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Resumo 1ª prova SUPERFÍCIE CELULAR: ESTRUTURA E FLUIDEZ (Aula 1) As membranas celulares são cruciais para a vida da célula. A membrana plasmática circunda a célula, define seus limites e mantém as diferenças essenciais entre o citosol e o ambiente extracelular. Apesar de suas funções distintas, todas as membranas biológicas possuem uma estrutura geral comum: cada uma é uma fina película de moléculas de lipídeos (gordura) e proteínas unidas principalmente por interações não-covalentes. As membranas celulares são estruturas dinâmicas, fluidas e a maioria de suas moléculas movem-se no plano da membrana. ALBERTS et al., 2010. 1. Caracterizar a membrana plasmática considerando sua composição e suas propriedades fundamentais. A membrana é uma característica comum a qualquer tipo celular, ela é basicamente lipoproteica: Bicamada lipídica associada a proteínas é flexível, assimétrica e auto-selante. Composição: Lipídeos, proteínas, carboidratos e colesterol (animais) A membrana tem muitas funções, dentre as quais: 1: Funcionar como uma barreira semipermeável que impede a mistura completa dos conteúdos intra e extra celular. A célula eucariótica possui membranas que envolvem os compartimentos internos (entre citosol e compartimentos) 2: Possibilita movimento da célula: adesão, retração 3: Possibilita transmissão de sinais 4: Internalização e secreção de moléculas: trocas jogando para fora e levando para dentro moléculas. Possibilita seleção. Depende de estímulos. MODELO DO MOSAICO FLUIDO: A membrana é basicamente formada por moléculas de lipídios e proteínas associadas (unidas por ligações não-covalente). Os fosfolipídios – que são moléculas anfipáticas (possuem uma extremidade polar ou hidrofílica (cabeça) e outra extremidade apolar ou hidrofóbica – perninhas). Esses lipídeos são agrupados em duas camadas originando a bicamada lipídica (fluido bidimensional). Praticamente metade do peso da membrana é de lipídios e metade proteína, entretanto a quantidade de lipídeos é consideravelmente maior que de proteínas que tem tamanho e peso muito maior do que os do lipídio. A membrana é dinâmica e fluida. As moléculas de lipídeos estão organizadas como uma camada dupla contínua (BICAMADA LIPÍDICA – FLUIDO BIDIMENSIONAL) que atuam como uma barreira relativamente impermeável à passagem da maioria das moléculas solúveis em água. Já as proteínas que atravessam a membrana (transmembrana) medeiam quase todas as funções da membrana, como o transporte de moléculas, transdutora de sinais, conectoras do citoesqueleto à matriz extracelular ou a outra célula. 2. DISCUTIR ESTRATÉGIAS PARA A MANUTENÇÃO DA FLUIDEZ DE MEMBRANA. ESTRUTURA DOS FOSFOLIPIDEOS: Têm uma parte polar- hidrofílica (atraída pela água) formada por glicerol, fosfato, colina (pode ser modificada fica em contato com a água: com o meio extracelular ou com o citosol) e uma parte apolar - hidrofóbica formada por duas caudas de hidrocarbonetos, onde uma é reta e a outra tem uma flexão causada por uma ou duas ligações insaturadas - ligação dupla entre os carbonos (as caudas de atraem, ficando uma em direção a outra) o que os torna uma molécula anfipática, essa característica dos lipídeos é que permite a resistência da membrana para passagem de moléculas por difusão simples. Quase nada passa por difusão simples sem causar dano a celular. Se tiver uma cauda só forma uma micela - detergente. Existem diferentes tipos de fosfolipídeos (Colina, etanolamina, serina, inositol...), mas todos são anfipáticos, consequentemente as membranas de uma célula e outra são diferentes, a composição de uma monocamada também é diferente da outra monocamada de uma mesma membrana. Essa diferença pode se dar em razão dos diferentes tipos de lipídeos ou em razão da quantidade de fosfolipídeos em cada tipo celular. ESTERÓIDES: Colesterol (está presente apenas em células animas), também fazem parte da membrana e são moléculas anfipáticas, com uma região polar e outra apolar. Para o centro da bicamada se encontra a região apolar e para o meio aquoso a região polar. GLICOLIPÍDEOS: São lipídeos que possuem resíduos de açucares associados a região polar. GLICOPROTEÍNAS: Resíduos de açucares ligados a proteínas No citosol não tem resíduo de açúcar associado a proteína nem a lipídeos, somente na parte exterior da membrana (monocamada exterior) e na parte interior de certos compartimentos. Pode existir açucares livres no citosol, mas não existe gilcolípideos e glicoproteínas no citosol porque não existe a enzima que permite essa associação no citosol. Essa associação acontece dentro do golgi que é onde a enzima está presente (glicolipídios e glicoproteínas) e posteriormente são enviados para a membrana através de vesículas. Quando as vesículas brotam para Membrana Plasmática os resíduos de açúcar ficam para fora. Existe diferença na composição de lipídios em células diferentes em um mesmo individuo. PRINCIPAIS LIPÍDEOS DA MEMBRANA CELULAR: toda molécula lipídica da membrana é anfifílica ou afipática, ou seja, possui uma parte polar/hidrofílica e uma parte apolar/hidrofóbica. Os lipídeos mais abundantes na membrana são os fosfolipídios. Eles possuem um grupamento polar (cabeça – fica em contato com meio aquoso) e duas caudas de hidrocarbonetos apolares – geralmente ácidos graxos que podem variar de comprimento. Uma dessas caudas, geralmente, possui uma ou mais ligações duplas em cis (insaturada) que forma uma pequena dobra na cauda. Já a outra não possui essas ligações duplas (saturada). As caudas ficam uma em direção a outra. Quase nada passa por difusão simples sem causar dano a célula. Diferenças de comprimento e saturação nos ácidos graxos vão interferir na fluidez da membrana. Os principais fosfolipídios são os fosfoglicerídeos que possui uma estrutura central polar (glicerol – 3 carbonos). Duas longas cadeias de ácidos graxos, que formam a cauda apolar, se unem por pontes ésteres aos átomos de carbonos adjacentes do glicerol, e o terceiro átomo de carbono se liga a um grupo fosfato, que por sua vez se liga a um entre vários tipos de grupos de cabeças. Combinações diferentes entre ácidos graxos e diferentes cabeças formam diferentes fosfoglicerídeos (fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina – principais de mamíferos. A quantidade de um vai prevalecer a depender do tipo celular). Outro fosfoglicerídeo importante é a esfingomielina, composto por esfingosina (possui cadeia de gordura) ao invés de glicerol. Ela possui um grupo hidroxila livre que contribui para dar propriedade polar ao grupo de cabeça adjacente, podendo formar ligações de hidrogênio com o grupo de cabeças do lipídio vizinho, com água ou com proteína de membrana. 1) Comportamento dos fosfolipídios: Os fosfolipídios formam uma bicamada, espontaneamente, em ambiente aquoso, já que essa conformação faz com que haja um menor custo de energia (energicamente mais favorável), tendo um menor número de moléculas de água afetado. Eles podem também formar micelas interagindo as caudas para o centro e deixando as cabeças polares em volta. As mesmas forças que fazem com que os fosfolipídios formem a bicamada também proporcionam uma propriedade de autosselamento (borda livre fenda na camada contato com a água rapidamente se organizam para fechar a borda fechamento de uma bicamada energicamente mais favorável) Movimento dos fosfolipídios: As moléculas de lipídeos se difundem pela bicamada lipídica (descoberta 1970 – lipossomos e membrana negra). Os movimentos que elas mais realizam são: difusão lateral (troca de lugar com as vizinhas na mesma monocamada), rotação (elas giram ao redor do seu eixo), flexão (das caudas) e flip-flop (movimento raro de migração de umacamada para outra da bicamada – gasta muita energia). Esse movimento ocorre quando o lipídeo é sintetizado (em apenas uma monocamada de uma membrana (principalmente membrana citosólica do RE) e precisa passar para a monocamada exterior, uma vez que ele só é fabricado no meio citossólico e para passar para a monocamada exterior (não-citosólica) precisa de uma enzima (flipase-translocadora de fosfolipideos) que permite esse movimento chamado flip-flop. A FLUIDEZ DA MEMBRANA: Está relacionada à disposição, empacotamento e movimento dos lipídios. Depende de sua composição e de sua temperatura. Quanto mais curta for a cauda, quanto mais empacotadas menor é o movimento. a. Temperatura: ↑ temperatura ↑ energia cinética ↑ fluidez b. Tamanho: ↑ tamanho das caudas ↑interação entre os lipídeos ↑ restrição dos movimentos ↓fluidez c. Insaturação: ↑ insaturação ↓ empacotamento devido ao desvio na cauda ↑ fluidez. Quanto mais lipídeos insaturados maior a fluidez, uma vez que a insutaração provoca uma dobra em uma das caudas que causa um certo afastamento entre um lipídeo e outro. d. Colesterol: tem na sua estrutura anéis aromáticos. Está distribuído nas duas monocamadas. ↑ colesterol ↓ fluida (devido aos anéis rígidos e não possuem flexões que as caudas possuem). Ele diminui a mobilidade dos lipídios próximos a ele. Embora ele aumente o empacotamento dos lipídios na bicamada, isto não torna as membranas menos fluidas. Além disso, ele impede que as cadeias de hidrocabonos se agrupem e se cristalizem. OBS: Alguns organismos fazem uma modulação para se proteger das diferenças de temperatura. Ex. peixe água gelada, a membrana tem muito fosfolipídio de cauda curta e mais insaturação- movimento compensatório para deixar a membrana mais fluida. 2) Assimetria da bicamada lipídica: a bicamada lipídica possui uma grande variedade de espécies de lipídios. Essa variedade vai ser muito importante para as vias de sinalização celular. Existem vias que só transmite o sinal na presença de tipos de moléculas de lipídio específica. Elas vão mediar a transferência de sinal/via de comunicação celular (mudança de monocamada da fosfatidilserina quando há apoptose da célula), por isso a importância de não termos tipos iguais de lipídios na membrana (fosfolipase C e PI-3 cinase) 3) Balsas lipídicas: Lipídios se movimentam, fazem rotação em volta do próprio eixo e deslocamento. Isso é muito importante para fluidez da membrana. Em algumas situações formam aglomerados em que eles se agrupam formando uma rede dinâmica de diferentes domínios (balsas). Certas regiões especializadas da MP, tais como a cavelola (caveolina – proteínas de cobertura), envolvida na endocitose , são enriquecidas de enfingolipídios e colesterol e acredita-se que proteínas específicas se reúnam nestas regiões para auxiliar na estabilização das balsas. Esses domínios são mais espessos e acomodam mais proteínas de membrana. Com isso, as balsas lipídicas podem auxiliar a organizar proteína da membrana e concentra-las para o transporte em membrana de vesículas ou para converterem sinais extracelulares em intracelulares (sinalização, recepção e transmissão de sinal). 4) Colesterol e glicolipídeos: A membrana plasmática, eucariótica, contém grandes quantidades de colesterol (esterol - esteroide). Seu grupo hidroxila fica orientado próximo aos grupos de cabeça polares das moléculas de fosfolipídeo, portanto, se associa a membrana na mesma direção. Os glicolipídeos são molécula de lipídio com resíduos de açúcar que se associam à região polar e são encontrados exclusivamente na região não-citosólica da célula. Nas células animais elas são constituídas de esfingosina, exatamente como esfingomielina. O lúmen do compartimento, em especial golgi ou retículo, sintetiza esses resíduos de açúcar (enzimas promovem a glicosilação dentro do golgi ou retículo e são adicionados dentro do golgi) e quando as vesículas brotam para a membrana plasmática, esse açúcar fica na porção extracelular (parte externa da célula) onde desempenham funções importante como interação da célula com sua vizinha (lectinas se ligam aos grupos de açúcares dos glicolipídeos e glicoproteínas – medeiam processos de adesão célula-célula como espermatozoide e óvulo, coagulação sanguíneo etc.), proteger a célula de severas condições (baixo ph e altas concentrações de enzimas degradantes). OBS: a membrana celular animal contém: lipídeos, proteínas, carboidratos (açúcares, voltados para o lado de fora – só estão do lado de fora – podem estar livres no citosol, mas não vai ter a enzima que associa ele a proteína. São formados dentro do golgi (glicolipidios e glicoproteinas)). É flexível, assimétrica e auto- selante. 5) Proteínas de membrana: Desempenham a maioria das funções específicas de membrana e fornecem a cada tipo dessa membrana características e propriedades funcionais. Em uma membrana plasmática típica vão ter quantidades intermediárias de proteínas com mais ou menos 50% da massa. Essas proteínas vão variar bastante na estrutura e no modo de como vão se associar a bicamada lipídica, refletindo suas funções. a. Associação das proteínas com a bicamada lipídica: podem ser integrais onde vão se ligar sozinhas ou por lipídios na membrana – só sai utilizando detergente) ou periféricas onde precisam de outra proteína para se ligar a membrana – feita por ligação iônica se dissocia mais fácil – variação de concentração de íons e sais, ph) i. Transmembrana: Se estende por toda bicamada com parte de sua massa dos dois lados. Possui orientação única na membrana, refletindo na maneira assimétrica de como ela se insere na bicamada no RE durante sua biossíntese e as diferentes funções de seus domínios. São anfifílicas (região hidrofóbica - que interage com as caudas dos lipídios pelas cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos - e uma região hidrofílica- exposta à água dos dois lados da membrana). A ligação covalente da cadeia de ácidos graxos na monocamada citosólica aumenta a hidrofobicidade de algumas dessas proteínas. A maioria delas possui o segmento que passa pela membrana em alpha hélice. Já em cloroplastos, bactéria e mitocôndrias esse segmento pode ser na forma beta pregueada. 1. Conformação α – hélice: todas as ligações peptídicas na bicamada são dirigidas para a formação de ligações de hidrogênio. Elas vão ser maximizadas se a cadeia forma uma α – hélice irregular na região que cruza a bicamada. As cadeias polipeptídicas podem cruzar a membrana somente uma vez (unipassos – faz mais do que apenas ancorar a proteína na membrana, elas formam homodímeros unidos por interações fortes e específicas entre as duas aplha-hélices da membrana) ou várias vezes (multipassos – as interações entre as hélices vizinhas são essenciais para estrutura e função de muitos canais e transportadores que movem moléculas através da bicamada). Elas formam poro aquoso nas membranas, eles são formados por varias α- hélices transmembrana multipassos para transporte de moléculas. Formam um canal por onde a molécula pode passar. As unipassos não vão operar no transporte de moléculas, mas pode atuar como receptores e transmissoras de sinais. As hélices podem deslizar, mudando sua conformação que pode abrir ou fechar canais iônicos, transportar soluto e transduzir sinais extracelulares em intracelulares. 2. Conformação barril-β: maneira alternativa para as ligações peptídicas onde se formam múltiplas fitas transmembranas que se organizam em folhas β torcidas em forma de um barril fechado. Abundante nas membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias. Essa conformação é observada em proteínas porinas – poros que criam um canal cheio de água permitindo que pequenas moléculas hidrofílicas selecionadas atravessem a bicamada da membranaexterna bacteriana. O canal é formado internamente por uma cadeia lateral de aminoácidos polares e externamente por uma cadeia lateral de aminoácidos apolares que interagem com o centro hidrofóbico da bicamada. Além de agirem como transportadores os barril – β agem também como enzimas ou receptores. A mudança conformacional nos barris é pouco provável. ii. Associada à membrana: são localizadas inteiramente no citosol e são ancoradas ou por um segmento em alpha hélice que se liga à monocamada citosólica da bicamada lipídica. Mediador de sinal, funciona como enzima, age secundariamente, mas não como receptor de sinal. iii. Ligadas por meio de lipídios: são localizadas inteiramente no citosol e ancoradas a monocamada por uma ou mais cadeias lipídicas covalentemente ligadas. Existem também proteínas que são produzidas no RE e que se ancoram a monocamada da bicamada por uma ligação covalente de um oligossacarídeo específico ao fosfatidilinosital da porção externa da bicamada (ancoramento de glicosilfosfatidilinositol (GPI)). Elas ficam na porção externa da superfície celular. Algumas enzimas como a fosfolipase C específica podem facilmente quebrar essa ligação liberando as proteínas da membrana. iv. Ligadas por outra proteína: se prende por ligação iônica a uma outra proteína de membrana. Podem ser liberadas por exposição a forças iônicas muito baixas ou muito altas, pH extremo. OBS: o modo como as proteínas estão dispostas na bicamada lipídica vão interferir diretamente na sua função. As transmembranas estão diretamente ligadas a transporte de moléculas e receptoras de sinal extracelular. Já as que atuam só de um lado da bicamada vão servir para sinalização celular. Pode acontecer um segundo tipo de ancoramento dessas proteínas com a monocamada. Eles vão ser necessários para um ancoramento mais forte da proteína com a monocamada, já que somente um ancoramento lipídio não é muito forte. Como exemplo temos a âncora miristoil – realizado em todos os membros de proteínas da família Src tirosina-cinase - e palmitol – modificação lipídica feita em resposta a um sinal extracelular que auxilia a recrutar cinase para membrana plasmática. Quando o sinal é desligado essa ligação é desfeita e as cinases voltam para o citosol. OBS: A maioria das proteínas transmembranas é glicosilada. Assim como os glicolipídios, as glicoproteínas também recebem os resíduos de açúcar no RE e golgi. Por isso, as cadeias de oligossacarídeos vão estar presente sempre na porção não-citosólica da célula. Nessa porção também encontramos as ligações dissulfeto inter e intra cadeias polipeptídicas, já que no meio citosólico, por ser redutor, impede esse tipo de ligação (auxiliam na estabilização da estrutura dobrada dessas cadeias). Além de ocorrerem como cadeias de oligossacarídeos, também podem se apresentar como cadeias de polissacarídeos das moléculas de proteoglicanos (cadeia polissacarídica que se ligam ao centro da proteína) integrais de membrana. OBS2: As proteínas de membrana podem ser solubilizadas por detergentes. Esses são moléculas anfifílicas sendo mais solúveis em água do que em lipídios. Suas regiões polares podem ser carregadas (iônicas) ou não-carregadas. Em altas concentrações eles se agregam formando micelas. Quando são misturados à membrana as extremidades hidrofóbicas interagem com a região hidrofóbica das proteínas de membrana, deslocando os lipídios. Mas, geralmente os lipídios ainda ficam ligados à proteína. Em alguns casos, quando o detergente é removido a proteína se renatura, recuperando sua atividade funcional. b. Funções das proteínas de membrana: transporte de moléculas, âncoras do citoesqueleto (vão dar forma à célula), receptoras e transdutoras de sinais, enzimas. Vão dar funcionalidade à célula. c. Mobilidade das proteínas de membrana: Foi descoberto pela fusão de célula de camundongos com células de humano utilizando dois anticorpos marcados diferentes. As proteínas giram (difusão rotacional) e fazem movimento lateral, mas nem todas podem fazer esse movimento de difusão lateral. Muitas células confinam proteínas de membrana em regiões específicas da bicamada. As âncoras não podem ficar se movimentando, restrição de movimento. O movimento vai ser restrito dependendo da função da proteína. No intestino as células epiteliais que o formam e ficam na região apical não se movem porque tem junções ocludentes, mas já as outras podem se mover. Elas não saltam (flip-flop) na bicamada lipídica. A célula pode criar domínios sem usar junções intercelulares e as moléculas de cada domínio se movimentam somente no seu espaço restrito. O citoesqueleto proporciona força mecânica e restringe a difusão de proteínas de membrana como nos eritrócitos onde o citoesqueleto interage com proteínas da membrana plasmática. Existem cinco formas de restringir a difusão lateral das proteínas: elas se auto- agrupam em grandes agregados, presas por meio de interações com agregados de macromoléculas dentro ou fora da célula, interagir com proteínas de outra célula, separação por domínios e como âncora do citoesqueleto. d. Glicocálice: Região rica em carboidratos associados a proteínas ou lipídios. Além de moléculas de carboidratos ligadas a estruturas intrínsecas da membrana existirão também glicoproteínas e proteoglicanos que são secretados para o espaço extracelular e então adsorvido pela superfície celular nessa região. Funções: proteção mecânica e química, contra ação enzimática, phs extremos, lubrificação, reconhecimento celula-celula principalmente em processo inflamatório, adesão, manter outras células à distância, prevenindo interações indesejáveis proteína-proteína. TRANSPORTE (Aula 2) 1) A permeabilidade da bicamada lipídica: A bicamada lipídica, devido ao seu interior hidrofóbico serve como uma barreira para a maioria das moléculas polares. Essa função de barreira faz com que a célula mantenha concentrações de solutos diferentes no citosol, no meio extracelular e no interior dos compartimentos. Diante dessa situação a célula criou meio para fazer transporte de moléculas hidrossolúveis e íons essenciais para sua sobrevivência (ingerir nutrientes, excretar produtos metabólicos, regular a concentração celular de íons). Para esse transporte as células utilizam as proteínas transportadoras transmembranas (15% a 30% de todas as proteínas de membrana). As proteínas vão possibilitar o transporte seletivo de moléculas. Cada tipo celular possui o seu repertorio de proteínas transportadoras próprias para passar moléculas que vão funcionar naquela célula ou compartimentos. Alguns íons estão concentrados mais no citosol e outros externamente (potássio – K – está mais concentrado dentro, já o sódio - Na – está mais concentrado do lado de fora). Deve haver um equilíbrio na quantidade de soluto e de cargas dentro e fora da célula, ou seja, uma quantidade equivalente. Se isso não acontecer haverá uma tendência da água se deslocar do local mais concentrado pro menos concentrado. 2) Difusão simples: Transporte passivo (sem gasto de energia) do meio mais concentrado para o menos concentrado feito sem a ajuda de proteína. Se tiver tempo suficiente, praticamente qualquer molécula difundirá através da bicamada lipídica livre de proteínas a favor do seu gradiente de concentração. Vai depender do tamanho da molécula e da solubilidade em lipídios (quanto mais hidrofóbica mais fácil de difundir). Pequenas moléculas apolares como O2 e CO2 e moléculas sem carga como ureia e água (mais lentamente) se difundem rapidamente. Na bicamada lipídica das membranas celulares algumas estruturas passam por difusão simples como: moléculas hidrofóbicas pequenas, moléculas polares não carregadas pequenas. Os íons e moléculas polares não carregadas (açúcares, aminoácidos,nucleotídeos) precisam das proteínas transportadoras para passar pela membrana. a. Difusão da água – osmose: vai ocorrer quando a concentração de soluto estiver muito alta em algum meio. Por exemplo, se no interior da célula a concentração de soluto for alta e no meio extracelular for baixa, a água tende a entrar na célula por osmose, intumescendo a célula. Se entrar muita água a célula incha, fica turgida,há pressão de turgor e pode causar a ruptura da membrana da célula (plasmoptise). Se a água for muito para fora a célula fica murcha (crenada, plamolisada, desidratada). No meio hipertônico (+ íons fora), célula crenada; no meio muito hipotônico (- íons fora), célula lisada. Alguns tipos celulares utilizam estratégias para evitar o intumescimento osmótico: Bomba de íons para equilibrar a concentração de soluto e íons (célula animal), parede celular e vacúolo na célula vegetal e o vacúolo contrátil de descarte em protozoários. 3) Proteínas de transporte de membrana: responsáveis pelo transporte de solutos (íons e moléculas polares não carregadas). Elas ocorrem de várias formas e em todos os tipos de membranas biológicas. Cada uma transporta determinada classe de molécula, ou seja, são bastante específicas. Nos humanos alguns defeitos nessas proteínas podem causar doenças como a cistinúria - cálculos renais de cistina (não conseguem transportar a cistina – aminoácido – do intestino ou urina para o sangue causando um acúmulo decistina). Elas vão mediar o transporte passivo (+ concentrado pro - concentrado) por difusão facilitada e o transporte ativo (- concentrado pro + concentrado), com gasto de energia. Todas as proteínas transportadoras serão multipassos, permitindo que os solutos hidrofílicos atravessem a membrana sem entrar em contato com a região hidrofóbica. Possui dois tipos: a. Transportadoras/permeases/carreadoras: elas possuem sítios de ligação para o soluto. Com isso, ela muda conformação e libera a molécula do outro lado da bicamada lipídica. O processo que essas proteínas utilizam para transferir o soluto se assemelha a reação enzima-substrato, porém a proteína não modifica o soluto durante o transporte. Cada tipo possui um ou mais sítios de ligação específicos para seu soluto (substrato), ele é transferido na bicamada por alterações conformacionais reversíveis que expõe, alternadamente, o sítio de ligação ao soluto primeiro em um lado da membrana e depois do outro. Quando todos os sítios estão preenchidos o transporte chega a uma velocidade máxima. Essa ligação aos sítios podem ser bloqueadas, assim como as enzimas, por inibidores competitivos ou por não-competitivos – se ligam em qualquer parte e alteram a estrutura do transportador. Pode mediar tanto transporte ativo quanto passivo a depender do gradiente de concentração. Podem ser uniportes ou acoplado (simporte ou antiporte). b. Canal: são canais iônicos, em geral. Só faz transporte passivo. Não ficam abertos o tempo todo, para abrir precisam ser estimulados: elétrico (alteração do potencial de membrana), químico (ligação do ligante – neurotransmissor, íon e nucleotídeo - no sitio especifico para ele no canal intra ou extracelular) ou mecânico (estresse, contato celula-celula – no aparelho auditivo). Por elas vai passar, principalmente, os íons (canal iônico). Interage pouco com o soluto, forma um poro hidrofílico/aquoso por onde a molécula passa. Sempre vai mediar o transporte passivo. São seletivos e estreitos que se abrem e se fecham rapidamente. A velocidade desse transporte por esse tipo de proteína vai ser muito maior. Como exemplos de canais têm os canais nas sinapses nervosas (mudança de potencial elétrico pela emissão do impulso nervoso/sinal elétrico - abre o canal de cálcio- e ligante – que é o neurotransmissor na fenda sináptica que promove a abertura do canal para passagem de íons e gera mudança de potencial elétrico/sinal elétrico) e o fechamento foliar na mimosa (controladas por voltagem). Sua função principal é promover a difusão rápida de íons inorgânicos específicos (Na+, K+, Ca2+ ou Cl-) a favor do gradiente eletroquímicos. Mesmo sabendo que a água passa por difusão simples por osmose, as células possuem também canais de água ou aquaporina que aumentam ainda mais a permeabilidade da membrana à água. Elas são abundantes em células epiteliais dos rins onde precisam transportar água sob altas taxas. Para impedir a passagem de íons juntamente com a água, os canais de aquaporinas possuem um estreito poro que permite que as moléculas de água atravessem em fila única seguindo o caminho dos oxigênios da carbonila que reveste o poro. O canal também é muito estreito para passar qualquer íon hidratado e para desidratá-lo precisaria de um gasto muito grande de energia. i. Seletividade dos canais iônicos: quando o canal se abre não é qualquer íon que passa por ele. Permite a passagem de alguns íons e não de outros. Isso sugere que seus poros sejam estreitos o suficiente para que haja um contato com as paredes do canal que somente íons de determinada carga e tamanho passem. Os íons devem perder a maioria das moléculas de água para passar no canal através da parte mais estreita do canal (filtro de seletividade do canal – limita taxa de passagem). Os canais também não estão abertos continuamente como os simples poros aquosos, eles são controlados abrindo por um breve tempo e fechando novamente. A atividade dos canais iônicos também é controlada por fosforilação e desfosforilação de uma proteína. Os mais comuns são os de K+. Um subconjunto desses canais (canais de escape de K+) ficam abertos mesmo em células não-estimuladas, sendo muito importantes na manutenção do potencial de membrana. Presente na membrana plasmática de praticamente todas as células. A interação do potássio com a carbonila da proteína faz com que a água se dissocie do potássio. Devido ao tamanho o sódio não interage com a carbonila e ele junto com a água não consegue passar – nos canais de potássio, por isso só passam no canal específico de cálcio. Mesmo a canal de potássio não fechando todo, a pequena abertura é revestida pelas cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos dos canais que bloqueiam a entrada de íons. ii. Potencial de membrana e canal de escape/vazamento de K+: o potencial ele é gerado quando há uma diferença na carga elétrica entre os dois lados da membrana devido a um leve excesso de íons positivos sobre o negativo de um lado da membrana e um déficit no outro lado. Essa diferença vai gerar um bombeamento eletrogênico ativo e uma difusão passiva de íons. Como existe pouco Na+ na célula (devido a bomba que controla a osmolaridade da célula) existem outros cátions para equilibrar a carga com os ânions fixos da célula. A manutenção desse equilíbrio é feito pelo potássio que é bombeado para dentro da célula e pode entrar ou sair pelos canais de escape de K+. Esses canais vazantes de potássio permitem a sua saída e isso mantém o interior mais negativo, ligeiramente. O que atrai, por sua vez, o potássio para dentro. Assim fica balanceado. Potássio mais do lado de dentro abre canais de potássio vão para fora a favor do gradiente gera potencial de membrana o efluxo de potássio termina quando o gradiente eletroquímico for zero para o K+ íons negativos atraem íons positivos para dentro potássio entra bomba de sódio e potássio. O potencial de membrana é a manifestação dessa força elétrica. O número de íons que precisam se movimentar para gerar esse potencial é pequeno, assim, o potencial de membrana é formado pelo movimento de cargas que quase não afetam as concentrações de íons. Se a bomba de sódio e potássio parar os gradientes de íons gerados pelo bombeamento diminuirão e o potencial de membrana também estabelecido pelos canais de K+ também diminuirá.Embora o gradiente de K+ seja o principal gerador de potencial de membrana também existem outros íons que geram esse potencial. Quanto mais permeável a membrana for a um determinado íons mais forte o potencial de membrana tende a ser dirigido para o valor de equilíbrio com esse íon. iii. Estrutura do neurônio: A tarefa fundamental do neurônio é receber, conduzir e transmitir sinais. Para isso, eles são extremamente longos. Cada um consiste em corpo celular (contendo o núcleo) ramificado por várias protuberâncias finais (processos) radiadas para fora dele, axônio (conduz os sinais do corpo celular para alvos distantes) e os dendritos (curtos e ramificados que se estendem do corpo celular como antenas, fornecendo uma grande área para receber sinais dos axônios e de outras células nervosas). O corpo celular também recebe sinais. A forma do sinal é sempre a mesma que consiste em mudança no potencial elétrico através da membrana plasmática do neurônio. iv. Potencial de ação: é gerado quando há uma alteração do potencial de membrana. É uma onda de excitação elétrica. Tudo isso a partir de um estimulo. Os potenciais de ação são consequências diretas das propriedades dos canais de cátions controlados por voltagem. A membrana de todas as células eletricamente excitáveis (neurônios, musculares, endócrinas e óvulos) possuem canais de cátions controlados por voltagem, responsáveis pela geração do potencial de ação. Esse potencial é desencadeado por uma despolarização da MP, ou seja, por uma alteração no potencial da membrana para um valor menos negativo em seu interior. As células nervosas e musculoesqueléticas um estímulo causa a despolarização suficiente para abertura dos canais de Na+, permitindo a entrada de pequenas quantidades desse íon a favor do seu gradiente. A célula possui dois mecanismos em conjunto para impedir a entrada sem parar de Na+ na célula: o primeiro é a inibição dos canais de Na+ e o segundo é a ativação dos canais de potássio. Tem um ponto em que o canal de sódio (pode ser aberto, fechado ou inativado) fica inativo e não pode entrar mais sódio mesmo que a membrana esteja despolarizada. Ai induz a abertura de canais de potássio. Eles saem da célula e a carga positiva sai, ficando negativo o canal de membrana. Ate um ponto que esses canais ficam inativos e a membrana volta a seu potencial de repouso. Ao longo do axônio vão existir vários canais de sódio. Fica inativo ate o potencial voltar ao estado de repouso (potássio sai) que é quando se fecham. v. Transmissão neuromuscular: Os sinais neuronais são transmitidos de uma célula para outra em sítios conhecidos como sinapses (células pré-sinápticas, fenda sináptica e células pós-sinápticas). Uma mudança de potencial na célula pré-sináptica desencadeia a liberação de neurotransmissores por exocitose. Ele se difunde através da fenda e provoca mudança elétrica na célula pós-sináptica por ligação aos canais iônicos controlados por transmissor e abertura desses canais. Esses neurotransmissores após realizar o seu papel é reciclado/recaptado ou destruído por enzimas (essa rápida remoção vai ser importante para que os neurotransmissores não interfiram nas células vizinhas). Os canais iônicos controlados por transmissores são especializados em converter sinal químico em elétrico nas sinapses químicas. Eles se abrem em reação a ligação química e gera uma breve mudança de permeabilidade na membrana. Não são sensíveis ao potencial de membrana, portanto o seu sinal não é autoamplificável. Em vez disso, eles promovem mudança na permeabilidade local e consequentemente gera mudança de potencial de membrana. Assim, um potencial de ação só poderá ser desencadeado se esse potencial local de membrana despolarizar a ponto de abrir os canais de cátions localizados na membrana da célula alvo. As sinapses químicas podem ser de dois tipos: excitatórias (abrem canais de cátions induzindo um influxo de Na+ que despolariza a membrana para ativar o potencial de ação) ou inibitórias (abrem os canais de Cl- ou de K+ suprimindo a ativação por dificultar a despolarização da membrana pós-sináptica). Muitos neurotransmissores podem ser excitatórios ou inibitórios a depender de onde são liberados, quais receptores que o ligante se liga e quais condições iônicas se encontram. A acetilcolina, serotonina, geralmente é excitatória, mas pode ser também inibitória. Como agem antidepressivos e ansiolíticos (inibem a captação da serotonina ou tanto de serotonina como de norepinefrina). 1. Como ocorre¿ impulso nervoso nas terminações nervosas despolariza a membrana abre o canal de Ca+ o cálcio flui a favor do seu gradiente para dentro da célula liberação de acetilcolina na fenda sináptica ligação aos receptores de acetilcolina o canal se abre influxo de Na+ despolarização da membrana os canais controlados por voltagem se abrem entra mais Na+ propagação da despolarização por toda membrana ativa canais de cálcio controlados por voltagem ativação provoca abertura dos canais de liberação de cálcio próxima à membrana do RS cálcio no citosol contração das miofibrilas na célula muscular. vi. Receptores de acetilcolina: é um canal iônico controlado por transmissor formado por 5 subunidades. Ele é aberto quando a acetilcolina é liberada na fenda sináptica (junção neuromuscular) e se liga a ele em seu sítio em dímero em dupla. Ele fica aberto até que a quantidade de acetilcolina seja diminuída suficiente pela hidrólise de uma enzima localizada na junção neuromuscular e ele volta a seu estado de repouso. Se a quantidade de acetilcolina persistir por um longo período ele fica inativo. O tráfego normal de íons que passa por ele é de Na+ e K+, prevalecendo a passagem do sódio. Existe pouca seletividade. Esse influxo grande Na+ induz a despolarização na membrana que sinaliza o músculo para contrair. vii. Sinapses no corpo celular e dendritos: um único neurônio pode receber informações de outros milhares de neurônios. Milhares de terminações nervosas realizam sinapses em um neurônio motor típico na medula espinal. Seus dendritos e corpo celular ficam revestidos por elas. Ele deve pegar cada uma das informações vindas de lugares diferentes e reagir disparando potenciais de ação ao longo do seu axônio. OBS: Não existem somente os canais de Na+ controlados por voltagens, em células musculares e óvulos vamos ter a presença de canais de Ca+ controlados por voltagem. Algumas mutações nos genes que darão origem às proteínas canal podem gerar doenças como a miotonia (o relaxamento muscular após a contração é retardado, gerando espasmos dolorosos, ou seja, a inativação dos canais não ocorre, deixando mais sódio dentro da célula. A despolarização se reinicia rapidamente.) e a epilepsia (semelhante a miotionia, mas nas células nervosas) OBS: Técnica de registro de região grampeada (patch-clamp) – permitiu a análise do transporte através de uma única molécula de proteína canal em uma pequena região da membrana cobrindo a abertura com uma micropipeta. Com isso, possibilitou o estudo detalhado dos canais iônicos em qualquer tipo de célula. Com esse trabalho foi descoberto que mesmo as células não eletricamente excitáveis possui também uma variedade de canais iônicos controlados. Esses registros indicaram ainda que os canais de Na+ controlados por voltagem abrem de modo tudo ou nada, ou seja, o número de íons que vai passar não vai mudar o que muda é o número de canais que vão abrir ao mesmo tempo na membrana. 4) Gradiente eletroquímico: não só o gradiente de concentração que vai determinar a passagem dos solutos pela bicamada. Existe também uma carga que vai definir a velocidade e a possibilidade das moléculas passarem, já que existe uma diferença de potencial elétrico atravésda membrana (potencial de membrana) onde o seu interior é geralmente negativo em relação ao seu exterior. Essa diferença favorece a entrada de íons positivamente carregados, se contrapondo a entrada de íons carregados negativamente. O gradiente de concentração e o potencial de membrana podem ser combinados para calcular uma força motriz chamada de gradiente eletroquímico para cada soluto carregado. Se não houver potencial de membrana o cátion passa mais facilmente. Se existir um potencial negativo no interior de célula e fora estiverem íons carregados positivamente, há um aumento na velocidade e quantidade desses íons, já que a carga atrai + com -. Se dentro da célula estiver com potencial positivo e fora estiverem uns íons carregados positivamente, eles vão se deslocar para dentro com uma movimentação restrita por causa da repulsa nas cargas, intensidade menor. Portanto, o gradiente de concentração junto com o potencial de membrana podem agir aditivamente para aumentar a força motriz sobre um íon ou podem atuar um contra o outro. 5) Transporte ativo: Vai ocorrer contra o gradiente de concentração por proteínas transportadoras/carreadoras. Pode ser feito de três maneiras: i. Transportador acoplado: onde o transportador acopla o soluto que vai contra o gradiente de concentração junto com o outro que vai a favor. Duas moléculas são transportadas usando a mesma proteína transportadora. A energia que vai dirigir o transporte vem da passagem de um íon a favor do seu gradiente de concentração para transportar o outro e não da hidrolise de ATP. O Na+ é o íon mais utilizado para esse tipo de transporte. Esses carreadores dirigidos por íons são mediadores de um transporte ativo secundário, por ATP é transporte ativo primário. b. Simporte/cotransportadores: duas moléculas na mesma direção como a glicose e o sódio (principal íon que vai mediar o transporte). O Na+ vai a favor do seu gradiente e o açúcar é arrastado junto com ele para dentro da célula (células epiteliais intestinais). Quanto maior o gradiente eletroquímico para o Na+ maior a taxa de entrada do soluto e vice-versa. Nas bactérias o que direciona a entrada do açúcar é o H+. Nas células intestinais ocorre o simporte do Na+ com a glicose pelas proteínas na região apical (absorção). Essa glicose depois vai sair pela região basal para o fluido extracelular que vai para o sangue sendo utilizada em outros tecidos a favor do seu gradiente (transporte passivo) c. Antiporte/permutadores: duas moléculas em direções opostas como o sódio e o cálcio; sódio e H+. É um transporte ativo. O transporte de sódio e H+ auxilia na manutenção do pH da célula em torno de 7,2, pois joga o Na+ para dentro e o excesso de H+ para fora, assim como a captação pela célula do HCO3- (influxo de Na+ e HCO3- e efluxo de Cl- e H+ - NaHCO3 entra e HCl sai) para que junto com o H+ forme H2O e CO2. Se a célula ficar alcalina o permutador Cl-HCO3+Na+ ocorre de forma contrária – HCO3 é jogado para fora da célula. ii. Bombas acionadas por ATP/transportadoras ATPases: utilizam hidrólise de ATP para gerar energia e seguir contra o gradiente. iii. Bomba do tipo P: São denominadas do tipo P, pois se autofosforilam. A bomba de sódio e potássio é um exemplo desse tipo de bomba acionada por ATP. Ela possui um papel importante nas células animais, pois mantém o equilíbrio de soluto dentro e fora da célula. Trabalha sem parar para não haver o desequilíbrio e a célula morrer. Ela joga sódio para fora e potássio para dentro. Funciona assim: precisa existir sítios para esses dois íons na proteína transportadora. O certo é manter o sódio fora e potássio dentro. 3 sódios saem 2 potássios entram ao mesmo tempo. A ligação do sódio ao sitio vai ativar a proteína, hidrolisando o ATP (atpase); o fosfato resultante da quebra se liga a proteína e promove a autofosforilação desencadeando algumas mudanças conformacionais após a saída do sódio. Quando o potássio se ligar existirá uma desfosforilação da proteína, perdendo o fosfato, muda conformação, potássio sai, expõe o sitio para o sódio, pega ATP do meio, fosfato acoplado a ela e tudo acontece novamente. A bomba de sódio e potássio ajuda na manutenção do equilíbrio osmótico da célula bombeando Na+ para fora, já que ele flui para dentro a favor do seu gradiente de concentração. Outro exemplo de bomba do tipo P é a bomba de Ca+. O cálcio mantém quantidades muito maiores no meio extracelular do que no meio intracelular. A manutenção de um gradiente acentuado de Ca+ é muito importante para a célula e isso é feito por uma bamba do tipo P e um transportador antiporte dirigido pelo gradiente eletroquímico de Na+. Essa bomba está mais presente na membrana do retículo sarcosplasmático (estoque intracelular de Ca+) de células musculares esqueléticas. O Ca+ é liberado para células musculares através dos canais de liberação de Ca+ quando um potencial de ação despolariza a membrana de célula muscular, havendo a contração muscular. A bomba de Ca+ vai ser responsável por mandar de volta esse cálcio que saiu do RS. i. Bomba de prótons do tipo F: São proteínas semelhantes à turbinas, construídas a partir de subunidades diferentes. São distintas estruturalmente das ATPases do tipo P. Como exemplo temos a bomba de prótons, íons h+ contra o gradiente de concentração. Está presente na membrana das bactérias, mitocôndrias, membrana tilacoide dos cloroplastos. Ela é operada por complexos proteicos, atua de forma reversa, chamadas de ATPsintases. Ao invés do ATP ser hidrolisado para dirigir o transporte de H+ ela utiliza o gradiente de concentração de H+ (gerado nos transportes de elétrons na fosforilação oxidativa) através da membrana para direcionar a síntese do ATP a partir do ADP e fosfato. Também funciona de forma contraria. OBS: O piruvato e os ácidos graxos entram na mitocôndria e são convertidos em acetil-CoA, que é metabolizada pelo ciclo do ácido cítrico, o qual reduz NAD+ e FAD em NADH e FADH2. Os elétrons de alta energia carregados pelo NADH e FADH2 são transferidos ao longo da cadeia transportadora de elétrons da membrana interna da mitocôndria para o oxigênio, formando água. Esse transporte de elétrons gera um gradiente de prótons (concentração maior fora da mitocôndria). Eles vão atravessar a membrana mitocondrial interna a favor do gradiente de concentração, passando pelo complexo ATPsintase, gerando energia, ligando um fosfato ao ADP, formando ATP. ATPsintase: bomba de tipo F. No momento que funciona de forma reversa não é uma bomba de fato, mas também funciona dentro do contexto de transporte transportando molécula contra o gradiente de concentração. Transportador ABC: Bombeiam pequenas moléculas através das membranas celulares e íons, em contraste das outras bombas que só bombeiam íons. Possui dois sítios de ligação pro ATP. A ligação do ATP leva a dimerização dos dois domínios de ligação a ATP e a hidrólise leva a sua dissociação. Funciona em bactérias e células eucarióticas, essa ligação do ATP gera alteração conformacional da proteína e, alternadamente, expõe os sítios de ligação ao substrato para um ou outro lado da membrana. O transporte é unidirecional em células eucarióticas (só exportação), já em bactérias pode ser para exportação e importação. Alem de íons também transporta moléculas pequenas. Em células cancerosas algumas proteínas desse tipo (transportadora MDR) são superexpressas e acabam jogando o fármaco para fora delas, ficando resistentes aos efeitos deles. b. Bombas acionadas por luz: encontrado em bactérias e arquebactérias. A energia vinda da luz vai gerar energia para o soluto ir contra o gradiente. OBS: Ação dos digitálicos: para acontecer contração cálcio precisa entrar na célula. Eles saem por antiportadoresque pegam o sódio para dentro (a favor do seu gradiente) e levam o cálcio para fora contra o seu gradiente, realizando o relaxamente. Se eu inibo a bomba de sódio e potássio menos sódio vai ficar do lado de fora, mais sódio vai ficar do lado de dentro e menos cálcio saindo, já que ele é trocado por sódio extracelular. Ele ficando mais tempo dentro da célula vai gerar uma força maior na concentração. ENDOMEMBRANAS E TRANSPORTE DE MACROMOLÉCULAS (Aula 3 e 4) 1) Endomembranas: As células eucarióticas possuem compartimentos internos envoltos por membranas que evoluíram. Cada um possui funções próprias e possui seu conjunto formado por enzimas e outras moléculas especializadas que farão parte de um sistema de distribuição complexo de transporte de produtos específicos. O que dá funcionalidade e características estruturais a cada um são as proteínas, tanto solúveis quanto as que ficam aderidas a membrana (marcadores de superfície) que ajuda a direcionar a entrega de outras proteínas e lipídios em organelas específicas. Elas catalisam reações e transportam seletivamente pequenas moléculas para dentro ou para fora do lúmem. A síntese de cada uma delas é, na maioria das vezes, iniciada no citosol para então ser entregue ao compartimento celular que a necessite. O sistema de membrana de cada compartimento celular é muito importante, pois separa o seu conteúdo interno onde vão ocorrer reações importantes do citosol. Essas membranas vão ter a mesma estrutura da MP, tendo também presas a ela proteínas que vão permitir a passagem de metabólitos específicos. Além disso, elas precisam ser dotadas de mecanismos que importem e incorporem, na organela, proteínas específicas que a tornam única. Os principais compartimentos intracelulares são: citosol (sítio de síntese e degradação de proteínas), aparelho de golgi (recebe lipídios e proteínas vindas do RE e envia-os para vários destinos, geralmente, modificando-os durante a via), núcleo (contém o genoma, sítio para síntese de DNA e RNA), retículo endoplasmático (rugoso – os ribossomos ficam presos, síntese de proteínas solúveis e integrais de membrana, produção de lipídios para o restante da célula, reservatória de íons de Ca+ e liso), mitocôndria (geram a maior parte do ATP utilizado pela célula para reações que precisam de energia), peroxissomos (contém enzimas que são utilizadas em reações oxidativas), lisossomos (contém enzimas digestivas que degradam organelas mortas, assim como macromoléculas ou partículas englobadas pela célula por endocitose), endossomos. Geralmente o golgi se localiza próximo ao núcleo, enquanto o RE se estende do núcleo por todo o citosol. Essa distribuição vai depender da interação dessas organelas com o citoesqueleto (microtúbulos) da célula. 2) Evolução das organelas envoltas por membranas: os precursores das células eucarióticas são organismos simples, semelhante a bactérias que possuem membrana plasmática, mas não membranas internas. Nessas células a membrana plasmática realizava todas as funções que dependessem de membrana como bombeamento de íons, síntese de ATP e síntese de lipídios. A compartimentalização deve ter surgido a partir de dobras que a membrana fez para dentro, e, para isso, devem ter tido uma razão. Toda vez que a célula vai se dividir ela aumenta o volume, assim, casualmente, ela aumentou o volume, e, por algum motivo, não se dividiu. O volume cresceu mais do que a membrana e para compensar a célula precisaria de mais membrana. O que se acredita é que uma das formas de adaptação do crescimento de volume desproporcional ao de membrana foi o surgimento das invaginações com o posterior surgimento dos compartimentos internos das células (lúmen é topologicamente igual ao exterior da célula). A primeira célula – procariótica anaeróbica; depois surgiram as fotossintetizantes e depois a célula ancestral eucariótica. Já a mitocôndria e os cloroplastos, por terem seus próprios genomas, devem ter sido bactérias que foram engolfadas por outras células, onde, inicialmente, viviam em simbiose. Uma evidência é que a membrana plasmática original da bactéria corresponde a membrana plasmática das mitocôndrias. Ela além de possuir uma membrana dupla e ser excluída do transporte vesicular que conecta os interiores da maioria das outras organelas e o exterior da célula. Já o núcleo vai ter alguma relação com o citosol (se comunicam através dos poros nucleares) 3) Relações topológicas entre os compartimentos: é uma evidencia que pode ter havido a invaginação de membrana, já que os compartimentos tem o conteúdo do lúmen semelhante ao conteúdo do lado de fora da célula. Porém, existem compartimentos que não existe equivalência com seu lúmen, como, por exemplo, a mitocôndria, que, além disso, possuem internamente um DNA circular e ribossomos na matriz (parecido com as procarióticas). Pensam que elas surgiram de forma diferente dos outros compartimentos. A célula fagocítica ancestral vivia num meio anaeróbico. Para sobreviver ou ela ia para um ambiente pobre em O2 ou ela ia se adaptar a nova realidade que era a presença de O2 no ambiente. Existiam células procarióticas pequenas que eram adaptadas ao O2. Ai a célula fagocítica ancestral fagocitou essa pequena aeróbica havendo uma relação simbiótica. Houve um beneficio mútuo – a grande teve vantagem porque as pequenas consumiam O2 e a pequena ficava protegida. Com o tempo passando, a pequena célula começou a perder parte do seu DNA e os fragmentos foram incorporados ao genoma da célula hospedeira. Restaram somente 5% do genoma, e, portanto, elas não eram consideradas mais células. Deixou de ser indivíduos e passaram a ser parte da outra (mitocôndria da célula eucariótica). 4) Importação de proteínas pelos compartimentos: a síntese das proteínas se inicia nos ribossomos livres no citosol, seu destino subsequente vai depender da sua sequência de aminoácidos (sequência sinal,). Esses sinais podem estar na extremidade das proteínas (peptídeo sinal, geralmente na região N-terminal), separadas na cadeia polipeptídica onde se agrupam (arranjo tridimensional de átomos) formando uma região sinal, ou podem fazer parte da própria proteína. A enzima peptidase-sinal remove a sequência desses aminoácidos quando a proteína chega ao seu destino. Os sinais as orientam do citosol para os compartimentos e também do RE para outro destino na célula. As que vão para o RE, por exemplo, possuem uma sequência-sinal na região N-terminal composta por 5 a 10 aminoácidos hidrofóbicos, muitas delas vão para o golgi, mas algumas retornam para retículo (4 aminoácidos específicos na região C- terminal) Muitas não possuem esse sinal de endereçamento e permanece no citosol. Elas dão funcionalidade aos compartimentos. Como elas vão para cada compartimento¿ como vão para o destino final ¿ Existem 3 maneiras de serem encaminhadas: a. Transporte mediado ou por portões ou por canais: As proteínas se movimentam entre o citosol e o núcleo por meio dos poros nucleares presentes no envelope nuclear. Esse complexo de poros atua como mediadores seletivos que transportam ativamente macromoléculas específicas e complexos macromoleculares, embora permita a difusão de pequenas moléculas b. Transporte transmembrana ou através da membrana: proteínas translocadoras ou transmembranas transportam diretamente proteínas específicas através da membrana a partir do citosol para um espaço topologicamente distinto. Para isso, a molécula de proteína deve se desdobrar para passar pelo transportador (ocorre do citosol para o lúmen do RE ou para mitocôndrias). c. Transporte vesicular: vesículas esféricas ou fragmentos de organelas maiores transportam as proteínas de um compartimento para outro. Moléculas do lúmen de um compartimento levados para outro atravésde vesículas fusão com a membrana que o envolve. Ocorre do reticulo para golgi (proteínas solúveis) e do golgi para lisossomo ou MP. Esse transporte vesicular só pode ocorrer entre organelas topologicamente iguais. 5) Distribuição das proteínas: A proteína pode fazer o transporte mediado, transmembrana e vesicular. O que vai direcionar cada uma das proteínas será o sinal que cada uma vai possuir e determinar sua localização final. Em cada lugar que ela passa decisões serão tomadas para que ou ela siga para outro local, ou ela permaneça ali. Tudo isso dependerá de outro sinal, ou de retenção ou de saída. Esses sinais serão reconhecidos por proteínas receptoras de cada organela e guiam as proteínas para o seu destino apropriado, onde os receptores descarregam suas cargas. Depois de entregarem eles voltam para o seu ponto de origem onde serão reutilizados OBS: Durante a divisão celular as organelas como RE e mitocôndria são passadas intactas para a célula filha, já que essas organelas possuem informações necessárias para a sua montagem, e, então, não podem ser feitas de novo. Para isso, as organelas aumentam de tamanho e incorporam novas moléculas, para então, passar para as células-filhas. NÚCLEO 1) Estrutura: o núcleo é definido pelo envelope nuclear (define o compartimento nuclear). Suas membranas internas e externas mantêm composições proteicas distintas, mesmo sendo contínuas. A membrana interna contém proteínas que atuam como locais de ancoramento para a cromatina e a lâmina nuclear. A membrana externa circunda a interna, é contínua com o RE e apresenta ribossomos envolvidos na síntese de proteínas (essas que são sintetizadas irão para o espaço perinuclear – entre as membranas – que é contínuo com o lúmen do retículo). As proteínas com função nuclear como: histonas, DNA e RNA- polimerase, dentre outras são seletivamente importadas do citosol. Ao mesmo tempo os RNAs (transportadores e mensageiros) são sintetizados no compartimento nuclear, e, então enviados para o citosol também de forma seletiva (só vão após sofrerem modificações apropriadas). a. Complexo de poros nucleares (NPCs): eles perfuram o envelope nuclear. Cada NPC possui canais aquosos que permite a passagem de moléculas hidrofílicas de forma passiva. O transporte de pequenas moléculas é por difusão, a velocidade vai depender do tamanho delas. Os poros que permitem a passagem de molécula são formados por varias proteínas que formam colunas, anéis. Vão existir proteínas que formam um emaranhado desorganizado que impedem o transporte livre/difusão livre de moléculas maiores, mas deixarão as menores passar; e umas proteínas receptoras específicas que ficam livres (fibrilas) relacionadas a importação e exportação de macromoléculas de forma ativa. Do lado nuclear elas convergem formando tipo uma cesta. b. Lâmina nuclear: formada pelas laminas nucleares – proteínas filamentosas intermediárias (polimerizam-se em uma rede bidimensional) - formando dímero, depois tetrâmeros e depois protofilamentos – dá um suporte estrutural na carioteca e serve também para ligar a cromatina (forma e estabilidade ao envelope nuclear). Estão ancoradas aos NCPs e as proteínas integrais da membrana nuclear interna. 2) Função: possui função de armazenar o genoma, síntese e processamento de RNA e replicação de DNA. Cromatina (eucromatina – na foto). O RNA mensageiro sai do complexo de poros, se acopla aos ribossomos livres e lá fora sintetizam a proteína. O genoma é igual em todas as células, mas a forma de ativação e combinação de genes é diferente. 3) Sinais de localização nuclear: são responsáveis pela seletividade desse processo de importação nuclear. Esses sinais foram definidos usando técnicas de DNA recombinantes. Eles consistem em uma ou duas sequências ricas em aminoácidos carregados positivamente, lisina e arginina. Eles podem estar em qualquer lugar da sequência de aminoácidos, formando alças ou regiões na superfície da proteína. Portanto proteína que vai para o núcleo possui um peptídeo sinal (lisina e arginina) indicando que ela tem que ir para núcleo – está em conformação terciária. A importina (receptor de importação nuclear) reconhece o peptídeo sinal e ela é encaminhada para núcleo. Esses receptores de importação nuclear são proteínas citosólicas solúveis que se ligam tanto ao sinal de sinalização nuclear quanto nas proteínas NCP 4) Transporte de macromoléculas pelos poros nucleares: Depois que a proteína é encaminhada para o núcleo, ocorre uma interação com as fibrilas que fazem ela passar. Essas fibrilas, que contribuem para a barreira de difusão, incluem repetições de aminoácidos que contém fenilalanina e glicina, sendo chamadas de repetições FG. Elas servem como sítios de ligação para os receptores de importação. O complexo receptor-carga move-se ao longo dos NCPs por sucessivos eventos de ligação, dissociação e religação com as fibrilas. Quando chegam no núcleo esses receptores de importação dissociam-se de sua carga e retornam ao citosol. Algumas vezes as proteínas de importação necessitam de uma proteína adaptadora para elas se ligarem aos receptores de importação. a. Como ocorre: Nesse transporte haverá gasto de energia GTPaseRan ou RanGAP (presente no citosol) vai hidrolisar GTP (transforma RanGTP em RanGDP) gerando energia para o transporte de RanGDp acontecer em direção ao núcleo. Existem proteínas que promovem a hidrolise de GTP para gerar essa energia necessária. RanGDP é maior no citosol e RanGTP é maior dentro do núcleo. A proteína RanGEF, que está no núcleo, estimula a troca de GDP por GTP. E no citosol a RanGAP hidrolisa o GTP e converte para RanGDP. A proteína não perde a conformação quando entra no núcleo nem perde o peptídeo sinal. Em geral ele é clivado e degradado. Não há gasto de energia do citosol para núcleo e sim umas interação com as fibrilas e o importador, a ligação do receptor com RanGTP vai ser preciso para que ele libere a proteína quando chega no núcleo. Assim, o receptor volta para o citosol junto com a ligação de RanGTP e lá a RanGAP hidrolisa o GTP para que fique na forma de RanGDP. As proteínas só passam pelo NPC se estiverem completamente enoveladas, porém, se forem para outras organelas, precisam está extensivamente desenoveladas. 5) Mecanismos de exportação: os mecanismos de exportação nuclear vão ser os mesmo de importação nuclear, mas em direções opostas. Elas vão passar pelos NPCs, terão um sinal de exportação nuclear e serão reconhecidos por receptores de exportação nuclear. A exportina encaminha pelos poros a proteína para fora. 6) Regulação da importação de fatores de transcrição: Algumas proteínas transportadoras movem-se continuamente para dentro e para fora do núcleo. Em alguns casos esse transporte é fortemente controlado. Esse controle depende da regulação da localização nuclear e de sinais de exportação que podem ser ligados ou desligados, geralmente, por fosforilação de aminoácidos adjacentes a sequência sinal. Outras proteínas reguladoras de genes se ligam a proteínas citosólicas inibitórias que os ancoram no citosol ou mascaram o seu sinal de localização nuclear de tal modo que são incapazes de interagir com receptores de importação. NfkapaB e IkapaB (reguladores de expressão gênica e fatores transcricionais) eles mascaram o peptídeo sinal para que eles não entrem no núcleo. Ele pode ta fosforilado e somente a desfosforilação permitirá que a proteína seja transportada. Estão lá, mas são impedidas de serem transportadas para o núcleo. Como exemplo tem a proteína reguladora de gene que controla a expressão de proteínas envolvidas no mecanismo do colesterol. Elas ficam inativas ancoradas como transmembrana no RE. Quando há falta de colesterol ela é clivada por proteases e é importadapara o núcleo ativando a transcrição de genes necessários à importação e síntese do colesterol. 7) Quebra e montagem do envelope nuclear durante a mitose: O núcleo na mitose sofre a desintegração da carioteca e depois tem que se recompor. Há fosforilação das laminas (causando despolimerização) pelas cinases e das proteínas da membrana nuclear interna e as proteínas nucleares se misturam com as citosolicas. Os NCPs se desmontam e ficam espalhados pelo citosol, tendo algumas de suas proteínas presas ao receptor de importação nuclear (importante para recomposição dos NPCS no fim da mitose). Toda vez que sofre mitose há o rompimento do envelope nuclear. Como resolver o problema dessas mistura de proteínas¿ No núcleo o peptídeo sinal permanece. Como já foram formadas e possui o peptídeo sinal, quando o envelope nuclear se formar após a mitose, elas só precisam ser levadas novamente para núcleo, não necessitando serem sintetizadas novamente. No final as laminas são desfosforiladas auxiliando na reversão do processo. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO (RE) Todas as células eucarióticas possuem RE. Ele está organizado em um labirinto de túbulos ramificados e de vesículas achatadas que se estendem através do citosol. Os túbulos e as vesículas interconectam-se e suas membranas são contínuas com a membrana nuclear externa. O RE tem papel crucial na síntese de lipídios, de proteínas (de membrana e solúveis) e serve como fonte de armazenamento de Ca+ (sequestra cálcio do citosol pelas bombas de Ca+, ficam armazenados devido a proteínas que existem no seu interior e que se ligam ao cálcio e a liberação está envolvida em sinais extracelulares). A membrana do RE é local da síntese de todas as proteínas transmembranas e lipídios para a maioria das organelas das células (o próprio RE, golgi, lisossomos, endossomos vesículas secretoras, MP), além de produzir a maioria dos lipídios para a membrana de mitocôndria e peroxissomos. Quase todas as proteínas que são secretadas para o exterior da célula, junto com aquelas que são destinadas ao lúmen do RE, golgi ou lisossomos, são destinadas, inicialmente, ao lúmen do RE. O retículo vai possuir uma região onde ficam os ribossomos aderidos à membrana (RE rugoso) e a outra em que não existe esses ribossomos (RE liso – acomoda enzimas necessárias para a síntese de colesterol e o modifica a fim de formar hormônios; é abundante em células secretoras de hormônio esteroide). Nessa área existem locais a partir dos quais vesículas carregando proteínas recém-sintetizadas e lipídios se desprendem para o transporte para golgi que é chamado de RE transicional. No fígado, os hepatócitos também são abundantes em RE liso para produção de partículas de lipoproteína que carregam lipídios para outra parte do corpo pela corrente sanguínea 1) Distribuição das proteínas: As proteínas que vão para o RE são sintetizadas nos ribossomos aderidos à sua membrana – as da via secretora. Depois esses ribossomos voltam ao citosol. a. Translocação cotraducional: Em células de mamíferos a importação da proteína vai começar antes da síntese completa da cadeia polipeptídica, ou seja, a síntese proteica e o transporte para dentro do reticulo é feita ao mesmo tempo (ribossomos ligam-se à membrana do retículo – cobrem a superfície do retículo – RE rugoso). Depois essas proteínas MP, vesículas secretoras ou lisossomos b. Translocação pós-traducional: Já nas mitocôndrias, cloroplastos, núcleo e peroxissomos primeiro ocorrerá a síntese de toda a proteína para depois ela ser transportada (importação pós-traducional). 2) Síntese de proteínas no RE: O RE captura as proteínas produzidas no citosol assim que elas são sintetizadas. Elas vão ser de dois tipos: transmembrana (parcialmente translocada através da membrana) ou solúvel (totalmente translocada através da membrana). Todas essas proteínas vão para membrana do RE e possuem uma sequência sinal guiada à membrana do retículo por uma SRP (partícula de reconhecimento sinal) e por um receptor SRP. Só um pedacinho da proteína é sintetizado no citosol até que a sequência sinal (variedade de aminoácidos) é ligada ao SRP, dando uma pausa na síntese até que o ribossomo chega à membrana do retículo, e então, o complexo SRP-ribossomo vai se ligar a um receptor de SRP na membrana do retículo (proteína transmembrana). A SRP é uma estrutura alongada que envolve a subunidade ribossomal maior com uma extremidade ligada à sequência sinal e a outra bloqueando o sítio de ligação ao fator de alongamento na interface entre as subunidades maior e menor, causando pausa na síntese proteica assim que a sequência sinal é sintetizada e garantindo que a proteína não seja liberada no citosol. Após a ligação ao receptor SRP a proteína vai ser direcionada ao translocador, o SRP e o receptor SRP são liberados e o translocador transfere a cadeia polipeptídica através da membrana. O ribossomo se acopla ao complexo sec61 (translocador – poro preenchido por água) que é um meio de transporte na membrana do reticulo para terminar de produzir a proteína. As solúveis vão se associar a chaperronas (darão funcionalidade a elas – conformação terciaria) e as de membrana (possuem uma região de parada que é hidrofóbica) assim que são produzidas se difundem pela membrana ou até mesmo podem ir para MP. O peptídeo sinal sempre tem um pedacinho hidrofóbico. O complexo sec61 consiste em três subunidades. Ele possui um plug (hélice pequena) para impedir a passagem de moléculas para dentro e fora do reticulo (como o Ca+ que poderia escapar do RE). Desse modo, quando o peptídeo sinal chega e interage com o translocon o plug se abre. Portanto, o poro é dinâmico e só se abre brevemente para uma cadeia polipeptídica atravessar a membrana, forma uma “tampa” bem fechada junto com o ribossomo para impedir essa passagem de moléculas. a. Translocação de proteínas solúveis: A sequência-sinal da cadeia polipeptídica dispara a abertura do poro na proteína translocadora. Depois que essa sequência é liberada da SRP e a cadeia crescente tenha alcançado tamanho suficiente, a sequência-sinal liga-se a um sítio específico dentro do poro., abrindo o poro. Uma sequência-sinal do retículo é reconhecida duas vezes (pela SRP no citosol e pelo sítio de ligação no poro – sinal de início da transferência – que abre o poro). Esse reconhecimento duplo auxilia para entrada de apenas proteínas apropriadas para o lúmen do RE. A sequência-sinal além de está em contato com o sec61 também se liga ao centro lipídico hidrofóbico da membrana. Esse sinal é clivado por uma peptidase-sinal quando a cadeia polipeptídica já cresceu o suficiente, liberando-a do poro da membrana onde é degradada por proteases na membrana do retículo. Para liberar essa sequência-sinal o translocador abre-se lateralmente tomando duas direções: deixar porções hidrofílicas de proteína através da membrana ou deixar porções hidrofóbicas de proteínas através da membrana. b. Integração de proteína na membrana do retículo (única passagem): Para acontecer essa integração é essencial a saída lateral do poro. Além disso, é necessário que algumas partes da cadeia polipeptídica sejam transportadas através da bicamada. Em um caso a sequência N-terminal inicia o translocamento, assim como na solúvel, mas um segmento adicional hidrofóbico interrompe o processo de transferência da cadeia polipeptídica antes que ela seja inteira transportada (sinal de parada de transferência). Esse sinal ancora a proteína na membrana após a sequência-sinal do retículo ser liberada do translocador e ter sido clivada. A sequência de parada de transferência é transferida pela bicamada pelo mecanismo de controle lateral e lá permanece com um único segmento alpha-hélice. Nos outros casos a sequência-sinal é interna em vez deser na extremidade N-terminal. Essa sequência vai atuar como um sinal de início de transferência se ligando ao translocador e levando a duas vias: uma que a proteína não precisa ser totalmente produzida e outra em que ela precisa está toda pronta para se fixar na membrana. c. Integração de proteína na membrana do retículo (dupla e múltiplas passagens): Nesse caso a proteína de membrana desliza para trás e para frente através da bicamada. A sequência-sinal interna serve como um sinal de início de transferência o qual continua até atingir a sequência de parada. Aqui o polipeptídeo é liberado na bicamada (dupla) ou uma segunda sequência de início de transferência reinicia o translocamento mais adiante na cadeia até a próxima sequência de parada do transporte induzir a liberação do polipeptídeo (múltiplas). A sequência de início e de parada vai depender da ordem relativa na cadeia polipeptídica crescente. A maneira em que uma proteína recém-sintetizada é inserida na membrana do RE determina a orientação da proteína em todas as outras membranas. OBS: Algumas proteínas são transportadas para o lúmen do RE de forma pós-traducional, após completada a sua síntese. É o caso das leveduras através da membrana do retículo e através da membrana plasmática bacteriana. Para isso, o translocador necessita de proteínas acessórias que coloquem a cadeia polipeptídica no poro e sustentem o transporte. As bactérias utilizam a proteínas motriz de translocamento ATPase secA que utilizada ATP para mudar conformação da proteína sec A e, assim, a proteína passar. Já as leveduras utilizam um complexo de proteínas acessórias ao sec61 que depositam chaperonas ao lado do lúmen do retículo que conduzem as proteínas pela membrana. As proteínas que vão para o retículo pelo processo pós-traducional são primeiro liberadas no citosol, se ligam as chaperonas, prevenindo o seu enovelamento por ligação. OBS2: Para saber para onde a proteína vai depois que chega no retículo tem que haver outro sinal para saber seu destino. Se não tiver nenhum vai logo para MP. Esse sinal vai ser uma sequência de aminoácidos. 3) Enovelamento das proteínas no lúmen do retículo: Muitas proteínas do lúmen estão em trânsito para outros destinos, já outras residem por lá. Essas que ficam no RE possuem um sinal de retenção do retículo de quatro aminoácidos na região C- terminal. Algumas delas esté lá para ajudar as proteínas transportadas para o retículo a enovelar-se e montar-se corretamente. Uma delas residente no RE é a proteína chaperona BIP. Ela vai reconhecer proteínas enoveladas incorretamente se ligando a sequência de aminoácidos exposta que estaria, de modo normal, ocultas no interior das cadeias corretamente enoveladas 4) Formação de ligações dissulfeto: Realizada pela proteína residente do RE. Ela é a proteína dissulfeto-isomerase (PDI) que formam ligações dissulfeto nos resíduos de cisteínas dos domínios proteicos expostos no espaço extracelular ou no lúmen das organelas em vias secretoras e endocíticas (essas ligações são raras em domínios citosólicos). Essas ligações dão estabilidade estrutural às proteínas fazendo com que elas não percam sua conformação da parte que fica no ambiente do reticulo e acontecem dentro do RE. 5) Glicosilação das proteínas: A adição de açúcares a proteína é uma das principais funções biossintéticas do RE. Metade das proteínas eucarióticas são glicosiladas como as solúveis e as de membrana do golgi, lisossomos, MP, espaço extracelular, já as que ficam no citosol são poucas glicosiladas, e as que são, possuem resíduos simples de açúcar. 14 açúcares são unidos (composto por N- acetilglicosamina, manose e glicose) e transferidos para as proteínas no RE (aminoácido asparagina – cadeia lateral) formando um agrupamento. Eles são ligados em bloco à proteína ainda no momento que ela está sendo sintetizada. Deve apresentar umas trinca de aminoácidos para que esse grupamento de açúcar se forme pela enzima oligossacaril-transferase ligada à membrana (catalisa a transferência do açúcar para a proteína) que possui seu sítio exposto no lado do lúmen da membrana. Antes de ser transferido para a proteína o oligossacarídeo precursor é retido na membrana por uma molécula lipídica chamada dolicol, sendo transferido para a asparagina-alvo imediatamente após a emergência do aminoácido no lúmen. O oligossacarídeo precursor é construído açúcar por açúcar ainda nessa molécula lipídica antes de sua transferência para a proteína. Esses açúcares começam a ser inseridos no lado citosólico até que um momento passam para o lado do lúmen. Ainda no reticulo alguns resíduos de açúcar são removidos - 3 glicoses e uma manose na maioria das glicopreteínas. Essas que ficaram saem do RE e vão para golgi onde vão terminar essa glicosilação. A importância dessa glicosilação é que vai ser útil para o dobramento da proteína que ainda vai acontecer no RE. Pois, algumas proteínas necessitam de uma glicosilação ligada a região N para se enovelar adequadamente. Como exemplo tem-se as chaperonas calnexina e calreticulina (lectinas) que se ligam a oligossacarídeos nas paroteínas que não estão completamente enoveladas e as retêm no retículo, impedindo que elas sofram agregação irreversível. Elas vão se ligar quando duas das três glicoses são removidas por glicosidases. Quando a terceira é removida a proteína se dissocia da chaperona e pode deixar o RE. Elas vão distinguir as proteínas enoveladas das desenoveladas devido a ação da enzima glicosil-transferase que continua adicionando glicose aos oligossacarídeos das proteínas desenoveladas (sofre ciclos de retirada de glicose – glicosidase e adição – glicosil-transferase) 6) Degradação de proteínas do RE: Mesmo com a ajuda das chaperonas muitas proteínas saem do retículo sem o enovelamento correto. Elas são exportadas de volta do RE para o citosol onde são degradadas. Uma vez elas sendo retranslocadas para o citosol uma N-glicanase remove suas cadeias oligossacarídicas em blocos. O polipeptídeo desglicosilado é rapidamente ubiquitinado pelas enzimas conjugadas a ubiquitina ligadas ao RE e, então, enviados a proteossomos onde é degradado. As proteínas de membrana são degradadas de modo similar sendo exportadas através do mesmo tipo de translocador que media sua importação (isso é possível devido a presença de proteínas acessórias associadas ao translocador) OBS: Um acúmulo de proteínas mal enoveladas no citosol desencadeia uma resposta ao choque térmico que estimula a transcrição de genes que codificam chaperonas citosólicas para auxiliar no renovelamento das proteínas. No RE também ocorre algo similiar desencadeando uma resposta de proteína desenovelada a qual inclui uma transcrição aumentada de genes que codificam chaperonas do RE e enzimas envolvidas na degradação de proteínas. 7) Síntese de lipídios: Ocorre no reticulo endoplasmático liso, os quais não possuem ribossomos. Lá as principais classes de lipídios são sintetizadas incluindo fosfolipídios e colesterol necessários para formação das membranas celulares. O principal fosfolipídio é a fosfatidilcolina (colina, dois ácidos graxos e glicerol fosfato). Cada etapa é catalisada por enzimas presentes na membrana do RE que possuem seus sítios ativos voltados para o citosol (lâmina citosólica). Os ácidos graxos são conduzidos ao seu sítio de síntese por proteínas de ligação a ácidos graxos no citosol. Depois de chegarem a membrana e serem ativados com coenzimaA (CoA), a acil-tranferase adicionam dois ácidos graxos ao glicerol fosfato produzindo ácido fosfatídico. A partir daí etapas posteriores vão determinar o grupo da cabeça de uma molécula de lipídio recém formada e a natureza química da bicamada. Pelo fato as síntese ocorrer na porção citosólica existe a
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