Roteiros Hoffman, Ritchie, Willis e Faust

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ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 
Método de Sedimentação Espontânea – Hoffman, Pons e Janer ou Lutz (14/09) 
Método de Centrifugo-sedimentação – Ritchie (28/09) 
Método de flutuação espontânea – Willis (19/10) 
Método de centrifugo-flutuação – Faust (26/10) 
 
 
INTRODUÇÃO 
As técnicas de concentração figuram entre os procedimentos de rotina, como parte de um 
exame completo das fezes, para a pesquisa de parasitos e o diagnóstico de um pequeno 
número de organismos que foram omitidos, quando foi usado somente o exame direto a 
fresco. Os três principais objetivos dessas técnicas são: 1) aumentar o número de cistos, 
oocistos, ovos ou larvas na preparação; 2) eliminar a maioria dos detritos fecais; e 3) 
apresentar os organismos em um estado inalterado, facilitando sua identificação. As 
técnicas de concentração se dividem em: flutuação e sedimentação, e cada uma destas se 
subdivide em flutuação simples e centrífugo-flutuação; sedimentação simples e 
centrífugo-sedimentação. 
 
1. Método de Sedimentação Espontânea – Técnica de Hoffman, Pons e Janer ou 
Lutz 
A técnica de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer é um procedimento simples, indicado para 
a pesquisa de ovos, larvas e cistos. Fundamenta-se na sedimentação espontânea em água 
(combinação da gravidade e da sedimentação). O uso de grande quantidade de material 
fecal nesse processo, em contraste com as pequenas quantidades usadas em outras 
técnicas, favorece um diagnóstico satisfatório e seguro, mesmo quando o número de 
organismos presentes é pequeno. A grande vantagem da técnica de sedimentação em água 
para a concentração de cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos, no material 
fecal, é a necessidade mínima de vidraria, sendo dispensável o uso de reagentes e da 
centrifugação. A desvantagem desse processo de diagnóstico coprológico é a grande 
quantidade de detritos fecais no sedimento, dificultando, com frequência, a preparação e 
o exame da lâmina. 
 
MATERIAL 
 Material fecal não preservado (fezes frescas). 
 Água 
 Palito de picolé ou espátula 
 Copo graduado ou becker de 250 mL 
 Peneira para fezes 
 Gaze 
 Copo cônico de 125 mL (cálice) 
 Pipeta Pasteur 
 Centrífuga 
 Lâmina de microscopia 
 Lamínula de vidro 
 Lugol 
 Microscópio 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. 
 Colocar cerca de 5 g de fezes frescas, colhidas de várias partes do bolo fecal, em 
copo graduado de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml com água corrente 
e misturar vigorosamente com espátula até formar suspensão homogênea. 
 Preparar a suspensão com água corrente até volume de 100 mL. 
 Utilizar duas gazes dobradas e umedecê-la em água corrente. Posicionar a gaze 
sobre a peneira disposta sobre o cálice. 
 Dispensar a suspensão de fezes sobre a gaze para filtrar. 
 Se necessário, adicionar água corrente até completar aproximadamente 3/4 do 
volume do cálice. Deixar a suspensão em repouso durante uma a duas horas. 
OBS.: como o horário da aula não permite esse tempo de espera, deixar em 
repouso por 30 minutos. 
 
 Descartar metade do sobrenadante na pia. 
 Com uma pipeta Pasteur, colher uma pequena porção do sedimento na camada 
inferior, depositando-o sobre uma lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, 
diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente ou colocar uma 
gota de lugol. Posicionar a lamínula sobre a lâmina. 
 Examinar ao microscópio a presença de ovos, larvas e cistos. 
2. Método de centrifugo-sedimentação – Técnica Ritchie (Centrífugo-
sedimentação pela formalina-éter ou centrífugo-sedimentação pela formalina-
acetato de etila) 
Existem inúmeras variações nas técnicas de sedimentação pelo emprego da centrifugação, 
todas elas são derivadas do procedimento original de Telemann. Ritchie apresentou, em 
1948, uma técnica eficiente para recuperar e identificar cistos de protozoários e ovos e 
larvas de helmintos, incluindo ovos operculados e de esquistossoma em material fecal 
fresco, preservado pelo formaldeído. Maldonado e Acosta-Matienzo, Maldonado, 
Acosta-Matienzo e Veliz-Herrera modificaram o método original de Ritchie 
acrescentando à formalina o Triton-NE, um detergente não-iônico, com o objetivo de 
aumentar a eficiência da técnica. Alguns autores recomendam substituir o éter etílico pelo 
acetato de etila. Este reativo é inflamável, mas pode ser usado com espécimes 
conservados com formaldeído e fixador APV. 
 
MATERIAL 
 Material fecal não preservado (fezes frescas). 
 Solução de formalina a 10% (v/v). 
 Acetato de etila ou éter etílico. 
 Água. 
 Tubo tipo Falcon de 15 mL (ou tubo de Wasserman) 
 Estante para tubos 
 Peneira para fezes 
 Gaze 
 Becker de 50 mL 
 Palito de picolé ou espátula 
 Centrífuga 
 Pipeta Pasteur 
 Estante para tubos 
 Swab (ou cotonete) 
 Lâminas de microscopia 
 Lamínula 
 Lugol 
 Microscopio 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. 
 Colocar 2 a 5 g de fezes frescas colhidas de várias partes do bolo fecal em Becker 
contendo 10 ml de água corrente. Homogeneizar bem. 
 Filtrar a suspensão através de gaze, levemente umedecida em água corrente, 
dobrada duas vezes, apoiada sobre a peneira e receber o filtrado em um tubo tipo 
Falcon de 15 ml. 
 Centrifugar (2500 rpm ou 650 x g por 1min). 
 Descartar o sobrenadante e adicionara 2 ml de água corrente ao sedimento para 
ressuspendê-lo. Completar com água corrente até 10 ml do volume do tubo. Agitar 
e centrifugar (2500 rpm ou 650 x g por 1min). Repetir essa etapa até que o 
sobrenadante se apresente relativamente claro. 
 Depois que o último sobrenadante é descartado, ressuspender o sedimento com 2 
ml de formalina a 10%. Completar o volume da suspensão em 10 ml com 
formalina a 10%. Deixar em repouso durante 5 minutos. 
 Adicionar 3 ml de éter ou acetato de etila, fechar o tubo e agitar bem por 30 
segundos. Remover a tampa com cuidado. 
 Centrifugar (2000 rpm ou 500 x g por 1min). Quatro camadas se formarão: 1.ª) 
sedimento no fundo do tubo contendo os parasitos; 2.ª) camada de formalina; 3.ª) 
tampão de detritos fecais; e 4.ª) camada de éter na superfície. 
 Com cuidade, descartar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão 
as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes. 
 Uma pequena quantidade do líquido que permanece nas paredes do tubo escorre 
para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento. 
 Com pipeta pasteur coletar uma pequena amostra do sedimento e depositar sobre 
a lâmina, adicionar lugol e lamínula para a pesquisa de ovos, larvas e cistos. 
 
Observações 
Ritchie e cols. relataram que o pH da formalina afeta o encontro dos ovos e cistos no 
sedimento. Ovos de A. lumbricoides e Schistosoma japonicum são melhores recuperados 
em pH 10,0, enquanto os ancilostomídeos são muito bem identificados nos valores de pH 
4,0 e 7,0. Os ovos de T. trichiura e cistos de protozoários aparentemente não são afetados 
pelas mudanças do pH, mas os melhores resultados são obtidos no pH 7,0. Esses dados 
mostram que a formalina no pH neutro é mais eficaz do que a formalina não tamponada 
no estudo dos parasitos. Tubo com fundo redondo é mais apropriado do que tubo cônico 
de centrífuga de 15ml. A água corrente poderá ser substituída pela solução salina a 0,85% 
durante todo o procedimento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. Método de flutuação – Técnica de Willis (flutuação em solução saturada de 
cloreto de sódio) 
As técnicas de flutuaçãofundamentam-se no princípio da diferença de densidade 
específica entre os ovos de helmintos, cistos e oocistos de protozoários e o material fecal, 
a fim de que esses organismos flutuem na superfície dos reagentes com densidade 
específica (normalmente alta densidade). Os ovos e cistos usualmente apresentam uma 
densidade específica que varia de 1,05 a 1,15g/ml; entretanto alguns ovos, como de 
Clonorchis e Opisthorchis e outras espécies muito próximas, mostram uma densidade 
específica superior a 1,20g/ml e não podem ser concentrados pelas técnicas usuais de 
flutuação. As principais vantagens apresentadas pela flutuação são a formação na 
superfície do tubo de uma membrana clara com poucos detritos fecais e a remoção 
seletiva de ovos e cistos, mesmo quando presentes em pequeno número no bolo fecal, 
resultando em quantidade maior de organismos de certas espécies, quando comparado 
com o número de parasitos presentes nos esfregaços salinos. Os trofozoítos e os ovos 
operculados não são isolados através dessa técnica; flutuam somente os pequenos ovos 
de trematódeos. Ovos pesados, como os de Ascaris, Taenia, Schistosoma, Fasciola e 
Fasciolopis, não flutuam; alguns cistos delicados e as larvas são distorcidos. As gorduras 
e os óleos presentes nas fezes flutuam com os ovos e cistos, tornando a preparação 
algumas vezes insatisfatória para o exame. Nas técnicas de flutuação são usadas 
principalmente as soluções saturadas de cloreto de sódio, de sacarose, de sulfato de zinco 
e de sulfato de magnésio. A densidade específica dessas soluções saturadas variam de 
1,18 a 1,26g/ml. 
A técnica de Willis fundamenta-se na dupla propriedade que apresentam certos ovos de 
helmintos de flutuarem na superfície de uma solução de densidade elevada e de aderirem 
ao vidro. Este procedimento, simples e eficiente, está indicado para a pesquisa de ovos 
com densidade específica baixa, como os de ancilostomídeos e de Trichostrongylus 
orientalis, embora não seja recomendado para os ovos pesados de trematódeos, ovos de 
E. vermicularis e ovos inférteis de A. lumbricoides. Os cistos de protozoários se retraem, 
ficando irreconhecíveis. 
 
MATERIAL 
 Material fecal não preservado (fezes frescas). 
 Solução saturada de cloreto de sódio (NaCl), densidade 1,20 g/mL 
 Frasco de Borrel 
 Palito de picolé ou espátula 
 Lâmina de microscopia 
 Lamínula 
 Lugol 
 Microscopio 
 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 Preparação da Solução Saturada de Cloreto de Sódio, Densidade 1,20g/ml. 
A solução saturada de cloreto de sódio (NaCl) com densidade específica de 1,20g/ml é 
preparada pela adição do NaCl em água destilada-deionizada ou corrente quente ou em 
ebulição, até que o excesso acrescentado não mais se dissolva na solução 
(aproximadamente 40 g de NaCl em 100 ml de água). A densidade específica é crítica, 
devendo-se usar um densitômetro para controlar e ajustar a solução. Filtrar em papel-
filtro. 
 Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. 
 Colocar uma quantidade de fezes frescas de aproximadamente 2 g, coletada de 
várias partes do bolo fecal, em frasco de Borrel. 
 Adicionar solução saturada de cloreto de sódio até ¼ do volume do frasco e 
homogeneizar bem. 
 Completar o volume até a borda do frasco. 
 Colocar uma lamínula (ou uma lâmina) sobre a borda do frasco de modo a ficar 
em contato com o líquido. 
 A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 minutos; não deverá 
haver formação de bolhas de ar entre a lamínula e a superfície do líquido. A gota 
contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula. 
 Remover a lamínula e inverter rapidamente sua posição sobre uma lâmina 
contendo uma gota de lugol. 
 Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento. 
 
Observações 
Os ovos não flutuam na superfície do reagente quando a homogeneização do material 
fecal é incompleta, havendo uma imperfeita separação dos ovos e dos detritos fecais. 
4. Centrífugo-flutuação em solução de sulfato de zinco – Técnica de Faust 
A técnica de Faust e colaboradores foi o primeiro procedimento desenvolvido para o 
diagnóstico de cistos de protozoários e de ovos e larvas de helmintos. Ovos grandes de 
trematódeos, de cestóides e inférteis de A. lumbricoides não são concentrados. Essa 
técnica é imprópria para espécimes fecais que contenham grande quantidade de gorduras. 
A solução de sulfato de zinco é preparada na densidade de 1,18 g/ml para fezes frescas. 
A técnica pode ser usada com fezes preservadas em formaldeído (5% ou 10%, tamponado 
ou não tamponado), SAF e fixador APV; entretanto, a densidade específica deverá ser 
ajustada em 1,20g/ml. O aumento da densidade poderá resultar em uma distorção 
adicional dos organismos. 
 
MATERIAL 
 Material fecal não preservado (fezes frescas). 
 Solução de Sulfato de Zinco a 33% (densidade 1,18 g/ml) 
 Palito de picolé ou espátula 
 Gaze 
 Peneira para fezes 
 Tubo tipo falcon de 15 mL (ou tubo de Wasserman) 
 Becker de 50 mL 
 Água 
 Centrifuga 
 Estante para tubos 
 Pipeta Pasteur 
 Alça de platina 
 Lâmina de microscopia 
 Lamínula 
 Lugol 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 
 Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. 
 Colocar 2 g de fezes frescas colhidas de várias partes do bolo fecal em becker 
contendo 10 ml de água corrente. 
 Filtrar a suspensão através de gaze, levemente umedecida em água corrente, 
dobrada duas vezes, apoiada sobre a peneira e receber o filtrado em um tubo tipo 
falcon de 15 ml. 
 Adicionar água corrente até completar 10 mL do volume do tubo. 
 Centrifugar (2.500 rpm ou 650 x g por 1 min). Descartar o sobrenadante e 
adicionar 2 ml de água corrente ao sedimento para ressuspendê-lo. Completar com 
água corrente 10 mL do volume do tubo, agitar e centrifugar novamente. Repetir 
essa etapa até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. 
 Depois que o último sobrenadante é descartado, adicionar 2 ml do reagente e 
ressuspender o sedimento; completar com sulfato de zinco até 0,5 cm da borda do 
tubo e centrifugar (2.500 rpm ou 650 x g por 1 min). 
 Cuidadosamente, remover o tubo da centrífuga e, sem agitação, colocá-lo em uma 
estante em posição vertical. 
 Com uma alça de platina (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana 
formada na superfície, transferindo várias alçadas para uma lâmina de 
microscopia. Adicionar lugol e lamínula. Pesquisar ovos, larvas e cistos. O 
material deve ser examinado imediatamente. O sulfato de zinco pode deformar os 
cistos e os ovos. 
 Alguns pesquisadores preferem a sobreposição de uma lamínula na borda do tubo 
à remoção da película com alça de arame, deixando-a em contato com o líquido 
durante oito a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo sua posição e colocar 
a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar para ovos, larvas e cistos.