Peroxidação lipidica mecanismos e avaliação em amostras

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Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas
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Dulcineia Sp Abdalla
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Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences
vol. 37, n. 3, set./dez., 2001
Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas
Émersom Silva Lima, Dulcineia Saes Parra Abdalla*
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade
de São Paulo
O processo de peroxidação lipídica é iniciado pela reação de um
radical livre com um ácido graxo insaturado e propagada por
radicais peroxilas. Resulta na formação de hidroperóxidos lipídicos
e aldeídos, tais como o malondialdeído, 4-hidroxinonenal e
isoprostanos, que podem ser detectados em amostras biológicas e
utilizados para se avaliar o estresse oxidativo. Nesta revisão são
discutidos os principais mecanismos que induzem o processo de
peroxidação lipídica, assim como as principais metodologias
utilizadas para sua mensuração em sistemas biológicos.
* Correspondência:
D.S.P. Abdalla
Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas
FCF/USP
Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 17
05508-900 – São Paulo – Brasil
E-mail: dspa@usp.br
Unitermos:
• Peroxidação lipídica
• Radicais livres
• Espécies reativas de
• oxigênio e nitrogênio
• Hidroperóxidos lipídicos
• Malondialdeído
• Isoprostanos
INTRODUÇÃO
Efeitos tóxicos do oxigênio sobre componentes bi-
ológicos já eram conhecidos no final de século XIX
(Lorrain-Smith, 1899), tornado-se objeto de intensa inves-
tigação científica nos últimos anos (Halliwell, 2000). Es-
tes efeitos são resultantes da oxidação de componentes
celulares como tióis, cofatores enzimáticos, proteínas,
nucleotídeos e lípides, principalmente ácidos graxos
poliinsaturados (AGPI), mediada por espécies reativas de
oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN),
conhecidas genericamente como radicais livres (RL)
(Giller, Sigler, 1995; Romero et al., 1998). A reação des-
tas espécies com os AGPI, presentes nas membranas ce-
lulares e nas lipoproteínas, inicia um processo em cadeia
conhecido como peroxidação lipídica ou lipoperoxidação
(LPO), que pode ser avaliado e utilizado como um indica-
dor do estresse oxidativo celular.
Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
Um radical livre é qualquer espécie capaz de existên-
cia independente que contenha um ou mais elétrons
desemparelhados (Haliwell, 1987). As ERO incluem todos
os radicais do oxigênio, como o ânion radical superóxido
(O2
•-), radical hidroxila (HO•), radical alquila (L•), alcoxila
(LO•) e peroxila (LOO•)(Barber, Bernheim, 1967; Change,
Sies, Boveris, 1979). Nas ERN estão incluídos além do
peroxinitrito (ONOO-), o óxido nítrico (•NO) e o radical
dióxido de nitrogênio (•NO2) (Eiserich, Patel, O’donnell,
1998; Hogg, Kalyanaraman, 1999). O ânion peroxinitrito
(ONOO-), o ácido hipocloroso (HOCl), o peróxido de hidro-
gênio (H2O2), o oxigênio singlete (
1O2) e o ozônio (O3) não
são radicais livres, mas podem induzir reações radicalares
no organismo, sendo por isso também considerados como
espécies reativas (Porter, 1984; Benzie, 1996; Patel, 1999).
Os RL estão relacionados com variedade de doen-
ças, incluindo câncer, doenças hepáticas, aterosclerose e
envelhecimento (Esterbauer et al., 1992; Chirico et al.,
1993; Moriel et al., 1999; Chisolm, Steinberg, 2000). Na
maioria das vezes esta relação se dá pela propriedade que
os RL têm de reagir com os AGPI, servindo como inicia-
dores do processo de peroxidação lipídica ou lipope-
roxidação (LPO). Contudo, estes podem participar tam-
bém de processos fisiológicos como a geração de
eicosanóides, fagocitose e diversas vias de transdução de
sinais (Baber, Harris, 1994; Aruoma, 1998).
O processo de peroxidação lipídica
A LPO pode ser definida como uma cascata de
eventos bioquímicos resultante da ação dos RL sobre os
E. S. Lima, D. S. P. Abdalla294
lípides insaturados das membranas celulares, gerando
principalmente L•, LO• e LOO•, levando à destruição de
sua estrutura, falência dos mecanismos de troca de
metabólitos e, numa condição extrema, à morte celular
(Benzie, 1996). A LPO talvez se constitua no evento
citotóxico primário que desencadeia seqüência de lesões
na célula. As alterações nas membranas levam a transtor-
nos da permeabilidade, alterando o fluxo iônico e o fluxo
de outras substâncias, o que resulta na perda da seletivi-
dade para entrada e/ou saída de nutrientes e substâncias
tóxicas à célula, alterações do DNA, oxidação da LDL e
comprometimento dos componentes da matriz extra-
celular (proteoglicanos, colágeno e elastina) (Vaca,
Wilhem, Harms-Ringdahl, 1988; Baber, Harris, 1994).
Basicamente, a LPO consiste na incorporação de
oxigênio molecular a um AGPI para produzir um
hidroperóxido lipídico (LOOH) como produto primário
inicial. Nos sistemas biológicos a LPO pode ocorrer prin-
cipalmente por duas vias: (i) uma via enzimática envol-
vendo as ciclooxigenases e lipoxigenases na oxigenação
dos AGPI e (ii) a peroxidação não enzimática, que envolve
a participação de ROS, RNS, metais de transição e outros
radicais livres (Al Mehdi et al., 1993; Porter et al., 1995).
O início da oxidação dos AGPI requer um oxigênio
na forma ativada. O estado fundamental do oxigênio (3O2)
é um estado triplete com dois elétrons não pareados de
mesmo spin, mas em diferentes orbitais. O oxigênio ele-
tronicamente excitado corresponde a um estado singlete
(1O2) apresentando um par de elétrons na camada eletrô-
nica externa (1Δ) em um primeiro estado de excitação, ou
apresentando um elétron em cada orbital com spins opos-
tos (1∑), num segundo estado energético. A vida média
deste segundo estado (10-11 s) é muito mais curta que a do
primeiro (10-6 s), sendo por isso menos estável. Assim, o
termo oxigênio singlete se refere principalmente ao esta-
do 1Δg O2 (Di Mascio et al., 1995). Simplificando, a rea-
ção do oxigênio triplete com um ácido graxo insaturado é
limitada devido à restrição de spins. Essa restrição não
existe quando o oxigênio molecular está na forma de oxi-
gênio singlete, ou parcialmente reduzido ou ativado, como
H2O2, O2
•-, HO•, complexos ferro-oxigênio, assim como,
na clivagem homolítica dos hidroperóxidos mediada por
ferro e outros metais de transição (Hsieh, Kinsella, 1989).
O processo da LPO pode ser dividido em três etapas:
iniciação, propagação e terminação (Figura 1). A fase de
iniciação representa o início da peroxidação, em que o
AGPI sofre ataque de uma espécie que é suficientemente
reativa para abstrair um átomo de hidrogênio a partir de
um grupo metileno (-CH2-), formando um radical de car-
bono. Este radical é estabilizado por um rearranjo
molecular para formar um dieno conjugado, ou seja, duas
duplas ligações intercaladas por uma ligação simples
(Halliwell, Gutteridge, 1999). Em meio aeróbio, o radical
alquila inicialmente formado se combina com o oxigênio
formando o radical peroxila, o qual pode abstrair um hi-
drogênio alílico de um outro ácido graxo, gerando outro
FIGURA 1 - Esquema das principais reações ocorridas durante o processo de peroxidação lipídica.
Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas 295
radical de carbono e promovendo a etapa de propagação.
A reação do radical peroxila com o átomo de hidrogênio
abstraído gera um hidroperóxido lipídico (LOOH).
Peróxidos cíclicos também podem ser formados, quando
o radicalperoxila reage com uma dupla ligação na mesma
cadeia de ácido graxo, o que também pode propagar a
LPO (Halliwell, Gutteridge, 1999).
Íons de metais de transição, como Fe n+ e Cu n+,
podem participar do processo catalisando a formação de
radicais lipídicos alcoxila, peroxila e hidroxila a partir dos
hidroperóxidos, conforme demonstrado nas reações 1 e 2:
 (1) LOOH + M n+ → LO• + HO- + M n+1 reação 1
 (2) LOOH + M n+1 → LOO• + H+ +Mn+ reação 2
A terceira e última etapa da reação, a fase de termina-
ção, dá-se pela aniquilação dos radicais formados originan-
do produtos não radicalares (Gardner, 1989; Halliwell,
Gutteridge, 1999 ). Os radicais peroxila e alcoxila também
podem: sofrer dismutação ou clivagem b formando
aldeídos; formar uma ligação covalente com resíduos de
aminoácidos ou sofrer um rearranjo formando produtos
secundários da LPO (derivados hidroxi-, ceto-, ceto-
hidroxi- e epoxi-hidroxi-ácido graxo). A velocidade do
processo de LPO é limitada pelas fases de iniciação e pro-
pagação (Hsieh, Kinsella, 1989; Spiteller, Spiteller, 1998).
Sistemas enzimáticos também podem iniciar a oxi-
dação do AGPI. As principais enzimas envolvidas neste
processo são as peroxidases e dioxigenases. As peroxi-
dases são enzimas inespecíficas que catalisam a oxidação
de muitos substratos, incluindo ácidos graxos. Peróxidos
e hidroperóxidos reagem com o ferro contido no sítio
catalítico das peroxidases, gerando um composto interme-
diário, que oxida um doador de hidrogênio, por exemplo
o NADPH. Este segundo composto formado, pode oxidar
o substrato e regenerar a enzima (Change, Sies, Boveris,
1979). Assim, a LPO pode ocorrer durante o processo de
fagocitose pelos neutrófilos e monócitos, que contêm
mieloperoxidase, uma hemeproteína. O sistema mielope-
roxidade/H2O2/haleto gera espécies reativas como O2
•-,
HOCl, •NO e possivelmente ONOO-, que podem abstrair
um hidrogênio alílico, iniciando a LPO (Kanner, Kinsella,
1983; Carr, Maccall, Frei, 2000).
As lipoxigenases estão presentes no citossol e na
fração microssomal das células e catalisam a inserção do
oxigênio nos AGPI, produzindo um LOOH. Existem pelo
menos três formas interconversíveis da enzima. A
lipoxigenase no estado ferroso passa à forma ativa, no
estado férrico, na presença de traços de hidroperóxido. Na
forma ativa, a enzima abstrai um hidrogênio do ácido
graxo, resultando o radical alquil do ácido graxo e a
enzima volta ao estado ferroso. O oxigênio é introduzido
ao substrato formando um LOO•. As lipoxigenases têm
maior capacidade de reagir com ácidos graxos dioxige-
nados possuindo uma estrutura 1,4-cis,cis-pentadieno,
como por exemplo, os ácidos linoléico, a-linolênico, g-
linolênico, araquidônico, eicosapentaenóico e docosaexa-
enóico (Change et al., 1979; Hsieh, Kinsella, 1989).
Além das lipoxigenases, os tecidos animais contêm
ciclooxigenases, enzimas que formam prostaglandinas
pela introdução de oxigênio na molécula do ácido
araquidônico. Portanto, ciclooxigenases catalisam a con-
versão do ácido araquidônico em prostaglandina, que é um
endoperóxido cíclico (PGG2), por série de reações nas
quais o O2 é inserido ao AGPI, seguindo-se ativação do
ácido graxo via abstração do hidrogênio. As ciclooxi-
genases, em condições fisiológicas, são as maiores produ-
toras de peróxidos lipídicos (Hsieh, Kinsella, 1989).
Metodologias para a avaliação da peroxidação
lipídica
As principais metodologias utilizadas para a avali-
ação da LPO em sistemas biológicos medem a formação
de produtos gerados durante as diferentes fases deste pro-
cesso. Portanto, é importante utilizar as várias técnicas
disponíveis, pois a sua escolha dependerá do propósito do
investigador, ou seja, da fase do processo de LPO que se
pretenda avaliar.
Um método considerado ideal na mensuração da
LPO deve: (1) identificar e quantificar produtos derivados
especificamente do processo de peroxidação; (2) ter um
baixo coeficiente de variação, quando analisadas amostras
diferentes de um mesmo indivíduo; (3) não estar sujeito a
interferências de outras biomoléculas; (4) empregar técni-
cas robustas e, portanto, mais confiáveis (CLAE, CG-EM,
CLAE-EM); (5) não sofrer interferência direta da dieta e
(6) ter sensibilidade para mensurar níveis basais dos pro-
dutos (Gutteridge, 1995; Halliwell, 2000; Abuja,
Albertini, 2001). Além disto, os produtos medidos nas
amostras biológicas devem ser relativamente estáveis in
vivo e ex vivo. A Figura 2 e a Tabela I apresentam as fases
da LPO, resumidamente, indicando as principais técnicas
disponíveis para se avaliar as diversas etapas deste proces-
so. A seguir, descrição mais detalhada dos principais
métodos utilizados na avaliação da LPO.
Detecção dos dienos conjugados
A oxidação dos AGPI é acompanhada pela forma-
ção de hidroperóxidos dienos conjugados, o que não ocor-
E. S. Lima, D. S. P. Abdalla296
FIGURA 2 - Esquema representativo da peroxidação lipídica, enfocando as principais substâncias formadas durante o
processo e as metodologias disponíveis para a sua avaliação.
re em ácidos graxos insaturados não oxidados. Os dienos
conjugados podem ser detectados pela sua absorção no
UV, apresentando absorção máxima entre 230 e 235 nm
(Haliwell, Guteridge, 1999). Entretanto, medida da absor-
ção neste comprimento de onda pode sofrer interferênci-
as, principalmente na análise de amostras biológicas, de-
vido à presença de outras substâncias que absorvem luz
neste mesmo comprimento de onda (Benzie, 1996). O tes-
te pode ser bastante útil, quando se trabalha em sistemas
homogêneos ou isolados, ou seja, quando se conhecem
todos os possíveis interferentes presentes na amostra.
Também pode-se medir a absorção no UV após a separa-
ção dos componentes por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), o que torna o resultado mais confiável.
Contudo os resultados devem ser expressos como dienos
conjugados ou pela somatória dos hidroperóxidos e seus
produtos de redução, hidroxi-derivados, considerando-se
que a maioria das colunas usadas nestas análises (C8, C18)
não consegue separá-los (Frei et al., 1988).
Determinação de malondialdeído (MDA)
Uma das técnicas mais utilizadas para se avaliar a
oxidação de lípides é o teste do malondialdeído (MDA).
O MDA é um dialdeído formado como um produto secun-
dário durante a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados
por cisão beta dos AGPI peroxidados, principalmente o
ácido araquidônico. É volátil, possui baixo peso molecular
(C3H4O2, P.M. = 72,07), tem uma cadeia curta 1,3-
dicarbonil e é um ácido moderadamente fraco (pKa =
4,46). Em condições apropriadas de incubação (meio áci-
do e aquecimento), reage eficientemente com uma varie-
dade de agentes nucleofílicos para produzir cromógenos
com alta absortividade molar no espectro visível (Janero,
1990; Benzie, 1996).
A sua condensação com o ácido tiobarbitúrico
(TBA) forma produtos, que podem ser determinados por
absorção no visível (532 nm) ou por fluorescência (λexc =
515 nm e λem = 553 nm). Se a formação de produtos deri-
Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas 297
vados do MDA usualmente requer pH baixo e temperatu-
ras elevadas (80-100 °C), algumas substâncias fluorescen-
tes derivadas do MDA podem ser geradas em pH neutro
e temperatura mais baixa (37 °C). Em pH neutro, a 37 °C,
uma reação de condensação tipo Hantzsch entre o MDA
e aminas primárias produz compostos fluorescentes. A
reação não específica do MDA com grupos amino primá-
rios ocorre em várias biomoléculas (proteínas, ácidos
nuclêicos, aminas e fosfolípides) produzindo complexos
1:1, que são bases de Schiff conjugadas (Janero, 1990).
O teste padrão, introduzido por Kohn e Liversedge,
em 1944, é bastante popular porque é simples e rápido,
porém inespecífico. Consiste na medida de um cromógeno
róseo formado pela reação do MDA com duas moléculas
de ácido tiobarbitúrico, em meio ácido e alta temperatura.Essa reação, chamada de “teste das substancias reativas
com ácido tiobarbitúrico (SRATB)”, representa múltiplos
métodos que utilizam o TBA, formando o complexo
MDA:TBA (1:2), C11H8N4S2O4.H2O (P.M.=342,35), que
tem absorção máxima em 532 nm e apresenta fluores-
cência (lexc = 515 nm e lem = 553 nm). Neste teste utili-
za-se como padrão o MDA obtido pela hidrólise do
tetrametoxipropano ou tetraetoxipropano (Yu et al., 1986).
A avaliação do MDA pelo teste com TBA não é espe-
cífica, pois muitas outras substâncias que ocorrem em mate-
riais biológicos também reagem com o TBA. Esta
inespecificidade é particularmente importante em lípides
contendo AGPI autoxidados como produtos de decomposi-
ção secundária, incluindo complexa mistura de compostos
saturados de cadeia curta (alcanos), insaturados (alcenos e
alcadienos) e aldeídos monofuncionais, além de MDA. Al-
guns aldeídos monofuncionais também são reativos ao TBA,
em meio ácido e à temperatura elevada utilizada no teste das
SRATB, formando produtos derivados do TBA com um es-
pectro no visível similar ao do complexo MDA:TBA (1:2).
Portanto, o teste espectrofotométrico com o TBA pode me-
TABELA I - Principais métodos usados para identificar ou quantificar a peroxidação lipídica em amostras biológicas
Abordagem O que é medido Métodos(s)
Consumo do substrato AGPI Consumo de O2 CLAE, CG Eletrodo de oxigênio
Medida de peróxidos Peróxidos Xilenol Orange Iodometria
Medida de peróxidos Hidroperóxidos CLAE-UV
previamente separados CLAE-QL
CLAE-EM
CG-EM
Medida de produtos finais MDA SRATB
CLAE-UV e fluorescência
4-Hidroxinonenal CLAE
CG-EM
CLAE-EM
Gases hidrocarbonados CG
(pentano, etano)
F-2-isoprostanos CG
CG-EM
CLAE-EM
Imunoensaios
Diversas Radicais Livres Spin trapping
Emissão de luz Quimioluminescência direta
Dienos conjugados Absorção UV (234 nm)
CLAE-UV
Anticorpo anti-lípides oxidados ELISA
Oxidabilidade das lipoproteínas Cinética de oxidação (lag phase)
E. S. Lima, D. S. P. Abdalla298
dir variedade de espécies que absorvem em 532 nm. Outra
possível interferência neste método deve-se à presença de
metais de transição, o que possibilita uma geração de MDA
durante a análise. É essencial incluir-se quantidade suficiente
de antioxidante para prevenir a autoxidação dos lípides e a
subseqüente formação de MDA, durante a fase de aqueci-
mento do ensaio. Adicionalmente, é aconselhável também
tratar os reagentes com quelantes de metais de transição para
impedir a interferência destes. Outra desvantagem do teste
das SRATB é a instabilidade do cromógeno, que absorve em
532 nm (Fukunaga, Takama, Suzuki, 1995). Portanto, as con-
dições do teste das SRATB influenciam na análise da
lipoperoxidação. Quatro fatores importantes devem ser con-
siderados neste teste: (a) a influência das condições da reação
e dos reagentes na resposta ao TBA; (b) a não especificidade
do TBA para a reação com o MDA; (c) a não exclusividade
do MDA como produto final da LPO (d) a impossibilidade de
se distinguir o complexo MDA:TBA dos outros produtos
reativos ao TBA por espectrofotometria (Janero, 1990;
Benzie, 1996). Este método é de fácil utilização, fornecendo
informações sobre a extensão da LPO em sistemas simples,
in vitro, mas não é indicado para a análise em fluidos bioló-
gicos (Esterbauer et al., 1984).
Detecção do 4-hidroxinonenal
O 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), um aldeído insatu-
rado, é o produto quantitativamente mais importante da
degradação peroxidativa de ácidos graxos omega-6. Apre-
senta alta citotoxidade, principalmente devido à sua propri-
edade de formar bases de Schiff pela reação com
aminoácidos, sobretudo com os resíduos lisina e histidina,
presentes nas proteínas e de etenoadutos com bases do
DNA. O HNE pode ser quantificado por CLAE, CG-EM ou
CLAE-EM (Moore, Roberts, 1998; Deigton et al., 1997).
Após extração com diclorometano, a amostra é se-
parada por CLAE e o HNE é detectado entre 220 e 223
nm. Neste método, algumas substâncias que absorvem no
mesmo comprimento de onda podem coeluir com o HNE.
Por isto, houve a necessidade de se desenvolver métodos
utilizando CG-EM ou CLAE-EM (Selley, 1997; Rauli et
al., 1998). Um problema adicional é que o HNE pode ser
gerado durante as fases de armazenamento, extração e
análise, produzindo resultados erroneamente elevados
(Benzie, 1996) .
Detecção dos isoprostanos
A determinação dos isoprostanos é um dos mais
recentes e promissores métodos na mensuração da LPO
(Lawson, Rokach, Fitzgerald, 1999). Os isoprostanos são
produtos derivados da oxidação de AGPI por via não
enzimática. Os isoprostanos mais comumente determina-
dos são os da família F2-isoprostanos, derivados da oxida-
ção do ácido araquidônico (Moore, Roberts, 1998). Os
isoprostanos seriam os melhores marcadores da LPO in
vivo, não fosse pelo fato de estarem presentes em concen-
trações muito baixas em fluidos biológicos. Portanto, a
quantificação destes produtos requer a utilização de técni-
cas ainda não disponíveis na maioria dos laboratórios
como a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massas. Contudo, técnicas mais simples, como os
imunoensaios, têm sido desenvolvidas, o que tornará esta
determinação mais disponível (Lawson, Rokach,
Fitzgerald, 1999; Pratico, 1999).
Teste do alaranjado de xilenol (xilenol-orange)
Os hidroperóxidos são produtos primários da pero-
xidação dos AGPI (Yamamoto et al., 1987), daí a impor-
tância da sua medida, uma vez que a maioria dos métodos
avalia seus produtos de degradação. Um dos métodos uti-
lizados para se determinar a concentração de hidroperó-
xidos em amostras biológicas é aquele que utiliza o
xilenol-orange. Este método baseia-se no princípio de que
os hidroperóxidos oxidam ferro II a ferro III, o qual reage
com o xilenol orange, produzindo um cromóforo que tem
absorção máxima em 560 nm (Jiang, Woollard, Wolf,
1991; Gay et al., 1999). Os resultados são relativamente
reprodutíveis e o método pode ser usado para a determi-
nação de hidroperóxidos em fase aquosa e lipídica
(Moore, Roberts, 1998). É um método simples, que não
exige equipamentos sofisticados, porém é inespecífico,
pois pode sofrer interferências de diversas substâncias
presentes no plasma sangüíneo. Estas substâncias podem
reagir com o xilenol-orange ou possuir absorção no mes-
mo comprimento de onda do complexo formado.
Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção
por quimiluminescência
O método de CLAE com detecção por quimilumi-
nescência tem sido bastante utilizado na mensuração es-
pecífica de hidroperóxidos lipídicos (Miyazawa, 1989;
Yamamoto, 1994; Sattler, Mohr, Stocker, 1994; Yasuda,
1997; Mashima, Odonera, Yamamoto, 2000). Utilizando
este método é possível a quantificação de hidroperóxidos
presentes em amostras biológicas, sem interferências de
outras biomoléculas. Os hidroperóxidos presentes na
amostra, após separação em colunas cromatográficas (C8,
C18), reagem em um sistema contendo peroxidase
(microperoxidase, citocromo c), gerando peróxido de hi-
Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas 299
drogênio; este reage com o luminol presente na solução de
derivatização, decompondo-o a aminoftalato, que emite
luz (l = 430 nm) captada pelo detector de quimilumines-
cência (Frei et al., 1988). Esse método tem demostrado
alta sensibilidade, podendo-se detectar níveis abaixo de 10
nmol/L, dependendo da qualidade do detector. Sendo as-
sim, torna-se possível avaliar os níveis plasmáticos de
hidroperóxidos de ésteres de colesterol, por exemplo, que
se encontram em torno de 30 nM em indivíduos saudáveis
(Yamamoto et al., 1987).
Utilizando este método, padronizamos em nosso la-
boratório sistemas para detecção e quantificação dos
hidroperóxidos de linoleato de colesterol, trilinoleina e
fosfatidilcolina, no plasma e nas lipoproteínas de indivíduos
normolipidêmicos e dislipidêmicos (Figura 3). Pelanossa
experiência, detalhe crucial para a obtenção de resultados
confiáveis é o tratamento da vidraria e dos reagentes utili-
zados na extração com agentes quelantes ou seqüestradores
de metais de transição, que podem reduzir os hidro-
peróxidos presentes na amostra aos seus respectivos
hidroxi-derivados, que não são detectados no sistema. Ou-
tro cuidado importante é adicionar antioxidantes às amos-
tras biológicas como o hidroxi-tolueno butilado (BHT) e
inibidores das peroxidases como a n-etilmaleimida.
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas
O uso da técnica de cromatografia líquida acoplada
à espectrometria de massas (CLAE-EM) para a análise de
amostras biológicas é recente, tendo havido importante
avanço na última década. O desenvolvimento de sistemas
integrados de CLAE e espectrometria de massas com di-
ferentes formas de ionização permitiu o estabelecimento
de vários métodos para análise de diferentes compostos
em complexas matrizes biológicas como o plasma
sangüíneo (Niessen, 1998; Stewart, 1999).
Uma das vantagens mais importantes desta técnica é
permitir a separação, quantificação e elucidação estrutural
das substâncias presentes na amostra, de maneira contínua,
sem a necessidade de purificação ou derivatização prévias,
permitindo análise muito mais rápida e eficiente. Outro
ponto importante é a possibilidade de se analisar substânci-
as não voláteis ou termolábeis, o que seria difícil em outras
técnicas como a cromatografia gasosa acoplada à espectro-
metria de massas (Kim, Salem Jr, 1993).
A técnica de CLAE-EM tem sido utilizada em diver-
sos trabalhos na análise de derivados lipídicos e seus pro-
dutos de oxidação (Kim, Salem Jr. , 1993; Gallon, Pryor,
1993; Rezanka, 2000; Balazy et al., 2001) e representa o
que há de mais avançado em técnicas de detecção e carac-
terização qualitativa e quantitativa de biomoléculas em
matrizes biológicas. Além disso, os resultados obtidos por
esta técnica apresentam tanto especificidade, pelo fato da
detecção ocorrer pela análise da massa molar do composto
(MS1), ou pela massa dos seus fragmentos específicos
(MS3), e sensibilidade, sendo possível, na maioria das
vezes, detecção ao nível de picomolar.
Em nosso laboratório temos utilizado este método
para a detecção e quantificação de produtos oxidados e
nitrados derivados do ácido linoléico, no plasma de indi-
víduos hiperlipidêmicos (Figura 4). Utilizando a ionização
FIGURA 3 - Separação por CLAE-QL de 22 pmol de Tg18:2-OOH e 8 pmol de Ch18:2-OOH, utilizando columa LC18DB
250 x 4,6 mm (Supelco, Bellefonte, PA) e metanol:t-butanol 2:1 (v/v) como fase móvel, a um fluxo de 1 mL/min.
E. S. Lima, D. S. P. Abdalla300
por electrospray os produtos são analisados no modo ne-
gativo e ionizados na forma [M-H]-.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O processo de peroxidação lipídica ocorre por diver-
sos mecanismos, incluindo aqueles nos quais estão envol-
vidos os radicais livres e os controlados enzimaticamente.
O processo ocorre também em diversas etapas, com inú-
meras possibilidades de reações químicas, o que o torna de
difícil compreensão e avaliação. Devido a isto, ainda não
há um método considerado ideal para avaliá-lo por com-
pleto. Portanto, tratando-se de um processo tão complexo,
torna-se necessário avaliá-lo por meio de abordagens
metodológicas distintas para cada uma das suas etapas. A
importância da mensuração dos produtos derivados da
lipoperoxidação em fluidos biológicos está relacionada à
citotoxicidade destes produtos, que pode causar alterações
celulares associadas ao envelhecimento e diversas doen-
ças como o câncer, artrite e aterosclerose.
ABSTRACT
Lipid Peroxidation: Mechanisms and evaluation in
biological samples
Lipid peroxidation is a prominent manifestation of free
radical activity and oxidative stress in biological systems.
It produces an ample repertoire of substances including
lipid hydroperoxides, aldehydes, such as malondialdehyde
and 4-hidroxynonenal, and isoprostanes. We review here
the mechanisms of lipid peroxidation and the several
methods available for its evaluation in biological samples.
UNITERMS: Lipid peroxidation. Free radicals. Reactive
species of oxigen and nitrogen. Lipid hydroperoxides.
Malondialdehyde. Isoprostanes.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP, pela bolsa de Mestrado concedida a
Emerson Silva Lima, e ao CNPq, pela bolsa de produtivi-
dade concedida a Dulcineia S.P. Abdalla.
FIGURA 4 - Análise por CLAE-EM de padrão de hidroperóxido do ácido linoléico. (A) Cromatograma da detecção
seletiva do íon de m/z 311[M-H]- e (B) espectro de massa do pico eluído a 3,67 min, mostrando como íon principal m/z 311
[M-H]-, correspondente ao hidroperóxido e de menor intensidade, o íon de m/z 293 [M-H]-, correspondendo ao hidróxi-
derivado.
Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas 301
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABUJA, P.M., ALBERTINI, R. Methods for monitoring
oxidative stress, lipid peroxidation and oxidation
resistance of lipoproteins. Clin. Chim. Acta, v.306, p. 1-
17, 2001.
AL MEHDI, A.B., DODIA, C., JAIN, M.K., FISHER, A. B.
A phospholipase A2 inhibitor decreases generation of
thiobarbituric acid reactive substances during lung
ischemia-reperfusion. Biophys. Biochim. Acta, v.1166,
p.56-62, 1993.
ARUOMA, O.I. Free radicals, oxidative stress, and
antioxidants in human health and disease. J. Am. Chem.
Soc., v.75, p.199-212, 1998.
BALAZY, M., IESAKI, T., PARK, J.L., JIANG, H.,
KAMINSKI, P.M., WOLIN, M. Vicinal
nitrohydroeicosatrienoic acids: vasodilatador lipids
formed by reaction of nitrogen dioxide with arachidonic
acid. J. Pharm. Exper. Therap., v.299, n.2, p.1-9, 2001.
BARBER, A.A., BERNHEIM, F. Lipid peroxidation: Its
measurement, occurrence and significance in animal
tissues. Adv. Gerontol. Res., v.2, p.355-403,1967.
BARBER, A.D., HARRIS, S.R. Oxygen free radicals and
oxidants: a review. Amer. Pharm., v.34, n.9, p.26-35, 1994.
BENZIE, I.F.F. Lipid peroxidation: a review of causes,
consequences, measurements and dietary influences. Int.
J. Food Sci. Nut, v.47, p.233-261, 1996.
Di MASCIO, P., MEDEIROS, M.H.G., BECHARA, E.J.H.,
CATALANI, L.H. Singlet molecular oxygen:
Generation, reactivity, identification and biological
effects. Cienc.Cult., v.47, p. 297-311, 1995.
CARR, A.C., McCALL, M.R., FREI, B. Oxidation of LDL
by mieloperoxidase and reactive nitrogen species-
Reaction pathways and antioxidants protection.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., v.20, p.1716-1723,
2000.
CHANGE, B., SIES, H., BOVERIS, A. Hydroperoxide
metabolism in mammalian organs. Physiol. Rev., v.59,
n.3, p. 527-605, 1979.
CHIRICO, S., SMITH, C., MARCHANT, C.,
MITCHINSON, M.J., HALLIWELL, B. Lipid
peroxidation in hyperlipidemic patients. A study of
plasma using a HPLC-based thiobarbituric acid test. Free
Radical Res. Comm., v.19, n.1, p.51-57, 1993.
CHISOLM, G.M., STEINBERG, D. The oxidative
modification hypothesis of atherogenesis: a overview.
Free Radical Biol. Med., v.28, n.12, p.1815-1826, 2000.
DEIGTON, N., MAGILL, W.J., BREMNER, D.H.,
BENSON, E.E. Malondialdehyde and 4-hydroxy-2-
nonenal in plant tissue cultures: LC-MS determination of
2,4-dinitrophenylhydrazone derivates. Free Radical Res.,
v.27, n.3, p.255-265, 1997.
EISERICH, J. P., PATEL, R. P., O’DONNELL, V.B.
Pathophysiology of nitric oxide and related species: free
radical reactions and modification of biomolecules.
Molec. Aspects Med. v.19, p.221-357, 1998.
ESTERBAUER, H., GEBICKI, J., PUHL, H., JÜRGENS,
G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in
oxidative modification of LDL. Free Radical Biol. Med.,
v.13, p.341-390, 1992.
ESTERBAUER, H., LANG, J., ZADRAVEC, S., SLATER,
T.F. Detection of malonaldehyde high-performance
liquid chromatography. Methods Enzymol., v.105, p.319-
328, 1984.
FREI, B., YAMAMOTO, Y., NICOLAS, D., AMES, B. N.
Evaluation of an isoluminolchemiluminescence assay
for the detection of hidroperoxides in human blood
plasma. Anal. Biochem., v.175, p.1120-1130, 1988.
FUKUNAGA, K., TAKAMA, K., SUZUKI, T. High
performance liquid chromatography determination of
plasma malondialdehyde level without a solvent
extraction procedure. Anal. Biochem., v.230, p.20-23,
1995.
GALLON, A.A., PRYOR, W.A. The identification of the
allylic nitrite and nitro derivatives of methyl linoleate and
methyl linolenate by negative chemical ionization mass
spectroscopy. Lipids, v.28, n.2, p.125-133, 1993.
GARDNER, H.W. Oxygen radical chemistry of
polyunsaturated fatty acids. Free Radical Biol. Med., v.7,
p.65-86, 1989.
E. S. Lima, D. S. P. Abdalla302
GAY, C., COLLINS, J., GEBICKI, J.M. Hydroperoxide
assay with the ferric-xylenol orange complex. Anal.
Biochem., v.273, p.149-155, 1999.
GILLER, G., SINGLER, K. Oxidative stress and living cells.
Folia. Microbiol., v.40, n.2, p.131-152, 1995.
GUTTERIDGE, J.M.C. Lipid peroxidation and antioxidants
as biomarkers of tissues damage. Clin. Chem., v.41,
p.1819-1828, 1995.
HALLIWELL, B. Lipid peroxidation, antioxidants and
cardiovascular disease: how should we move forward ?
Cardiovas. Res., v. 47, p.410-418, 2000.
HALLIWELL, B. Oxidants and human disease: Some new
concepts. Faseb. J., v.1, p.358-364, 1987.
HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J.M.C. Free Radicals in
Biology and Medicine. 3.ed. New York: Oxford
University, 1999. 936 p.
HOGG, N., KALYANARAMAN, B. Nitric oxide and lipid
peroxidation. Biochim. Biophys. Acta, v. 1411, n.2-3.
P.378-384, 1999.
HSIEH, R.J, KINSELLA, J.E. Oxidation of polyunsaturated
fatty acids: mechanisms, products, and inhibition with
emphasis on fish. Adv. Food Nutr. Res., v.33, p.233-341,
1989.
JANERO, D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-
reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and
peroxidative tissue injury. Free Radical Biol. Med., v.9,
p.515-540, 1990.
JIANG, Z., WOOLLARD, A.C.S., WOLFF, S.P. Lipid
hydroperoxide measurement by oxidation of Fe2+ in the
presence of xylenol orange. comparation with the TBA
assay and an iodometric method. Lipids, v.26, p.853-856,
1991.
KANNER, J., KINSELLA, J.E. Initiation of lipid
peroxidation by a peroxidase/hydrogen peroxide/halide
system. Lipids, v.18, p.204-210, 1983.
KIM, H.Y., SALEM JR, N. Liquid chromatografy-mas
spectrometry of lipids. Prog. Lip. Res., v.32, n.3, p.221-
245, 1993.
LAWSON, J.A., ROKACH, J., FITZGERALD, G.A.
Isoprostanes: formation, analysis and use as indices of
lipid peroxidation in vivo. J. Biol. Chem., v.35, p.24441-
24444, 1999.
LORRAIN-SMITH, J. The patological effects due to increase
of oxygen tension in the air breathed. J. Physiol., v.24,
p.19-25, 1899.
MASHIMA, R. , ONODERA, K., YAMAMOTO, Y.
Regioisomeric distribution of cholesteryl linoleate
hydroperoxides and hydroxides in plasma from healthy
humans provides evidence for free radical-mediated lipid
peroxidation in vivo. J. Lip. Res., v. 41, p.109-115, 2000.
MIYAZAWA, T. Determination of phospholipid
hydroperoxides in human blood plasma by a
chemiluminescence-HPLC assay. Free Radical Biol.
Med., v.7, p.209-217, 1989.
MOORE, K., ROBERTS, I.I. J. Measurement of lipid
peroxidation. Free Radical Res., v.28, p.659-671, 1998.
MORIEL, P., OKAWABATA, F.S., ABDALLA, D.S.P.
Oxidized lipoproteins in blood plasma: possible marker
of atherosclesoris progression. Life, v.48, p.413-417,
1999.
NIESSEN, W.M.A. Advances in instrumentation is liquid
chromatography-mass spectrometry and related liquid
introduction techniques. J. Chromatogr. A, v.794, p.407-
435, 1998.
PATEL, R.P., MCANDREW, J., SELLAK, H., WHITE,
C.R., JO, H., FREEMAN, B.A, DARLEY-USMAR,
V.M. Biological aspects of reactive nitrogen species.
Bioquim. Biophys. Acta, v.1411, p.385-400, 1999.
PORTER, N.A. Chemistry of Lipid peroxidation. Method.
Enzymols., v.105, p.273-282, 1984.
PORTER, N.A., CALDWELL, S.E., MILLS, K.A.
Mechanism of free radical oxidation of unsaturated
lipids. Lipids, v.30, n.4, p.277-290, 1995.
PRATICO, D. F(2)-isoprostanes: sensitive and especific non-
invasive indices if lipid peroxidation in vivo.
Atherosclerosis, v.147, p.1-10, 1999.
Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas 303
RAULI, S., PUPPO, M.D., MAGNI, F., KIENLE, M.G.,
Validation of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-trans-
nonenal measurement in plasma by NICI-GC-MS. J.
Biochem., Tokyo, v.123, n.5, p.918-923, 1998.
REZANKA, T. Analysis of very long chain polyunsaturated
fatty acid using high-performance liquid
chromatography- atmospheric pressure chemical
ionization mass spectrometry. Biochem. Syst. Ecolog.,
v.28, p.847-856, 2000.
ROMERO, F.J., BOSCH-MORELL, F., ROMERO, M.J.
ROMERO, B. MARIN, N., ROMA, J. Lipid
peroxidation products and antioxidants in human disease.
Environ. Health. Perspect., v.106, p.1229-1234, 1998.
SATTLER, W., MOHR, D., STOCKER, R. Rapid isolation
of lipoproteins and assessment of their peroxidation by
high-performance liquid chromatography postcolumm
chemiluminescence. Methods. Enzymol., v.233, p.469-
489, 1994.
SELLEY, M.L. Determination of the lipid peroxidation
product (E)-4-hydroxy-2-nonenal in clinical samples by
gas chromatography—negative-ion chemical ionization
mass spectrometry of the o-pentafluorobenzil oxime. J.
Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl., v.691, n.2, p.263-268,
1997.
SPITELLER, P., SPITELLER, G. Strong dependence of lipid
peroxidation product spectrum whether Fe2+/O2 or Fe
3+/
O2 is used as oxidant. Biochim. Biophys. Acta, v.1392,
p.23-40, 1998.
STEWART, I.I., Electrospray mass spectrometry: a tool for
elemental speciation. Spectr. Acta B, v.54, p.1649-1695,
1999.
VACA, C.E., WILHEM, J., HARMS-RINGDAHL, M.
Interaction of lipid peroxidation products with DNA. A
review. Mut. Res., v.195, p.137-149.1988.
YAMAMOTO, Y., BRODSKY, M.H., BAKER, J.C.,
AMES, B.N. Detection and caracterization of lipid
hydroperoxides at picomole levels by high-performance
liquid chromatography. Anal. Biochem., v.160, p.7-13,
1987.
YAMAMOTO, Y. Chemiluminescense-based high-
performance liquid chromatography assay of lipid
hydroperoxides. Methods Enzymol., v.233, p.319-324,
1994.
YASUDA, M., NARITA, S. Simutaneous determination of
phospholipid hydroperoxides and cholesteryl ester
hydroperoxides in human plasma by high-performance
liquid chromatography with chemiluminenscense
detection. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl., v.693 ,
p.211-227, 1997.
YU, L.W., LATRIANO, L., DUNCAN, S., HARTWICK, R.,
WITY, G. High-performance liquid chromatography
analysis of the thiobarbituric acid adducts of
malonaldehyde and trans- trans-muconaldehyde. Anal.
Biochem., v.156, p.326-333, 1986.
Recebido para publicação em 15 de outubro de 2001.
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