Relatórios Microbiologia

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Universidade Estadual de Goiás
Campus Anápolis de Ciências Exatas e Tecnológicas - Henrique Santillo 
Relatórios
Acadêmico: Diullio P. dos Santos
Disciplina: Microbiologia
Professor: Plínio Naves
Anápolis, 12 de dezembro de 2016
AP 1 – Normas de Biossegurança no Laboratório de Microbiologia
(01/08/2016)
Importância das normas de biossegurança
A normas de biossegurança são como um conjunto de medidas que busca minimizar os riscos que afetam o profissional que desempenha uma função assim como todos aqueles que podem causar danos ao meio ambiente e à saúde das pessoas.
Os microrganismos de estudo devem ser manipulados com precaução pelo seu potencial patogênico, por isso a importância das normas de biossegurança.
As normas técnicas de biossegurança têm como objetivo a proteção individual e coletiva. Isso garante uma viabilidade melhor para que seja trabalhado com tranquilidade e segurança, como é proposto. 
Ao se restringir a presença dos microrganismos em estudo a seus recipientes e meios de cultura evita se o risco de contaminação do manipulador ou companheiro de trabalho, assim como a contaminação do trabalho a ser estudado.
Uma das principais normas de biossegurança diz respeito à higienização das mãos. Elas sempre devem ser lavadas antes do preparo e manuseio no laboratório. Apesar de simples, essa é uma das medidas que mais evitam a propagação de doenças.
Sabendo disso, as normas nos laboratórios de microbiologia, irá ajudar em vários pontos, garantindo a viabilidade no processo de trabalho e segurança.
Então, é perceptível a importância do manejo com segurança dos itens a serem utilizados, trazendo viabilidade no processo de trabalho.
AP4 – Obtenção de cultivos puros 
(22/08/2016)
Resultados e discussão 
Esta aula teve como objetivo estudar as técnicas de isolamento de microrganismos a partir de uma população mista para obter um cultivo puro ou isolado.
Foi utilizado dois métodos para obtenção de um cultivo puro:
Isolamento por estriação;
Isolamento por semeadura de diluições seriadas
No Isolamento por estriação tratou-se de um método rápido e simples de esgotamento progressivo e continuo do inoculo sobre o meio sólido contido na placa de Petri.
O inoculo foi transferido a uma pequena área da superfície da placa, próxima a borda, e foi formado estrias próximas sempre no sentido da borda para o centro, numa região correspondente a 1/3 da placa.
A alça de platina foi passada rapidamente na chama, e foi realizada a segunda estriação em sentido perpendicular tocando a 1ª estriação apenas uma vez. A operação foi repetida para a 3ª estriação tocando uma vez na 2ª estriação.
Por fim, fez-se a incubação dos meios semeados a uma temperatura de 37 °C por 24h, para em seguida fazer-se a leitura. Dessa forma obteve-se que a bactéria S é gram negativa, a SA gram positiva e a Pa gram negativa. 
Figura 1 – Cultivo puro obtido pelo método de estriação.
Conclusão
	Observou-se que o método de esgotamento por estriação foi eficaz uma vez que obteve-se a partir de um elevado número de bactérias um número reduzido das mesmas, distribuído individualmente sobre a superfície da placa, onde cada uma das bactérias utilizadas originou uma colônia.
AP5 – Técnicas de microscopia e coloração de Gram 
(29/08/2016)
Resultados e discussão
Com o objetivo de preparar e observar cultivos bacterianos com diferentes técnicas de coloração que permitam o estudo das suas características morfológicas e estruturais, utilizou-se nesta aula prática a técnica de coloração de Gram.
Esta técnica consiste em fazer o esfregaço da amostra em uma lâmina de vidro, onde transferiu-se alíquotas da amostra com a alça de platina que serão estendidas diretamente sobre a lâmina. 
Utilizou-se dois tipos de bactérias: Staphylococcus áureas (amostra 1) e Escherichia coli (amostra 2), feito o procedimento igual para as duas.
 Após o esfregaço fez-se a coração com cristal violeta durante um minuto. Lavou-se suavemente com a água para eliminar o excesso do corante e adicionou-se lugol por um minuto, que atua como fixador, aumentando a afinidade do corante pela bactéria. Lavou-se com água o excesso de lugol, e gotejou-se a solução de álcool-acetona de forma contínua até que o esfregaço deixe desprender a cor e foi lavado com água corrente. Foi coberto com o corante de contraste, safranina, durante um minuto, e lavou-se com água e seca-se a temperatura ambiente.
Figura 2 – Técnica da coloração de Gram.
No microscópio as bactérias Gram-positivas aparecerão com uma coloração roxa ou violeta enquanto que as Gram-negativas com a cor rosa ou avermelhada. 
Figura 3 – Imagem obtida pelo microscópio visualizado a 1.000x de ampliação. 
 (1) Staphylococcus áureas (2) Escherichia coli.
 
Conclusão
A Staphylococcus aureas apresentou coloração roxa classificando-se em bactérias Gram-positivas e a Escherichia coli apresentou coloração vermelha classificando-se em bactérias Gram-negativa.
AP9 – Contagem do número de bactérias 
(05/09/2016)
Resultados e discussões
Nesta prática foi feita a contagem de microrganismos viáveis presente em uma amostra líquida utilizando a técnica de diluição seriada.
Foi realizada a diluição sucessiva de quatro amostras, denominadas diretas (D1 e D2), em condições de esterilidade com o objetivo de se inocular um volume conhecido dessas diluições em uma série de placas Petri, considerando que algumas das diluições permitiram a observação e a contagem das colônias isoladas na placa.
Retirou-se 0,5 mL da amostra D (direta) e diluiu-se no tubo 1 (diluição 10-1) após retirou-se 0,5 do tubo 1 e diluiu-se no tubo 2 (diluição 10-2) continuadamente até o tubo 6 (diluição 10-6), no total 6 diluições (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6). 
Fez-se o esfregaço dos sete tubos (D, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6) em placas de Petri, incubando-as por 24h a 37ºC.
Contando o número de colônias escolheu-se a placa que tinha entre 30 à 300 colônias. Tendo a diluição correspondente e o volume semeado da placa escolhida podemos calcular o número de unidades formadoras de colônia (ufc).
Na amostra D1 foi escolhida a placa 10-5 onde continha 41 colônias, fez-se o cálculo multiplicando o número de colônias contadas com o inverso da diluição da placa e o volume semeado (41x105x101) e obteve-se 4,13x107 ufc/mL e na amostra D2 foi escolhida a placa 10-5 onde continha 233 colônias, fez-se os cálculos (233x105x101) e obteve-se 2,3x108 ufc/mL.
Conclusão
Através da técnica de diluição seriada foi possível a partir do número de colônias presentes em cada diluição, calcular o número de bactérias por mL no cultivo original, sendo que a diluição em placas para contagem de ufc é uma das técnicas mais básicas e essenciais em bacteriologia.
AP12 – Efeitos das altas temperaturas sobre o crescimento microbiano
 (19/09/2016)
Resultados e discussões
Com o objetivo de avaliar o efeito e a resistência de um cultivo bacteriano a altas temperaturas foram feitas semeaduras em placas de Petri com diferentes tempos de inoculação em banho-maria.
Primeiramente foi transferido 100µL da amostra cultivada e semeou-se na placa de Petri, posteriormente foi feita a inoculação no banho-maria nos tempos t = 1 min, t = 5 min e t = 15 min, fazendo a semeadura na placa de Petri e foi incubada por 24h à 37ºC. Fez-se o processo para as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus.
Para a Escherichia coli as temperaturas foram, t1 = 62ºC, t5 = 59ºC e t15 = 58ºC.
No tempo zero não houve aparecimento de colônias, em 1 minuto apareceu 3 colônias, em 5 minutos pode-se observar muitas colônias e em 15 minutos houve uma diminuição de colônias comprovando o efeito da temperatura aos microrganismos. 
Figura 4 – Cultura da Escherichia coli. (1) Tempo 0; (2) Tempo: 1 minuto; (3) Tempo: 5 minutos e (4) Tempo: 15 minutos.
(1) (2) 
(3) (4) 
Na placa t15 observa-se quehouve uma contaminação, podendo ter sido durante a inoculação ou semeadura.
Conclusão
Conclui-se que a Escherichia Coli é um microrganismo mesófilo e tende a crescer melhor em temperaturas moderadas (entre 15 a 50 °C), e com o aumento da temperatura ela sofre efeitos letais que se deve principalmente aos danos causados à parede celular e também à desnaturação das proteínas e ácidos nucleicos.
AP13 – Efeitos de agentes químicos – desinfetantes e antissépticos (26/09/2016)
Resultados e discussões
Com o objetivo de determinar a eficácia do desinfetante de uso geral e desinfetante de hortifrutícolas e álcool como agentes antimicrobianos, utilizou-se soluções destes para testes. A determinação do efeito antisséptico dos diferentes produtos depende de um grande número de fatores externos, tais como, temperatura, umidade, pH, assim como dos diferentes tipos de microrganismos que se deseja eliminar ou controlar.
Neste trabalho analisa-se além dos resultados obtidos, a influência dos princípios ativos dos mesmos. 
O desinfetante de uso geral possui como princípio ativo o hipoclorito de sódio, o desinfetante de hortifrutículas, hipoclorito de sódio e 0,96% de p/p de cloro ativo, e álcool 92,8% com princípio ativo o etanol.
Todos os produtos analisados demonstraram potencial inibidor do crescimento dos microrganismos testados, porém com diferentes níveis de eficácia.
A turbidez do tubo representa um sinal positivo para o crescimento bacteriano. 
O procedimento foi executado nos tempos 5, 15 e 30 minutos.
Tabela 1 – Potencial de inibição para a Escherichia Coli.
	Tempo de ensaio
	DUG
	DH
	Álcool
	5
	+
	-
	-
	15
	+
	-
	-
	30
	+
	-
	-
Sendo DUG - desinfetante de uso geral, DH – desinfetante de hortifrutícolas.
O desinfetante de uso geral para Escherichia Coli não se mostrou eficaz em nenhum dos tempos uma vez que houve sinal positivo para turbidez, ao contrário do desinfetante de hortifrutícolas e o álcool se mostraram eficazes.
Tabela 2 – Potencial de inibição para a Staphylococcus Aureus.
	Tempo de ensaio
	DUG
	DH
	Álcool
	5
	+++
	+
	-
	15
	+++
	-
	-
	30
	+++
	-
	-
O desinfetante de uso geral para Staphylococcus Aureus não se mostrou eficaz uma vez que houve sinal positivo de C+ (100%) para turbidez, o desinfetante de hortifrutícolas em 5 minutos não foi tão eficaz, já em 10 e 30 minutos se mostrou eficaz. O álcool se mostrou eficaz em todos os tempos.
Conclusão
O experimento comprova os efeitos dos agentes químicos, como desinfetantes e antissépticos, podendo observar que nem todos os agentes químicos são eficazes mesmo ao decorrer do tempo, isso se deve a alguns fatores como o princípio ativo analisado.
AP11 – Antibiograma 
(03/10/2016)
Resultados e discussões
Com o objetivo de determinar a sensibilidade bacteriana a distintos antibióticos mediante a técnica de Kirby-Bauer, confronta-se a bactéria inoculada na superfície do ágar com uma solução antibiótica absorvida em discos de papel de filtro 
Partiu-se de um cultivo puro e transferiu-se 3 colônias das bactérias, Escherichia coli e Staphylococcus epidermidis.
A turbidez do inoculo equivaleu-se ao estândar de 0,5 McFarland (aproximadamente 1,5.108 UFC/mL). 
Figura 5 – Placa inoculada com Escherichia coli.
Os diâmetros dos halos de inibição se traduzem em categorias: resistente (R), intermediário (I) ou sensível (S). 
Após a incubação os diâmetros dos halos foram medidos com uma régua, segue as tabelas com os resultados obtidos:
Tabela 3 – Resultados da Escherichia coli.
	Discos de antibióticos
	Símbolo -
	Comprimento do halo de inibição (mm)
	Padrão de resistência
	Ciprofloxacina
	CIP -5
	45
	S
	Gentamicida
	GEN - 10
	25
	S
	Ácido Pipemidico
	PIP - 20
	30
	S
	Cloranfenicol
	CLO - 30
	23
	S
	Neomicina
	NEO - 30
	25
	S
	Amoxilina
	AMO - 10
	11
	R
	Doxiciclina
	DOX - 30
	34
	S
	Amicacina
	AMI- 30
	26
	S
	Estreptomicina
	EST - 10
	19
	I
Tabela 4 – Resultados da Staphylococcus epidermidis.
	Discos de antibióticos
	Símbolo -
	Comprimento do halo de inibição (mm)
	Padrão de resistência
	Bacitracina
	BAC - 10
	30
	S
	Ampicilina
	AMP - 10
	27
	R
	Penicilina
	PEN - 10
	30
	S
	Amoxilina
	AMO - 10
	28
	S
	Rifampicina
	RIF - 30
	60
	S
	Ciprofloxacina
	CIP - 5
	44
	S
	Cloranfenicol
	CLO - 30
	40
	S
	Gentamicina
	GEN - 10
	38
	S
Vários fatores afetam o tamanho do halo de inibição, a difusão do antibiótico no meio de cultivo, o tamanho do inoculo bacteriano, a velocidade do crescimento bacteriano, tempo de incubação.
Conclusão
Através do experimento foi possível determinar os padrões de resistência das bactérias de acordo com os antibióticos utilizados, podendo analisar os dados através do tamanho do halo de inibição e estudando os fatores que interferem na alteração de tamanho deste.
AP14 – Análise microbiológica da contaminação ambiental 
(10/10/2016)
Resultados e discussões
Com o objetivo de determinar o grau de contaminação ambiental, vamos analisar os microrganismos presentes no ar do laboratório de enzimologia e na superfície da pia do banheiro masculino da UEG.
Para a análise do ar, pegou-se três placas de Petri e deixou-se aberto no laboratório de enzimologia. A primeira placa deixou-se aberto por 15 minutos, a segunda por 30 minutos e a terceira por 60 minutos. Quando cada tempo fosse atingido as placas foram tampadas e incubadas durante 24-48 horas a 37 °C.
Figura 6 – Contaminação do ar no laboratório de enzimologia nos tempos de 15, 30 e 60 minutos. 
Observou que há contaminação no ar do laboratório e que o nível de contaminação varia com o tempo, aumentando a quantidade de microrganismos sedimentados sobre a placa quanto mais tempo em contato mais microrganismos sedimentados sobre a placa, isso pode causar infecções no ser humano como patologias respiratórias entre outras. 
Para análise da superfície delimitou-se a área de 9 cm2 com o uso da moldura de papel alumínio na pia do banheiro masculino, umedeceu-se o swab em 10 ml de solução salina estéril e esfregou-se várias vezes sobre a superfície delimitada. O swab foi introduzido no tubo com solução salina e deixado durante 15-30 min de maneira que os microrganismos sejam liberados. Inoculou-se diretamente o caldo em placas de Petri com ágar e em diluições seriadas de 10-1, 10-2 e 10-3 e incubou-se durante 24-48 horas a 37°C.
A placa de diluição 10-2 (Figura 10) foi escolhida para contagem de colônias que foi igual à 37 assim foi feito o cálculo em ufc/9cm2:
Colônias x diluição positiva x volume semeado = 3,7x104 ufc/9cm2.
Figura 7 – Placa da diluição 10-2.
Conclusão
A eficácia do experimento foi comprovada mostrando a contaminação ambiental e também na determinação do tipo de microrganismo presente nos locais analisados. 
AP15 - Contagem de microrganismos viáveis em manipuladores de alimentos
 (17/10/2016)
Resultados e discussões
Com objetivo de conhecer a técnica de contagem em placa e avaliar o efeito da lavagem de mãos na contagem de microrganismos viáveis em manipuladores de alimentos, analisamos se uma pessoa que processa um alimento pode ser uma fonte ou não de contaminação dos alimentos, uma vez que o manipulador pode ter uma carga microbiana na pele de suas mãos.
Introduziu-se as mãos do voluntário em um saco plástico, disseminou-se 20ml de solução fisiológica estéril de maneira asséptica para evitar contaminações ambientais e lavou-se as mãos conforme o procedimento básico de lavagem de mãos. 
Posteriormente foi transferida 5 mL da solução a um tubo estéril, fez-se diluições seriadas de 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 e inoculou em placas de Petri com ágar, incubando as placas a 37ºC por 24h. Repetiu-se o processo depois da lavagem de mãos com água corrente e em seguida de antissepsia com álcool 70%.
As placas de diluição escolhida antes da lavagem foram a de 10-3 que continha 44 colônias e fez-se o cálculomultiplicando o número de colônias contadas com o inverso da diluição da placa e o volume semeado (44x103x101) obtendo 440000 ufc/mL e a placa de diluição escolhida depois da lavagem foi de 10-2 que continha 5 colônias fez-se o cálculo (5x102x101) obtendo 5000 ufc/mL.
Conclusão
A técnica utilizada mostra-se eficaz uma vez que pode-se contar o número de colônias antes e depois da lavagem das mãos. A diminuição de ufc/mL antes e depois da lavagem foi muito significativa demostrando assim que é importante sempre manter as mãos lavadas diminuindo o risco de contaminações.
AP – Contagem direta e determinação da viabilidade celular em leveduras (31/10/2016)
Resultados e discussões
Com o objetivo de proceder a contagem das leveduras totais e viáveis em amostras de cultivo puro e misto, a técnica de coloração com azul de metileno foi utilizada para estimar a proporção de células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo.
 A porcentagem de células viáveis ou mortas foi determinada transferindo-se para câmera de Neubauer com uma pipeta uma solução contendo 0,3 mL uma amostra das bactérias Pseudomonas aeruginosa e 0,3 mL de azul de metileno e deixou-se descansar por 2 minutos para a fixação do azul de metileno nas células mortas. 
A câmera de Neubauer trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm2 de área (Figura 14), a lâmina é coberta com uma lamínula, que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3 (equivalente a 1 mL) onde foi preenchida com toda solução transferida. 
Após todo procedimento foi feito a contagem de células viáveis ou mortas através da observação microscópica, onde as células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentaram coloração azul. 
Fez-se o procedimento para amostras de cultivo puro e amostras de cultivo misto.
Figura 8 – Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno
Figura 9 – Área da câmera de Neubauer.
A contagem foi feita na segunda e quarta coluna na área centralizada da câmera de Neubauer, vista pelo microscópio para a amostra pura e primeira e terceira coluna para amostra mista.
Contou-se células isoladas como uma célula grumos constituídos por células facilmente distinguíveis por seus núcleos e citoplasmas como grupos de células isoladas contando cada célula.
Para a amostra pura pode-se contar 300 células totalizando 75,4% de células viáveis (226 células) 24,6% de células mortas (74 células), conforme o quadro 1 ilustrando a área da câmera de Neubauer.
Quadro 1 – Contagem da amostra pura, cor vermelha células viáveis e cor azul células mortas.
	Coluna 1
	Coluna 2
	Coluna 3
	Coluna 4
	Coluna 5
	
	4
18
	
	26
3
	
	
	31
11
	
	24
5
	
	
	24
5
	
	33
7
	
	
	31
3
	
	20
4
	
	
	20
2
	
	14
15
	
Para a amostra mista pode-se contar 539 células totalizando 87,76% de células viáveis (473 células) 12,24% de células mortas (66 células), conforme o quadro 2.
Quadro 2 – Contagem da amostra mista, cor vermelha células viáveis e cor azul células mortas.
	Coluna 1
	Coluna 2
	Coluna 3
	Coluna 4
	Coluna 5
	 63
8
	
	62
5
	
	 
	 53
7
	
	50
5
	
	 
	 42
9
	
	46
9
	
	 
	 23
7
	
	52
8
	
	 
	 42
2
	
	40
6
	
	 
Conclusão
A análise se mostrou eficiente uma vez que pode-se determinar as células viáveis e mortas. A morfologia das células é extremamente importante no controle da viabilidade celular sendo utilizada nos processos de produção de levedura e fermentação alcoólica.
AP16 – Análises microbiológicas da água 
(07/10 – 21/10 - 28/10/2016)
Resultados e discussões
Com o objetivo de determinar a presença de coliformes e obter índices como o possível número presente em uma amostra, foram coletadas duas amostras, água 1 foi coletada no bebedouro ao lado da biblioteca e a amostra 2 ao lado da xerox na UEG. O procedimento foi realizado para ambas amostras.
No teste presuntivo homogeneizou-se a amostra de água a ser testada 25 vezes. Após inoculou-se 10 mL em 5 tubos com caldo de lactose de dupla concentração, 1 mL em 5 tubos com caldo lactose de concentração normal e 0,1 mL de água em 5 tubos com lado de lactose de concentração normal, homogeneizou-se cada tudo cuidadosamente com as palmas das mãos, incubou-se as séries de tubos por 24 a 48 horas à 35ºC. 
Na formulação do caldo de lactose contém enzymatic digest of gelatina, lactose, beef extract. Este caldo é um meio de enriquecimento e seletivo para bactérias Gram-negativas, e é usado para a detecção de bactérias coliformes em água, alimentos e laticínios. A lactose serve como fonte de carbono a ser fermentada pelos coliformes, com produção de ácido e gás. 
Após a incubação fez-se as contagens dos tubos que continha gás comprovando assim que a água possui coliformes. Para amostra 1 a primeira série teve 5 tubos contendo gás, a segunda 2 tubos e a terceira série nenhum tubo continha gás, segundo a consulta na tabela Most Probable Number (MPN) desenvolvida pela Associação Americana de Saúde Pública se tem 49 ufc/100 mL. Para a amostra 2 a primeira série teve 5 tubos contendo gás, a segunda 2 tubos contendo gás e a terceira série nenhum tubo continha gás, assim tendo também 49 ufc/100 mL.
Figura 10 – Tubo com a maior presença de gás da amostra 1.
No teste confirmativo escolheu-se o segundo tubo diluído de 10 mL, para ambas amostras, que continha a maior produção de gás e fez-se a inoculação com uma alça em um tubo de caldo VBBL e incubou-se por 48h ± 3h a 35ºC. 
Na formulação do caldo VBBL (Caldo verde brilhante) contém enzymatic digest of gelatin, lactose, oxbile e brilliant green. Os sais biliares e o corante verde brilhante impedem a proliferação da flora Gram-positiva e a lactose serve como fonte de carbono a ser fermentada pelos coliformes, com produção de ácido e gás.
Como esperado, foi confirmado a presença de coliformes com a formação de gás nos tubos do gás VBBL tanto para a amostra 1 quanto para a 2.
Figura 11 – Tubos com caldo VBBL com produção de gás (Esquerda amostra 1 e da direita amostra 2).
Por fim no teste completo partindo-se do caldo VBBL, inoculou-se a solução em placa de ágar EMB e incubou-se por 24h à 35ºC. 
Na formulação do caldo EMB contém enzymatic digesto of gelatina, lactose, dipotassium phosphate, eosin y, methylene blue e ágar. O caldo serve como um meio para a diferenciação ligeiramente seletivo para o isolamento de bacilos entéricos Gram-negativo. Seletivo por inibir as células Gram-positivas devido ao azul que metileno que favorece as Gram-negativas, diferencial por conter lactose e eosina que distingui bactérias fermentadoras de lactose que diminuem o pH e as colônias tem o centro escuro, aquelas que não fermentam a lactose apresentam colônias de cor meio purpura.
Figura 12 – Estriação feita no caldo VBBL (esquerda amostra 1 e da direita amostra 2)
Na amostra 1 pode-se observar 4 tipos de colônias: gomosa vinho brilhante, característica do gênero Klebsiella, ressecada plana escura, característica do gênero Enterobacter, rosa salmão, característica do gênero Citrobacter e vinho escuro, característica do gênero Escherichia por apresentarem colônias com o centro preto. 
Na amostra dois pode-se observar 3 tipos de colônias, ressecada plana escura, característica do gênero Enterobacter, rosa salmão, característica do gênero Citrobacter e vinho escuro, característica do gênero Escherichia por apresentarem colônias com o centro preto.
Conclusão
A técnica se mostra eficaz uma vez que pode-se fazer a análise da água nas amostra 1 e 2. A água coletada teve um resultado positivo para a presença de coliformes, em números bastantes expressivos, considerando que para a água destinada ao consumo humano deve apresentar 0 ufc/100mL.