Cromatografia e eletroforese

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Universidade Federal do Tocantins
Curso de Ciências Biológicas
Disciplina de Biofísica
Métodos biofísicos de estudo: 
Cromatografia e Eletroforese
Prof. Gilvan Caetano Duarte
Cromatografia
 Definição: é a separação de substâncias
químicas pela partição delas entre dois meios;
 Fase estacionária (sólido ou líquido);
 Fase móvel (líquido ou gás).
 Aplicações
 Separação de misturas de compostos;
 Identificação, isolamento, purificação e
quantificação de compostos individuais;
 Monitoração de produtos químicos e bioquímicos.
Cromatografia
 Cromatografia de adsorção:
Fenômeno de superfície, adsorção
em partículas inertes. Com eluente
apropriado, a desadsorção é seletiva:
os menos adsorvidos saem primeiro.
Fase fixa: pó de carvão, sílica,
celulose e hidroxiapatita.
Cromatografia
 Cromatografia de partição:
Coeficiente de partilha. Diferença
de solubilidade em misturas de
solventes que se deslocam. Os
separandos mais solúveis migram
mais.
Cromatografia
Cromatografia
 Identificação de componentes
em uma mistura por
cromatografia de partição:
Distância percorrida pela substância
Rf = ____________________________
Distância percorrida pelo solvente
Cromatografia
 Cromatografia de troca iônica: Cargas
elétricas nos separandos e no suporte. As
moléculas mais atraídas se fixam mais. As
menos atraídas saem na frente.
Cromatografia
 Tipos de trocadores de íons:
 Trocadores catiônicos: cargas negativas;
 Trocadores aniônicos: cargas positivas.
Cromatografia
 Métodos de eluíção:
 Variação do pH do tampão;
 Aumento da força iônica da solução tampão;
 Eluíção por afinidade.
Cromatografia
Cromatografia
 Cromatografia de filtração em gel: Tamanho
das moléculas versus cavidades no suporte. As
moléculas menores entram nessas cavidades, e
se retardam. As maiores saem na frente.
Cromatografia
Cromatografia
 Cromatografia de exclusão molecular de proteínas:
Cromatografia
 Cromatografia de afinidade: É um tipo especializado de
cromatografia de adsorção em que um tipo específico de molécula
é covalentemente ligado a um suporte sólido inerte. Esta molécula
específica, o ligante, tem um alta afinidade de ligação para alguns
compostos na mistura de substâncias. O processo utiliza de uma
propriedade biológica da substância para ligar ao ligante de forma
reversível e específica, fornecendo alto grau de seletividade no
isolamento e purificação de moléculas biológicas.
Cromatografia
Cromatografia
Eletroforese
 Definição: é o movimento de moléculas
carregadas em um campo elétrico.
 Aspectos teóricos:
 A velocidade “v” de uma molécula carregada
em um campo elétrico é uma função da
intensidade de campo elétrico “E”.
v =
E x q
f
Onde:
v – velocidade de migração;
E – intensidade de campo 
elétrico;
q – carga elétrica;
f – coeficiente friccional;
Eletroforese
 O coeficiente friccional é uma medida do tamanho
hidrodinâmico de uma molécula.
 O tamanho molecular aumenta o coeficiente friccional;
 Quanto à forma:
 Pequenas moléculas – forma esférica;
 Grandes moléculas – formas diversas.
 A mobilidade de uma molécula é uma função do tamanho,
carga elétrica e forma.
Eletroforese
 Aplicações
 Estudos clínicos do plasma e líquido de mamíferos,
resolução de misturas complexas de proteínas, ácidos
nucléicos, aminoácidos e identificação de componentes;
determinação da pureza e homogeneidade molecular,
determinação do pI, genética molecular e inclusive
determinação da massa molecular de macromoléculas.
 A eletroforese e a veterinária.
 Eletroforese e a Biologia – Classificação Taxonômica.
Eletroforese
 Princípio qualitativo
 Princípio quantitativo
Eletroforese
 SDS-PAGE (Eletroforese em gel de poliacrilamida em
presença de Dodecil Sulfato de Sódio
Princípio:
Solubilização de proteínas em gel;
Independência do pH;
Complexo SDS-proteínas são distintos apenas pelo tamanho
molecular;
Complexo SDS-proteínas tem uma alta razão carga/massa.
Eletroforese
 SDS-PAGE
 As proteínas são separadas pelo tamanho em um campo
elétrico.
 As moléculas menores migram mais rapidamente através
da matriz porosa do gel.
Eletroforese
 Determinação de Mr e Gráfico logMr x Rf
Gel corado com
Coomassie Brilliant
Blue R-250
Gel corado com Nitrato 
de Prata