método de sanger

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MÉTODO DE SANGER: o método de terminação de cadeia
Regiões de DNA com até 900 pares de base de comprimento são rotineiramente sequenciados pelo chamado método Sanger de sequenciamento ou método de terminação da cadeia. O método Sanger foi desenvolvido pelo bioquímico britânico Fred Sanger e seus colaboradores em 1977.
No Projeto Genoma Humano, esse método foi usado para determinar as sequências de muitos fragmentos relativamente pequenos de DNA humano. (Esses fragmentos não tinham necessariamente 900 pb ou menos, mas os pesquisadores conseguiam "caminhar" ao longo de cada fragmento usando diversas rodadas de sequenciamento por Sanger.) Os fragmentos foram alinhados com base nas porções de sobreposição compondo sequencias de regiões mais longas de DNA e, eventualmente, os cromossomos inteiros.
Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados usando outros métodos mais rápidos e baratos, o método Sanger ainda é extensamente usado para o sequenciamento de fragmentos individuais de DNA, como fragmentos usados na clonagem do DNA ou também, gerados pela reação de cadeia de polimerase (PCR).
· Ingredientes para o método de Sanger:
Visto que o método Sanger envolve a produção de muitas cópias de uma região alvo de DNA, os ingredientes desse método são similares àqueles usados para a replicação do DNA em um organismo, ou para a reação em cadeia da polimerase (PCR). São eles:
· Uma enzima DNA polimerase
· Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase
· Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
· O DNA molde a ser sequenciado
· Terminadores de cadeias para os quatro nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) cada um marcado com uma cor de corante diferente.
A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada em um tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). Os quatro nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com corantes são adicionados também, mas em concentração muito menor que a dos nucleotídeos comuns.
A mistura é primeiro aquecida para a desnaturação do DNA molde (separar as fitas), então resfriadas para que os primers possam se ligar ao molde de fita simples. Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é aumentada novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser adicionados, e, portanto a fita terminará em um dideoxinucleotídeo.
Este processo é repetido em um número de ciclos. Quando o ciclo se completa, é praticamente garantido que um dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do DNA alvo em pelo menos uma reação. Ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no DNA original. As extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que indicam o nucleotídeo final.
Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados através de um longo e fino tubo contanto uma matriz de gel em um processo chamado de electroforese capilar em gel. Pequenos fragmentos movem-se rapidamente através dos poros do gel, enquanto longos fragmentos movem-se mais devagar. Assim que cada fragmento cruza a "linha de chegada" no final do tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja detectado.
O menor fragmento (que termina apenas um nucleotídeo após o primer) atravessa a linha de chegada primeiro, seguido do próximo menor fragmento (terminando dois nucleotídeos após o primer), e assim por diante. Portanto, a partir das cores dos corantes registradas uma após a outra no detector, a sequência do pedaço original de DNA pode ser construída com um nucleotídeo por vez. Os dados registrados pelo detector consistem em uma série de picos em intensidade de fluorescência. A sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma.
 Os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores mais em cima. Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a fita completa de DNA.
· Aplicações do método Sanger:
Sequenciamentos são amplamente aplicados no diagnóstico de doenças genéticas, como a doença de Huntington e dificuldades reprodutivas (LÓPEZ-CARRASCO, 2013). Em 2014, Sun e colaboradores lançaram uma plataforma para auxiliar no tratamento de dados em testes genéticos laboratoriais. A ODS (Online Diagnosis System) é uma plataforma online gratuita que gera resultados de forma rápida e simplificada, e também é capaz de identificar variações em um único nucleotídeo (Single Nucleotide Variation, SNV).
A técnica de Sanger é aplicada também na indústria alimentícia: análises de patógenos, identificação dos componentes de um determinado alimento, e análises microbiológicas da água. Constituindo uma importante ferramenta no controle de qualidade e padronização dos alimentos comercializados.
Ainda hoje, esta técnica enfrenta alguns desafios, como a baixa qualidade de sequenciamento dos primeiros 15-40 nucleotídeos e dos posteriores a 700. Outro problema relativamente comum é a presença de traços genéticos dos microrganismos vetores de clonagem que acabam sendo amplificados junto com o fragmento alvo. Tentando sanar este último, aparelhos mais recentes que realizam o método One-step Sanger Sequencing, em que a amplificação e o sequenciamento ocorrem na própria máquina, amplificam fragmentos sem exigir clonagem ou PCR manual.
Em 2005, foi lançado o primeiro aparelho NGS (sequenciamento de nova geração): o GS 20 da empresa 454 Sequencing, atualmente afiliada da Roche. O aparelho, lançado à época, realizava sequenciamento por síntese, em que a leitura das bases ocorre simultaneamente à sua adição à cadeia em formação, permitindo um aumento de cem vezes no sequenciamento de DNA em relação à tecnologia mais recente de Sanger.
Inicialmente, porém, esta técnica produzia sequências de aproximadamente 100 pares de bases, enquanto que a de Sanger apresentava uma média de 750 bases. Hoje, os NGS já geram reads de tamanhos competitivos e se firmaram como cruciais para a “revolução genômica” que ocorreu nos últimos anos. Os sequenciadores da 454 Sequencing, por exemplo, evoluíram bastante na última década, o aparelho GS FLX Titanium realiza pirosequenciamento e é capaz de gerar reads de até 1 kb.
Ainda, o método de Sanger proporcionou dois prêmios Nobel em Química a Frederick Sanger que, como sua técnica, também alcançou a imortalidade científica. O Instituto Sanger, em Cambridge no Reino Unido, é referência em genômica mundial, onde a inovação de técnicas de sequenciamento não param. O sequenciamento de Sanger continua como padrão-ouro para o sequenciamento genético, tendo gerado impactos cruciais à Genética, à Genômica, à Ciência.