calreticulina - cDNA - PUC

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X Salão de Iniciação Científica – PUCRS, 2009 
 
 
X Salão de 
Iniciação Científica 
PUCRS 
 
 
Clonagem e expressão do cDNA da calreticulina humana e 
utilização da proteína recombinante na identificação de 
autoanticorpos. 
 
Bruna F. Leal
1
, Natasha R. Soares, Sílvia D. de Oliveira
1
, Carlos Alexandre S. Ferreira
1
 
 
1Laboratório de Imunologia e Microbiologia, Faculdade de Biociências, PUCRS. 
 
 
 
Introdução 
A calreticulina é uma proteína altamente conservada, encontrada na maioria das 
espécies e em todos os tipos de células nucleadas (Coppolino & Dedhar, 1997). 
Autoanticorpos contra a calreticulina têm sido encontrados em pacientes com doenças 
autoimunes, como lupus eritematoso sistêmico (Eggleton et al, 1997; Eggleton & Llewellyn, 
1999), artrite reumatóide (Routsias et al, 1993), síndrome de Sjögren´s (Eggleton et al, 2000) 
e doença celíaca (Sanchez et al, 2000), sendo que o reconhecimento destes autoanticorpos 
ocorre em diferentes domínios da proteína (domínio N-terminal, domínio P e domínio C-
terminal). Os autoanticorpos contra a calreticulina de pacientes com lupus eritematoso 
reconhecem o domínio N-terminal (Eggleton et al, 2000), enquanto que os de pacientes com 
doença celíaca reconhecem especificamente o domínio P (Krupicková et al, 1999) e os 
autoanticorpos de pacientes com carcinoma hepatocelular ligam-se ao domínio C-terminal 
(Pike et al, 1999). 
 O projeto tem como objetivo o desenvolvimento de um teste ELISA, a partir da 
clonagem e expressão de cDNA da calreticulina humana para a detecção de autoanticorpos 
contra a proteína recombinante. 
 
 
Metodologia 
 As amplificações dos fragmentos de cDNA já foram concluídas por RT-PCR. A 
clonagem dos mesmos será realizada em vetor de procariótico e sua expressão em cepas de E. 
coli. A purificação das proteínas recombinantes ocorrerá por cromatografia de afinidade e, se 
necessário, por cromatografia em troca iônica. O grau de pureza da proteína recombinante 
será verificado por eletroforese em gel de acrilamida 10% e corando com coomassie-blue. Por 
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fim, Western-blot e ELISA serão feitos a partir de soros de pacientes com doença autoimune e 
indivíduos saudáveis para a detecção dos autoanticorpos contra a calreticulina recombinante. 
 
Perspectivas 
A detecção de autoanticorpos contra a calreticulina humana, por ELISA, deve ser 
utilizada para auxiliar no diagnóstico de muitas doenças autoimune. Os testes sorológicos 
atuais para a obtenção do diagnóstico não apresentam valores acessíveis para a maior parte da 
população, desta forma, essa nova metodologia teria menor custo, além de apresentar maior 
especificidade, pois seria possível utilizar como antígeno apenas o domínio da proteína que é 
reconhecido pelos autoanticorpos de determinada doença autoimune. 
 
 
Referências 
 
Coppolino, M., Dedhar, S. Calreticulin. International Journal of Biochemistry & Cell 
Biology, 30: 553-558, 1998. 
Eggleton, P., Reid, K. B., Kishore, U., Sontheimer, R. D. Clinical relevance of calreticulin in 
systemic lupus erythematosus. Lupus, 6: 564-571, 1997. 
Eggleton, P., Llewellyn, D. H. Pathophysiological roles of calreticulin in autoimmune disease. 
Scandinavian Journal of Immunology, 49: 466-473, 1999. 
Eggleton, P., Tenner, A.J., Reid, K.B. C1q receptors. Clinical Experimental Immunology, 
120: 406-412, 2000. 
Krupickova, S., Tuckova, L., Flegelova, Z., Michalak, M., Walters, J. R., Whelan, A., 
Harries, J., Vencovsky, J., Tlaskalova-Hogenova, H. Identification of common epitopes 
on gliadin, enterocytes, and calreticulin recognised by antigliadin antibodies of patients 
with celiac disease. Gut, 44: 168-173, 1999. 
Pike, S.E., Yao, L., Setsuda, J., Jones, K.D., Cherney, B., Appella, E., Sakagushi, K., 
Nakashi, H., Atreya, C.D., Teruya-Feldstein, J., Wirth, P., Gupta, G., Tosato, G. 
Calreticulin and calreticulin fragments are endothelial cell inhibitors that suppress 
tumor growth. Blood, 94: 2461-2468, 1999. 
Routsias, J.G., Tzioufas, A.G., Sakarellos-Daitsiotis, M., Sakarelos, C., Moutsopoulos, H.M. 
Calreticulin synthetic peptide analogues: anti-peptide antibodies in autoimmune 
rheumatic diseases. Clinical and Experimental Immunology, 91: 437-441, 1993. 
Sanchez, D., Tuckova, L., Sebo, P., Michalak, M., Whelan, A., Sterzl, I., Jelinkova, L., 
Havrdova, E., Imramovska, M., Benes, Z., Krupickova, S., Tlaskalova-Hogenova, H. 
Occurrence of IgA and IgG autoantibodies to calreticulin in coeliac disease and various 
autoimmune diseases. Journal of Autoimmunity, 15: 441-449, 2000. 
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