Relatório - MICROBIOLOGIA : Preparo, cultivo e leitura de meios de cultura

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ETEC Rubens de Faria e Souza
Curso: Técnico em Química
Jasmine Bonfim Barros
Lucas Braz dos Santos
Paula Vendramello Pontarolli
Roberta Rodrigues Monteiro
Thais da Silva Tardin Antunes
Preparo e esterilização de meios de cultura
Cultivo de microrganismos em placas
Leitura das placas
Sorocaba - SP
2018
1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
Os meios de cultura são insumos preparados em laboratórios que fornecem os nutrientes para o crescimento e desenvolvimento de microrganismos (como bactérias e fungos) fora do seu habitat natural. Existe uma variedade enorme destes meios e são utilizados para análises laboratoriais e estudos científicos em diversas áreas, principalmente em alimentos, água, cosméticos e microbiologia clínica. Além dos nutrientes e condições ambientais favoráveis para esse cultivo, muitos critérios devem ser considerados. Diferentes microrganismos possuem diferentes necessidades, por isso o meio de cultura é adaptado para satisfazer essas necessidades, utilizando nutrientes específicos dependendo do microrganismo de interesse. Além desses fatores, deve ser levado em conta o pH e a quantidade de oxigênio ou mesmo a sua ausência. Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com seu estado físico em: sólidos, líquidos ou semissólidos. Os meios sólidos possuem um agente solidificante, em geral ágar, em uma concentração de 1 a 2 %. Os meios semissólidos são mais gelatinosos, em uma consistência intermediária com a presença de menos de 1% de agente solidificante. Essa menor consistência permite uma maior motilidade do micro-organismo em cultivo. Os meios líquidos não possuem agentes solidificantes e são frequentemente usados em culturas iniciais, para transferência para outros meios (repiques) e em provas bioquímicas. Outra classificação que possuem é de acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. Os meios podem ser classificados em:
Pré-enriquecimento: para amostras que sofreram algum processo físico ou químico (Ex.: caldo lactosado);
Enriquecimento: desenvolvimento de bactérias gerais (Ex.: Caldo Tetrationato);
Seletivo: inibem o crescimento de alguns microrganismos e propiciam o desenvolvimento de outros ( Ex.: Manitol e MacConkey);
Diferencial: permite a diferenciação de microrganismos parecidos (Ex.: Ágar sangue e MacConkey);
Triagem: avalia as atividades metabólicas, permitindo a identificação de vários microganismos. (Ex.: Tríplice açúcar e ferro);
Identificação: para realização de provas bioquímicas e funções fisiológicas do organismo a ser identificado (Ex.: Ágar citrato, Caldo nitrato);
Dosagem: determinações de aminoácidos, vitaminas e antibióticos;
Contagem: determinação quantitativa da população microbiana (Ex.: Ágar de Contagem em Placas, Ágar Baird-Parker)
Manutenção: conserva os microrganismos em laboratório (Ex.: Ágar Sabouraud).Meios com leite, Ágar suco de tomate, Ágar sangue, Ágar Simples, meio semi-sólido, etc.).
2 OBJETIVO 
Aula I
Adquirir experiência na técnica de preparo dos meios de cultura.
Aula II
Cultivar os microrganismos coletados no ambiente escolar e público.
Aula III
Identificar os microrganismos que se desenvolveram nas coletas realizadas pelo ambiente escolar.
3 MATERIAIS
Aula I
Reagentes:
Água destilada
PCA (Plate Coute Agar)
PDA (Potato Dextrose Agar)
Equipamentos:
Algodão
Balança semi-analítica
Bico de Bunsen
Erlenmeyer
Espátula
Proveta
Tela de Amianto
Tripé
Aula II
Reagentes:
Água esterilizada
Meio de cultura (PCA e PDA) já curados
Equipamentos:
Bico de Bunsen
Swabs esterilizados 
Aula III
Reagentes:
Meios de cultura (PCA e PDA) já com a presença dos microrganismos
Equipamentos:
Agulha de níquel cromo
Bico de Bunsen
4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Preparo e esterilização de meios de cultura
Foram feitos os cálculos para determinar a quantidade de cada meio de cultura utilizado (PCA: Place Count Agar e PDA: Potato Dextrose Agar) para 200 mL de água destilada, de acordo com as orientações dos fabricantes:
	PCA
	Massa (g)
	Volume (mL)
	23,5
	1000
	4,7
	200
	PDA
	Massa (g)
	Volume (mL)
	39
	1000
	7,8
	200
Foi feita a identificação em placas de Petri previamente esterilizadas para determinar quais placas acondicionariam os meios de cultura PCA e PDA;
Cada substância foi colocada em um Erlenmeyer diferente com água destilada, onde ficaram em suspensão por 15 minutos;
Após 15 minutos de suspensão, cada uma das substâncias foi aquecida até fervura e homogeneizada constantemente de acordo com as orientações dos fabricantes;
Assim que as substâncias levantaram fervor, foi colocado um tampão de algodão e papel kraft no Erlenmeyer, conforme demonstrado pela professora;
Os meios de cultura foram levados à autoclave para esterilização a 121ºC por 15 minutos;
Após os 15 minutos de esterilização, os meios de cultura foram passados para as placas de Petri. O processo aconteceu próximo ao Bico de Bunsen. 
Quando todas as placas foram preenchidas, aguardou-se um tempo até que as substâncias se solidificassem, e assim foram armazenadas na geladeira.
Cultivo de microrganismos em placas
Os meios de cultura foram distribuídos uniformemente para as bancadas e identificados para organizar o experimento;
Com o auxílio de água peptonada e swabs foi feita a coleta de amostras de locais e superfícies em ambiente escolar: Rosto Vitor, torneira do sanitário feminino, anel Paula, dinheiro, celular, cabelo, válvula do banheiro feminino, torneira do banheiro masculino, mictório do sanitário masculino, bancada merenda, dedos Jéssica, unha Vitor, laboratório de Microbiologia, ônibus, tosse Larissa, interior micro-ondas, bebedouro, torneira do laboratório de Microbiologia, mesa do refeitório, sala de aula, torneira do sanitário feminino e corrimão;
Para cada amostra, umidificou-se um swab com água peptonada, coletou-se a amostra com o swab e então a amostra foi transferida para as respectivas placas de Petri com os meios de cultura. Cada amostra foi transferida para duas placas: uma contendo meio PCA e outra contendo meio PDA;
Após a transferência para cada placa, a mesma foi fechada imediatamente, a fim de não ocorrer demais contaminações do ar;
Assim que todas as placas receberam as amostras, foram colocadas viradas para baixo na estufa, de modo que os meios PCA e PDA ficassem em estufas diferentes com temperaturas específicas para cada meio.
Leitura das placas
Após 7 dias de encubação dos microrganismos, foi realizada a leitura das placas, observando atentamente cada uma;
As placas foram divididas para todas as bancadas e então cada grupo discutiu sobre as características dos microrganismos de cada placa. 
Para as placas com meio PCA observamos as características das bactérias (cremosidade, tamanho (G,M,P) e cores) e alguns tipos de bolores. E para placas com meio PDA observamos as características dos bolores (textura (algodonosos, aveludados ou arenosos) e cores), leveduras (cremosidade, tamanho (G e M) e cores) e algumas pequenas bactérias que apareceram.
Para toda placa que precisou-se abrir para confirmar a leitura, foi aberta próxima ao Bico de Bunsen;
Assim que cada grupo terminou a leitura com as placas divididas, as placas foram trocadas, para que no fim, todos os grupos lessem todas as placas.
Após a leitura de todas as placas, foram anotadas as características de cada placa.
5 DADOS E DISCUSSÃO CIENTÍFICA
Após realizarmos os procedimentos experimentais outrora citados, foi efetuada a leitura das placas sob orientação da professora. A leitura das placas consistiu em identificar pela observação a olho nu caracteristicas como coloração, tamanho e consistência das tipologias esperadas em cada meio de cultura. Os dados levantados pela leitura das placas se encontra na Tabela 1.
Tabela 1. Leitura das placas.
	Local/Superfície
	Ágar PCA
	
Ágar PDA
	Rosto Vitor
	Bactérias– cor: amarela, amarelada e laranja; tamanho: pequena e média; consistência: cremosa.
	Leveduras – cor: branca e laranja; tamanho: média; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca; tamanho: pequena; consistência: cremosa.
	Torneira do sanitário feminino
	Bactérias – cor: amarela, amarelada e branca; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores: verde aveludado, branco e marrom algodonosos,
Leveduras – cor: amarela e laranja; tamanho: média; consistência: cremosa.
	Anel Paula
	Bactérias – cor: amarela, branca e laranja; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Leveduras – cor: rosa; tamanho: média; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca; tamanho: pequena; consistência: cremosa.
	Dinheiro
	Bactérias – cor: amarela e branca; tamanho: média e grande; consistência: cremosa.
Bolores – cor: verde e amarelo; consistência: cremosa.
	Bolores – cor: verde, preto e branco; consistência: aveludado.
	Celular
	Bactérias – cor: branca; tamanho: média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – cor: verde; consistência: aveludado.
	Cabelo
	Bactérias – cor: branca; tamanho: grande; consistência: cremosa.
	Bolores – cor: branco e amarelado; consistência: algodonoso.
Leveduras – cor: amarela; tamanho: média; consistência: cremosa.
	Valvula do banheiro feminino
	Bactérias – cor: amarela, amarelada e branca; tamanho: média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – preto aveludado e branco algodonoso.
	Torneira do banheiro masculino
	Bactérias – cor: amarela, amarelada e branca; tamanho: pequena e média; consistência: cremosa.
	Bolores – branco algodonoso e verde aveludado.
Leveduras – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: média; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: cinza; tamanho: pequena; consistência: cremosa. 
	Mictório do sanitário masculino
	Bactérias – cor: amarelada e branca; tamanho: média; consistência: cremosa.
	Bolores – branco algodonoso e verde aveludado.
Bactérias – cor: branca; tamanho: pequenas; consistência: cremosa.
	Bancada merenda
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – branco algodonoso e verde aveludado.
Leveduras – cor: branca, tamanho: média e grande; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca e laranja; tamanho: pequena; consistência: cremosa. 
	Dedos Jéssica
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena e média; consistência: cremosa.
Bolores – cor: branco; consistência: arenoso.
	Bolores – laranja algodonoso e arenoso e preto aveludado.
	Unha Vitor
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – cor: verde e marrom; consistência: aveludado.
Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena; consistência: cremosa.
	Laboratório de Microbiologia
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – preto e verde aveludado e branco arenoso.
Leveduras – cor: branca; tamanho: média; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca; tamanho: pequena; consistênca: cremosa.
	Ônibus
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – branco algodonoso e arenoso, verde e preto aveludado.
Leveduras – cor: amarelada; tamanho: grande; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena; consistência: cremosa. 
	Tosse Larissa
	Bactérias – cor: branca e amarelada; tamanho: pequena e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – cor: verde, branco e cinza; consistência: aveludado.
	Interior micro-ondas
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – branco algodonoso e verde aveludado.
	Bebedouro
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena; consistência: cremosa.
	Bolores – branco algodonoso e verde aveludado.
Leveduras – cor: branca, amarela, rosa e cinza; tamanho: média; consistência: cremosa.
	Torneira do laboratório de Microbiologia
	Bactérias – cor: branca e amarelada; tamanho: pequena e grande; consistência: cremosa.
Bolores – cor: branco; consistência: arenoso.
	Bolores – cor: verde; consistência: aveludado.
Levedura – cor: branca, amarela e laranja; tamanho: média; consistência: cremosa.
	Mesa do refeitório
	Bactérias – cor: amarela; tamanho: média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – cor: branco; consistência: algodonoso.
Leveduras – cor: amarela; tamanho: média; consistência: cremosa.
	Sala de aula
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena, média e grande; consistência: cremosa.
	Bolores – verde aveludado e branco aveludado, arenoso e algodonoso.
	Torneira do sanitário feminino
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena e média; consistência: cremosa.
	Bolores – verde aveludado e branco algodonoso.
Leveduras – cor: amarela; tamanho: média; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca e avermelhada; tamanho: pequena; consistência: cremosa.
	Corrimão
	Bactérias – cor: branca, amarela e amarelada; tamanho: pequena e média; consistência: cremosa.
Bolores – cor: branco; consistência: algodonoso.
	Bolores – verde aveludado, branco arenoso e algodonoso, vermelho, laranja e amarelado algodonoso.
Leveduras – cor: amarela; tamanho: grande; consistência: cremosa.
Bactérias – cor: branca e amarela; tamanho: pequena; consistência: cremosa.
Com o correto desempenho dos procedimentos laboratoriais, através da adequada esterilização e preparo dos meios de cultura e coleta, pode-se obter um excelente desenvolvimento dos fungos e bactérias nos meios de cultura, sendo possível a fácil distinção das caracteristicas de cada tipologia por meio visual, onde, para a definitiva constatação da consistênca dos fungos (bolores) de algumas placas, foi realizada a abertura da placa próximo ao Bico de Bunsen e feita a constatação pela passagem da alça de níquel cromo no corpo do bolor formado.
Foram notadas diferentes colônias em placas de mesmo meio de cultura (PDA - Potato Dextrose Agar e PCA -  Plate Count Agar), devido a coleta ser realizada em diferentes ambientes, o qual estavam previamente higienizados ou não.
Nas placas com PCA -  Plate Count Agar, em que se eram esperadas a formação de colônias de bactérias, obteve-se bactérias de diversos tamanhos (pequenas, médias e grandes) e colorações (brancas, amarelas, amareladas e alaranjadas) com consistência cremosa, além de bolores de diversos tamanhos, colorações (branco, amarelo e verde) e consistências (arenoso e algodonoso). A formação de bolores se deu nas placas cujas amostras foram coletadas em locais/objetos onde ocorre intenso contato com tecido humano, por exemplo, corrimão, torneiras e dinheiro. Para as placas com PDA - Potato Dextrose Agar, em que se eram esperadas a formação de fungos (bolores e leveduras), obteve-se bolores de diversos tamanhos, colorações () e consistências (), leveduras de tamanhos médias e grandes, coloração branca, amarela, amarelada, alaranjada, cinza e rosa, com consistência cremosa. 
 
6 CONCLUSÃO 
Para as aulas realizadas em laboratório, é de extrema importância atentar-se as boas práticas e aos procedimentos. Todos os meios de cultura devem ser preparados de acordo com as orientações do fabricante. Devemos ser cuidadosos na coleta da amostra, para que fique distribuída pela placa inteira, fazendo com que os microrganismos se desenvolvam por toda a placa. Para analisarmos o desenvolvimento dos microrganismos devemos ser minuciosos, pois todo detalhe será necessário para a classificação dos microrganismos que se desenvolveram na placa de petri. Como foi apresentado na tabela de resultados, obtivemos uma grande diversidade de microrganismos no PDA e no PCA. 
REFERÊNCIAS