC consiste num complexo com repetições de bases nitrogenadas específicas, conferindo o ponto de iniciação do processo de replicação. A enzima DNAA reconhece essa região de iniciação, desenrolando o DNA e as proteínas Metilases, HU, FIS IHF auxiliam o início do processo. A enzima DNA-helicase (proteína DNAB) abre a dupla hélice do DNA ao quebrar as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, separando o DNA em duas fitas simples. Já a enzima DNA-topoisomerase (II ou girase) regula a torção promovida pela abertura feita pela helicase. A enzima SSB previne que a fitas abertas voltem a se anelarem enquanto as novas fitas não são sintetizadas, ou seja, mantém as forquilhas de DNA abertas. A forquilha de replicação confere a replicação bidirecional do DNA. Existe a fita contínua (5’3’) e a fita descontínua (3’5’). No caso da replicação da fita contínua a síntese é contínua e a enzima DNA-polimerase (III) adiciona nucleotídeos compatíveis com ela no sentido 3’, o que permite o crescimento da fita complementar 5’3’. Para a enzima DNA-polimerase começar a agir ela precisa de um primer, já que ela não possui a capacidade de iniciar uma cadeia de nucleotídeos. Esse primer é sintetizado pela enzima RNA-polimerase (ou primase ou enzima DNAG) e consiste num conjunto de RNA complementares à fita-molde de DNA. Este primer ou iniciador será eliminado e substituído, posteriormente, por DNA, uma vez que a replicação tenha começado. A RNA-polimerase só é necessária no início da replicação da fita principal. Depois da síntese do primer a DNA-polimerase consegue sintetizar a nova fita. No caso da fita descontínua, a DNA-polimerase não consegue copiar fitas que não sejam no sentindo 5’3’. Portanto, a enzima DNA-polimerase só consegue adicionar nucleotídeos na parte 3’ da fita secundária. A síntese é descontínua. Para solucionar esse problema, a RNA-polimerase precisa agir diversas vezes sintetizando primers que possibilitem a ação da DNA-polimerase. O fragmento de Okasaki consiste no conjunto de um primer com a fita de DNA recém-sintetizada. A enzima DNA-ligase liga um fragmento num outro, formando uma fita contínua. Por fim, a enzima telomerase tem como função adicionar sequências específicas e repetitivas à extremidade final dos cromossomos, nas extremidades 3’, onde se encontra o telômero.
• Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição pertencem a uma classe especial (classe II) de enzimas que possuem a função de cortar o DNA em diferentes pontos (sítios). São proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou restringir a invasão por um DNA estranho. Elas atuam como tesouras de DNA, cortando o DNA invasor em diversos fragmentos sem função. As enzimas de restrição reconhecem e cortam posições específicas ao longo da molécula de DNA, nos chamados sítios de restrição. Cada enzima de restrição tem seu próprio sítio de reconhecimento. Em geral, um sítio de restrição é formado por uma sequencia de 4 a 6 pares de bases, chamados de palíndrome (ou sequência palindrômica). Uma palíndrome de DNA é uma sequencia na qual a fita superior, lida da extremidade 5’ para a extremidade 3’, é igual à sequência da fita inferior, também lida da extremidade 5’ para a extremidade
Quando a uma enzima de restrição cliva uma molécula de DNA, ela pode deixar “caudas” de fita simples nos novos terminais chamados de “extremidades coesivas”, pois se ligam facilmente à sua coesiva complementar. Nem todas as enzimas de restrição produzem finais coesivos; algumas cortam as duas fitas de DNA sobre um mesmo eixo, de forma alinhada, produzindo “extremidades cegas”.
RNA (ácido ribonucleico)
• Em comparação com o DNA: RNA possui uma única fita, o açúcar é a ribose e não a desoxirribosee RNA não possui timina, mas sim uracila. As bases nitrogenadas são Adenina, Uracila, Citosina e Guanina. Adenina e guanina são purinas e citosina e uracila (RNA) são pirimidinas. 
Nucleotídeos organizados em códons (3 agrupamentos de bases nitrogenadas). 
Uma consequência do RNA ser unifilamentar é que o RNA é mais flexível, podendo formar uma variedade muito maior de formas moleculares tridimensionais complexas do que pode o DNA bifilamentar. Um filamento de RNA pode se dobrar de tal modo que algumas próprias bases podem fazer par com outras. Tal pareamento intramolecular de bases é um determinante da forma de RNA. 
O RNA, como as proteínas, pode catalisar reações biológicas, sendo chamado de ribozima quando isso ocorre. 
• Os principais tipos de RNA são os RNAs mensageiros (mRNAs), os transportadores (tRNAs) e os ribossomais (rRNA). Os RNAs mensageiros são aqueles que codificam as proteínas e que devem ter seus códons lidos durante o processo de tradução. Os RNAs ribossomais fazem parte da estrutura do ribossomo, junto com diversas outras proteínas e são eles que catalisam a ligação entre dois aminoácidos na síntese de proteínas. Os RNAs transportadores são aqueles que fazem a conexão códon-aminoácido, pois carregam um aminoácido específico de acordo com seu anticódon (complementar ao códon do mRNA). Esses três RNAs principais são conhecidos como RNAs de manutenção do metabolismo celular básico.
O mRNA são produzidos como pré-cursos denominados pré-mRNA, que passam por vários processos de modificação até virarem os mRNA finais ativos que podem ser exportados para fora do núcleo. snRNA é de processamento, o miRNA regula a expressão gênica e o siRNA é a defesa do genoma.
• Transcrição: A enzima RNA-polimerase é responsável pela síntese de RNA a partir de DNA, sempre sintetizando a nova fita no sentido 5’3’, ou seja, a partir da ponta 3’do DNA molde. Para iniciar a transcrição de um determinado gene, a RNA polimerase tem que localizar uma região chamada de promotora, a qual é constituída por uma sequência de nucleotídeos específicos e conservados que sinalizam e direcionam a transcrição do gene adjacente. A principal região promotora em eucariotos é conhecida como TATA box. A localização dessa região promotora é feito com o auxílio de proteínas GTF. A partir da fita contínua do DNA a RNA-polimerase desenrola o DNA, adiciona as bases nitrogenadas complementares para formar a nova fita RNA e enrola novamente o DNA que já foi transcrito. Lembrando que caso a fita primária de DNA tenha Adenina, a RNA-polimerase vai acrescentar Uracila como base nitrogenada complementar, já que RNA não apresenta Timina. Para terminar a transcrição existem duas classes de sequências de sinalização do término da transcrição: uma utiliza a proteína r (rho) e outra não (rho-independente). 
Rho-independente: O pareamento intramolecular das sequências complementares do RNA recém-sintetizado forma uma estrutura em grampo. Esse acontecimento desencadeia os seguintes eventos:
Parada da RNA polimerase; Destruição parcial do híbrido RNA-DNA (proporcionando instabilidade da região que permanece ligada); Dissociação do RNA nascente da enzima RNA polimerase; Restabelecimento da região dupla-fita do DNA; Liberação da RNA polimerase da fita molde do DNA.
Rho-dependente: Não possuem Adenina na fita molde, mas possuem uma sequência curta que é transcrita formando um grampo. A RNA-polimerase ao passar por tal região faz uma pausa e, caso a proteína r esteja presente, dissocia-se.
• O filamento não-molde do DNA (aquele que não é utilizado para fazer a síntese do RNA) é igual ao RNA transcrito, tirando a substituição de T por U, o que leva esse filamento não-molde a ser chamado de filamento codificante.
• Modificações pós-transcricionais:
Pré-RNAm passa por um processo chamado splicing, eliminando as regiões não codificantes. As não condificantes são chamadas de íntron e as codificantes são chamadas de éxon
 O capacete do RNA é uma modificação que ocorre na sua extremidade 5’. Ele confere a essa molécula uma maior estabilidade, pois a protege da ação de fosfatases e nucleases. Além disso, o cap 5’, como é conhecido esse capacete, aumenta a chance desse RNA ser capturado pelos sistemas eucarióticos de tradução, levando a uma maior produção de proteínas. Acontece no mRNA
Além dos capacetes, a maioria dos RNA’s eucarióticos são alterados de forma a conter uma cauda de poliadenilato na sua extremidade 3’. Nessa cauda estão presentes cerca de 200 A’s, que se enrolam ao redor de várias cópias de uma proteína ligadora. Essa cauda tem a função de atuar como acentuadora da tradução, proteger o mRNA da digestão por nucleases presentes no meio e proporcionar uma maior estabilidade à molécula.
• Tradução ou síntese proteica: Aminoácidos no citoplasma são ativados pela enzima a aminoacil tRNA sintase para serem ligadas com seus RNAt respectivos. RNAm sai do núcleo após ter sido transcrito e vai de encontro com um ribossomo (RNAr e proteínas) no citoplasma. Esse ribossomo possui uma subunidade maior e uma menor. A subunidade maior forma três sítios de ligação, o E, o P e o A. O sítio A é onde o tRNA carregado entra e se liga ao mRNA. No sítio P, ocorre a formação da ligação peptídica e é pelo sítio E que o tRNA sem o aminoácido sai do ribossomo. A subunidade menor se liga ao RNAt a fim de se ligarem ao códon de iniciação AUG do RNAm. O RNAt possui um anti-códon complementar ao códon de iniciação AUG, ou seja, UAC. Quando o códon de iniciação é encontrado a subunidade maior do ribossomo se liga e o RNAt se encontra no sítio A. Em seguida, um novo RNAt com um novo anticódon se liga ao sítio A, enquanto o antigo passou do sítio A para o sítio E. Como os dois sítios estão ocupados por RNAt’s os aminoácidos de cada um vão se ligar através de ligações peptídicas formadas no sítio P. O RNAt do sítio E sai e o ribossomo anda para o lado, deixando o sítio A livre pois quando o ribossomo muda de lugar, o RNAt do sítio A passa para o sítio E e assim em diante formando a cadeia de aminoácidos até encontrar o códon de término da tradução, que pode ser UAA, UAG e UGA. A terminação da síntese proteica é determinada uma vez que o ribossomo reconhece o códon de terminação (STOP) no mRNA. Com o auxílio de fatores proteicos de terminação, a cadeia polipeptídica recém-sintetizada é liberada do ribossomo. O ribossomo se desmonta e suas subunidades ficam disponíveis para outro ciclo de síntese. Depois do término da síntese, a proteína precisa ser enovelada, a adotando estrutura tridimensional. Este passo é fundamental para que a proteína seja funcional. O processo de enovelamento pode acontecer tanto no citoplasma celular como no lúmen do RE e ocorre com a presença de proteínas auxiliares chamadas de chaperonas que catalisam o enovelamento proteico. No entanto, o enovelamento correto não garante completamente que a proteína seja funcional. São necessárias algumas modificações, conhecidas como modificações pós-traducionais, para garantir sua funcionalidade. Uma modificação comum é a eliminação de alguns resíduos da cadeia polipeptídica (como exemplo, a metionina inicial, a sequência peptídica de direcionamento para diferentes compartimentos celulares e clivagem proteolítica de sequências internas). Além disso, há a adição de resíduos de açúcares (glicosilação) e alterações químicas que permitem a proteína se ligar à membrana plasmática (por exemplo, a miristilação), dentre outras modificações importantes.
Detalhes das modificações pós-traducionais: Formação de ligações dissulfeto – Dobramento; Clivagem da cadeia; Fosforilação; Glicosilação; Metilação; Acetilação; Adição de âncoras lipídicas.
Existem 4 bases nitrogenadas e 20 aminoácidos. Duas ou mais trincas (códons) de nucleotídeos podem codificar o mesmo aminoácido, o que classifica o código genético como sendo degenerado. 
PCR e sequenciamento
• Uma reação de PCR resulta na amplificação seletiva de uma dada região do DNA. Em cada ciclo são sintetizadas o dobro das cadeias iniciais. Por cada moléculadupla de DNA são sintetizadas duas moléculas. PCR requer 2 primers, dNTD, Taq-polimerase e tampão (Ph) + NgCl2 (ajuda o primer a se ligar com a fita DNA completamentar) e DNA alvo. PCR possui 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão. Para o PCR ser eficaz é preciso ter prévio conhecimento da sequência alvo, de modo que não existam sítios secundários de anelamento, sem similaridade com outras regiões do genoma. Também não podem formar dímeros (um primer anela com outro) e nem grampo (ele mesmo se anela).
100⁰C -> DNA desnatura, separando a dupla fita em duas fitas simples; abaixa a temperatura para 60⁰C -> primers se ligam nas fitas de DNA desnaturadas; aumenta temp para 72⁰C -> Taq-polimerase faz a extensão das fitas após terem sidas aneladas pelos primers.
Tmelting- 2 (A+T) + 4 (G+C) e do resultado final tem que ser subtraído 4⁰C. Quanto maior a quantidade de G+C maior a Tmelting devido ao maior número de ligações de hidrogênio.
Tanelamento define a estringência da reação – especificidade. T baixa = menor estringência - primer pareia em qualquer lugar; T alta = maior estringência – primer pode não parear.
Estringência: relacionada ao emparelhamento de bases de duas fitas complementares. A estringência depende: temperatura; força iônica e pH; comprimento do primer; presença de desnaturantes. Baixa estringência: condições onde um primer parcialmente complementar ainda é capaz de hibridizar, primer pareia em qualquer lugar; Alta estringência: condições nas quais somente se ligam os primers com alta complementariedade.
• Depois do final dos ciclos é preciso fazer eletroforese, separando fragmentos de DNA. A Eletroforese é uma técnica baseada na separação de moléculas de acordo com sua massa e carga. A eletroforese em gel de agarose é o método mais utilizado para separar, analisar e identificar fragmentos de DNA. Na eletroforese em gel, as moléculas de DNA são colocadas em um campo elétrico (que tem um polo positivo e um polo negativo) e a eletroforese em gel tira proveito de uma característica química do DNA, para separar seus fragmentos. Os grupos fosfato do esqueleto de DNA são carregados negativamente desta forma as moléculas de DNA são fortemente atraídas pelo polo positivo fazendo a separação dos fragmentos que serão separados mais tarde. Todos os DNAs migram para o polo positivo através do gel, mas as moléculas de DNA maiores movem-se com mais dificuldade do que as menores. Assim, em um mesmo intervalo de tempo, quanto menor a molécula, mais rápido ela corre. De qualquer modo, após a digestão com enzimas de restrição deveria existir uma banda no gel para cada tamanho diferente de fragmento produzido pela digestão. O fragmento menor será o que migrou para mais longe do poço da amostra e o maior, o que ficou mais perto. 
•Aplicações de PCR: Diagnóstico Pré-natal (doenças herdadas); Diagnóstico de doenças infecciosas (bactérias, vírus, fungos, Protozoários); Identificação de trasngênicos; Diagnóstico e prognóstico de câncer (detecção de oncogenes e genes supressoresde câncer); Expressão gênica semi-quantitativa; DNA fingerprint.