Atividade 1, BIOLOGIA MOLECULAR UEM

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Atividade I
Responda as seguintes questões:
1) Faça um resumo (pequeno texto) do artigo em anexo, indicando os objetivos, metodologia, resultados obtidos e conclusão do autor a respeito do trabalho. 
O estudo objetivou o isolar e caracterizar o cDNA do sbGnRH no cérebro do linguado, identificar em quais tecidos este gene é expresso e comparar a expressão gênica no cérebro do sbGnRH em linguados juvenis e adultos. Para tanto, adotou os seguintes procedimentos metodológicos: 
Inicialmente foram utilizados dois linguados machos adultos para a clonagem do sbGnRH a partir do RNA do cérebro, fez-se pra tanto, o isolamento do RNA total, em seguida realizou-se um tratamento com DNase, utilizou-se 2 microgramas de RNA prosseguiu-se para a síntese de cDNA a partir da enzima Transcriptase Reversa, em seguida e ampliação do DNA através de PCR, cujo produtos das reações foram sequenciados no sequenciador automático. 
Para a avalição da distribuição dos tecidos do sbGnRH, foram necessárias amostras de brânquias, coração, intestino, fígado, baço, rins, músculos, estômago, testículos e cérebro foram coletadas e seguiu-se os procedimentos adotados anteriormente para extração de RNA total, tratamento com DNase e a síntese de cDNA. Os produtos de PCR foram submetido à eletroforese em géis de agarose 1% 0,5μgml-1 de brometo de etídio.
Já para a avaliação dos efeitos do estádio de maturação na expressão gênica do sbGnRH no cérebro foi realizada em cinco machos juvenis e em cinco machos adultos. Os peixes foram mantidos em um mesmo tanque, durante três semanas para aclimatação. Todos os peixes foram alimentados uma vez ao dia com ração comercial. Ao término da aclimatação, os exemplares foram aleatoriamente amostrados. Os animais foram anestesiados, eutanasiados, e a coleta das amostras de hipotálamo foram realizadas como descrito anteriormente. A extração de RNA total, o tratamento com DNase e a síntese de cDNA foram realizadas como descrito anteriormente. A análise da expressão gênica foi realizada por meio de RT-PCR semiquantitativa, sendo utilizada a β-actina. Para o sbGnRH, foram usados 27 ciclos, e para o controle interno β-actina, 32 ciclos. Todas as amostras foram submetidas à eletroforese e aplicadas no mesmo gel para posterior comparação. Para densidade óptica das bandas, usou-se o software TotalLab TL 100 (Nonlinar Dynamics, Inglaterra). A taxa de densidade óptica sbGnRH/β-actina foi utilizada para o cálculo de expressão gênica. Os dados referentes à expressão gênica no hipotálamo de linguados juvenis e adultos foram comparados por meio do teste t e nível de significância estabelecido em P<0.05. 
O estudo obteve como resultados: a) a expressão do sbGnRH em tecidos periféricos nos órgãos estômago, fígado, intestinos, rins, baço, coração, testículos, brânquias e cérebro; b) níveis mais elevados de RNAm do sbGnRH no hipotálamo dos animais adultos. 
 De acordo com os autores do estudo, a clonagem do cDNA do sbGnRH do linguado P. orbignyanus foi obtida com êxito. Foi identificada a expressão do sbGnRH para além do sistema nervoso central, no estômago, fígado, intestinos, rins, baço, coração, testículos, brânquias e cérebro. Machos adultos revelaram maior expressão do sbGnRH, indicando que este está associado à puberdade da espécie, porém deve desempenhar funções ainda desconhecidas em tecidos periféricos, onde se expressa. Por fim, os resultados apresentados no trabalho apontaram que o sbGnRH está envolvido na maturação testicular no P. orbignyanus.
2) Responda
1. Qual a importância da obtenção, clonagem e estudo de um cDNA?
Ao fazer cópia de DNA utilizando RNA mensageiro como molde, apenas a região codificadora de um gene eucarioto é obtida, ou seja, a sequência que tem a informação final para a codificação de uma proteína. Pois, os íntrons já foram removidos, ou seja, o mRNA já passou pelo processo de splicing, sendo esta, uma reação catalisada pela enzima transcriptase reversa. Desta forma, revela-se a principal importância para o uso desta técnica, pois grande parte dos estudos em Biologia Molecular é realizado em bactérias, expressando-se e purificando proteínas de eucariotos neste organismo (já que microrganismos procariotos (bactérias) não possuem essas sequências intervenientes, e não possuem mecanismo para retirada dos íntrons). Assim, o cDNA poderá ser clonado e também, por meio da PCR, ser duplicado e amplificado para estudos de expressão gênica.
2. Relacione as Ferramentas da TDR ministradas na disciplina, que foram usadas pelos pesquisadores no trabalho científico.
No estudo utilizado como base dessa atividade foi possível identificar as seguintes ferramentas da TDR:
Transcriptase reversa – necessária para catalisar a formação de uma fita de DNA (cDNA), a partir de um molde de RNA fita simples e de um iniciador. Essa enzima foi empregada para a obtenção de um cDNA;
A Enzima de Restrição – DNase (Desoxirribonuclease) - endonuclease que degrada DNA fita simples ou dupla. Pode ter sido usada para a remoção de DNA nas preparações de RNA.
REFERÊNCIAS CONSULTADAS
CAMPOS, V. F. et al. Clonagem e avaliação da expressão gênica do sbGnRH em machos juvenis e adultos de linguado, Paralichthys orbignyanus. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 63, n. 1, p. 239-246, 2011.
CALEFEE, R. B. T. et al. Clonagem de genes: métodos e aplicações. Revista Uningá, v. 47, p. 73-77, 2016.