Apoptose via intrínseca

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Apoptose via intrínseca
Introdução:
A apoptose (do grego apo = de e ptose = cair), inicialmente conhecida como morte celular programada, é a lesão em que a célula é estimulada a acionar mecanismos que culminam com a sua morte. Diferentemente da necrose, a célula em apoptose não sofre autólise nem ruptura da membrana citoplasmática; ao contrário, a célula morta é fragmentada, e os seus fragmentos ficam envolvidos pela membrana citoplasmática e são endocitados por células vizinhas, sem desencadear quimiotaxia nem ativação de células fagocitárias (a apoptose não induz inflamação). Apoptose é uma modalidade de morte celular muito frequente, tanto em estados fisiológicos (morte programada) quanto patológicos (morte acidental). Em condições normais, é um mecanismo importante na remodelação de órgãos durante a embriogênese e na vida pós-natal. Além disso, participa no controle da proliferação e diferenciação celulares, fazendo com
que uma célula estimulada a se diferenciar possa ser eliminada após ter cumprido sua função, sem causar distúrbio para as demais células do tecido ou órgão. Um bom exemplo é o das glândulas mamárias: terminada a fase de lactação, as células dos ácinos que proliferaram e secretaram leite entram em apoptose, restando apenas as células dos ductos mamários. No caso, a cessação dos estímulos hormonais que mantinham a secreção do leite desencadeia sinais para ativar a apoptose. De modo semelhante, os linfócitos que proliferam após estimulação antigênica tendem a entrar em apoptose cessado o estímulo ou quando o estímulo é inadequado.
Danos ao DNA
O DNA celular está constantemente sujeito a modificações na sua estrutura, causadas por diferentes agressões, como radiações ionizantes e não ionizantes, radicais livres e substâncias alquilantes, além de pareamento errado de bases nucleotídicas durante sua replicação. Muitas são as formas de lesão no DNA: (1) alterações em bases nitrogenadas; (2) mudança de nucleotídeos; (3) formação de dímeros; (4) quebra em uma ou ambas as fitas; (5) pareamento errado durante a replicação. Tais modificações são reconhecidas por proteínas especializadas, que geram uma resposta que leva ao reparo da lesão ou, se isto não é possível, induzem morte da célula por apoptose (Figura 5.20). O reconhecimento de lesão no DNA e a transdução de sinais para os efetuadores de respostas de reparo ou de apoptose são feitos por um conjunto numeroso e complexo de proteínas codificadas por numerosos genes: (1) genes de reparo de erros de pareamento (mismatch repair genes, MMR). Em humanos, o reparo de pareamento incorreto de nucleotídeos é feito por produtos de um grupo de genes que têm como representantes hMSH 2 a 6, MLH 1 e 2 e PMS 1 e 2 (Figura 5.21). Defeitos nesses genes predispõem ao câncer; mutações herdadas nesses genes ocorrem na síndrome de Lynch, associada tipicamente com o carcinoma colorretal hereditário sem polipose; (2) genes de reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Os raios ultravioleta provenientes da luz solar são causa comum de formação de dímeros de timina. O reparo dessa lesão é feito por proteínas codificadas por esses genes, sobretudo a XPC (xeroderma pigmentosum C protein) (Figura 5.22). Na doença xeroderma pigmentoso, os pacientes têm anormalidades no gene XPC e desenvolvem vários tipos de câncer na pele, muitas vezes em idade jovem; (3) genes que atuam no reparo de DNA lesado por radiações ionizantes; os genes BRCA 1 e 2 (de breast cancer) são exemplos bem conhecidos.
Aspectos Morfológicos do Processo
A apoptose afeta células individualmente, razão pela qual ela não é facilmente reconhecida em exames microscópicos rotineiros. A célula encolhe-se e o citoplasma fica mais denso; há redução do volume celular, por eliminação de eletrólitos e água através de canais específicos, incluindo aquaporinas; a cromatina torna-se condensada e disposta em grumos junto à membrana nuclear, criando imagens descritas ao ML como núcleos em meia-lua, em pata de cavalo, em lança e em naveta. Em seguida, o núcleo se fragmenta (cariorrexe), ao mesmo tempo em que a membrana citoplasmática emite projeções e forma brotamentos que contêm fragmentos do núcleo. O brotamento termina com a fragmentação da célula em múltiplos brotos, que passam a constituir os corpos apoptóticos, os quais são endocitados por células vizinhas (Figura 5.36) ou permanecem livres no interstício (o que é muito pouco frequente). Muitas vezes, a célula apoptótica sofre apenas encolhimento e condensação do citoplasma e do núcleo, sem fragmentar-se, como acontece em ceratinócitos em casos de queimadura solar.
Patogênese
Independentemente da causa, a apoptose resulta sempre da ativação sequencial de proteases (sobretudo, caspases), que são responsáveis pelas alterações morfológicas características da lesão. A ativação de caspases, que é o evento-chave no processo, pode ocorrer por: (a) mecanismos extrínsecos, dependentes de estímulos externos que são reconhecidos e propagados por receptores da membrana citoplasmática que possuem domínios de morte (apoptose extrínseca); (b) mecanismos intrínsecos, que aumentam a permeabilidade mitocondrial, com liberação no citosol de moléculas que induzem o processo (apoptose intrínseca); (c) agentes que atuam diretamente na membrana citoplasmática, mas sem o envolvimento de receptores com domínio de morte. Nessas três situações, participam inúmeras proteínas reguladoras que induzem ou bloqueiam as diferentes etapas do processo.
As Caspases
Caspases (cysteine asparargil specific proteases) são enzimas que possuem cisteína no sítio ativo e que clivam proteínas em sítios com resíduos de ácido aspártico. Caspases são produzidas como pró-caspases e ativadas pelo desligamento de uma molécula inibidora ou por clivagem proteolítica em sítios com ácido aspártico. Em humanos, são conhecidas 12 caspases, nem todas associadas a apoptose.
As caspases envolvidas na apoptose podem ser ativadoras (caspases 8, 9 e 10) ou efetuadoras (caspases 3, 6 e 7). As caspases ativadoras fazem proteólise das caspases 3, 6 e 7, que, por sua vez, ativam outras proteases que degradam diferentes substratos da célula, como DNA, laminas nucleares.
As mitocôndrias
As mitocôndrias têm papel essencial na apoptose. Quando agredidas por inúmeros agentes (lesões no DNA, radicais livres, estresse no RE), sofrem aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial externa e liberam no citosol moléculas pró-apoptóticas (Figura 5.37): (1) citocromo c, que se associa no citossol à APAF 1 (apoptosis protease activating factor 1), formando o complexo denominado apoptossomo (este ativa a caspase 9, iniciando a apoptose); (2) proteína SMAC (second mitochondrial activator of caspases, também chamada Diablo). No citoplasma, existem inibidores naturais da apoptose da família IAP (ver adiante). No citosol, a SMAC inibe a IAP, permitindo a ativação de caspases; (3) AIF (apoptopsis inducing factor), que ativa a caspase 9 e algumas endonucleases; (4) OMI/HTRA2 (high temperature requirement protein A2), serina protease que induz apoptose por inibir a IAP; (5) endonuclease G, que ativa endonucleases e pode induzir apoptose independentemente da ativação de caspases (apoptose intrínseca independente de caspases).
Proteínas Reguladoras
A família BCL (B cell lymphoma) inclui 23 proteínas, inibidoras (antiapoptóticas) ou ativadoras (próapoptóticas) da apoptose. As proteínas antiapoptóticas, como BCL-2 e BCL-XL, localizam-se especialmente na membrana mitocondrial externa, onde fazem parte dos poros de permeabilidade transicional (ver Figura 5.17); normalmente, tais poros são impermeáveis. As proteínas pró-apoptóticas, conhecidas em conjunto como proteínas BAX (BIM, BAD, BID, NOXA, entre outras), têm um domínio de dimerização BH3 que as liga a proteínas antiapoptóticas (BCL-2 e BCL-XL). Quando ocorre tal ligação, os poros da membrana mitocondrial externa se abrem, permitindo a saída de citocromo c, SMAC e AIF, que ativam caspases no citosol ■ As proteínas IAP (inhibitor of apoptosis proteins) inibem as caspases3, 7 e 9. A caspase 9 fica normalmente inibida pela IAP; sem esta, ela se torna ativa e desencadeia os passos seguintes do processo. Algumas IAP são expressas em grande quantidade em células cancerosas, sendo esse um dos motivos que facilitam a sobrevivência dessas células ■ As proteínas BAD, BIM, BID, Puma e Noxa atuam como sensores de agressão celular; quando estimuladas, regulam a ação das proteínas pró ou antiapoptóticas ■ A proteína p53 atua na manutenção da integridade do genoma e na sobrevivência das células, esta mediante ação pró-apoptótica. Quando o genoma é agredido por agentes diversos, a célula aumenta a síntese de p53, a qual induz parada do ciclo celular (ver Figura 10.29). Se o defeito no DNA é reparado, a célula permanece viável; se não é corrigido, a p53 induz apoptose por meio de: (1) ativação de genes cujos produtos são pró-apoptóticos (p. ex., BAX); (2) inibição da expressão de proteínas antiapoptóticas (p. ex., BCL-2); (3) inibição de IAP. A p53, portanto, cumpre papel essencial na manutenção da integridade celular, mediante indução de mecanismos de reparo ou, quando necessário, de morte celular
Permeabilidade mitocondrial e apoptose. A. A permeabilidade da membrana mitocondrial é regulada por várias moléculas, entre elas a BCL-2 e a BCL-XL. Em condições normais, os poros de permeabilidade não permitem a saída de várias moléculas contidas na matriz mitocondrial. B. Várias agressões estimulam proteínas BAX, que interagem com as moléculas BCL-2 e BCL-XL, promovendo abertura dos poros de permeabilidade mitocondrial. Com isso, ocorre a saída de citocromo c, SMAC, AIF, OMI e endonuclease G, que induzem apoptose (ver, também, Figura 5.38). SMAC = second mitochondrial activator of caspases; AIF = apoptosis inducing factor; OMI = serina protease.
Alterações Morfológicas (mecanismos)
Na apoptose ocorrem alterações em membranas, no citoplasma e no núcleo. Por ativação de fosfolipases e esfingomielinase, a membrana citoplasmática sofre mudanças na sua fluidez, por modificações na síntese e na degradação de lipídeos. Paralelamente, ocorre translocação de fostatidilserina para a face externa da membrana citoplasmática, o que constitui um sinal para endocitose de corpos apoptóticos. A endocitose de corpos apoptóticos via fosfatidilserina não se acompanha da liberação de mediadores inflamatórios. A formação de brotamentos na membrana citoplasmática depende de alterações no citoesqueleto e em proteínas que formam a sustentação da face interna da membrana citoplasmática (espectrinas e anquirinas) por ativação de proteases por caspases efetuadoras. O descolamento da célula da matriz extracelular ou de células vizinhas pode ser secundária à desorganização do citoesqueleto, com desarranjo nos diferentes pontos de adesão. Se uma agressão leva à desorganização dos pontos de adesão, esse pode ser o estímulo para se iniciar a apoptose. A retração do citoplasma, que se torna mais denso, deve-se à eliminação de água e à reorganização do citoesqueleto. As alterações nucleares, incluindo picnose e cariorrexe, dependem das caspases 3 e 7, que ativam proteases que degradam proteínas nucleares. A atividade proteolítica no núcleo leva a: (1) degradação de proteínas que formam o citoesqueleto nuclear; (2) fosforilação e acetilação de histonas, favorecendo a desorganização da cromatina, que se desloca para a periferia e sofre condensação progressiva (picnose); (3) proteólise parcial de laminas, que desorganiza a sustentação do envelope, favorecendo a fragmentação do núcleo (cariorrexe); (4) degradação parcial de proteínas nucleares envolvidas na síntese de mRNA e no reparo do DNA; (5) proteólise de proteínas inibidoras de DNAses (ICAD), que resulta na ativação de endonucleases que clivam o DNA internucleossomal (CAD, caspase activated DNAses), gerando fragmentos com 200 pares de bases ou seus múltiplos. Com base nesse fenômeno, um método muito eficaz de reconhecimento de apoptose consiste na análise por eletroforese em gel do DNA extraído de células ou tecidos em apoptose, a qual revela bandas com diferença de 200 pares de bases (Figura 5.40). Outra maneira de detectar apoptose é a incorporação de nucleotídeos marcados nas extremidades dos fragmentos internucleossômicos do DNA (técnica de TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase mediated digoxigenin-UTP nick-end-label), que podem ser depois identificados in situ. O método consiste na inserção de um nucleotídeo marcado no ponto de clivagem, o qual é, posteriormente, identificado por imuno-histoquímica
Apoptose intrínseca ativada por agressão à membrana mitocondrial
Em inúmeras situações, a membrana mitocondrial pode tornar-se permeável a moléculas existentes no espaço intermembranoso. Tal ocorre por: (1) ação de substâncias que interferem na integridade da camada lipídica (p. ex., hipóxia, radicais livres, aumento de Ca++, ácidos biliares apolares, ésteres de etanol com ácidos graxos e alguns medicamentos quimioterápicos); (2) agressão ao DNA (p. ex., radiações ionizantes, luz ultravioleta, radicais livres, agentes genotóxicos etc.); (3) estresse do retículo endoplasmático; (4) excitoxicidade por estimulação excessiva de receptores para glutamato em neurônios. Nessas situações, sensores especiais captam os sinais de perigo e ativam BAX (ver Figura 5.37), criando poros na membrana mitocondrial que permitem a saída de moléculas ativadoras de caspases (citocromo c, SMAC e AIF).
Apoptose intrínseca independente de caspases
Alteração na permeabilidade da membrana mitocondrial externa libera OMI, Endo G e AIF. Endo G e AIF são translocados para o núcleo, onde induzem condensação da cromatina (AIF) e
fragmentação do DNA (Endo G), mas sem fragmentação do núcleo. A célula morre, com volume reduzido, núcleo condensado e cromatina agrupada na membrana nuclear, mas sem cariorrexe; trata-se de morte celular em parte semelhante morfologicamente a apoptose, mas feita sem ativação de caspases. Em camundongos nocauteados para APAF1, incapazes de disparar a apoptose, a morte programada de células em remodelamento embrionário (p. ex., membranas interdigitais) ocorre por esse mecanismo. Fenômeno semelhante ocorre em algumas infecções virais, nas quais os vírus inibem as caspases
Apoptose fisiológica x patológica
A apoptose tem enorme importância no estudo e no conhecimento das doenças. Além de constituir lesão frequente em muitas enfermidades, a apoptose (ou a sua falta) está na base de alguns processos patológicos. Ela tem sido considerada a lesão básica de algumas doenças neurodegenerativas, pois é responsável pela perda de células suficiente para provocar danos funcionais. Por outro lado, redução da apoptose parece fator importante na progressão de neoplasias e em algumas, como linfomas de células B, o mecanismo patogenético mais provável para o aumento da população celular é a falta de indução de apoptose em células linfoides
Apoptose e alzheimer
 mecanismo pelo qual ocorre a indução do neurônio à apoptose doAlzheimer ainda não é completamente conhecido. Entretanto, sabe-se que aelevada concentração extra-celular de uma proteína chamada beta-amilóidepode ser o ponto chave para se chegar a uma resposta (BACSKAI, 2008).A beta-amilóide é formada a partir da quebra irregular de uma proteínatransmembrana do neurônio percursora da proteína amilóide (PPA). Isso é feitopor uma versão mutante da enzima preselina (Fig. 2 em anexo). A causa dessaclivagem anormal pode ser dada por herança genética, onde é possível ter umafragilidade na transcrição desse gene, aumentando os riscos deste sofrer mutação, ou ainda por exposição do material genético a agentes mutagênicos,como, por exemplo, os radicais livres.
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O acúmulo desta proteína mutante é chamada de placas neuríticas. Suapresença é tóxica para os neurônios adjacentes, pois induz a entradadescontrolada de cálcio para dentro dos mesmos, o que dá início à cascataapoptótica através da ativação das caspases