PAPILOMA VIRUS ALTERACOES DE QUERATINIZAÇÃO (1)

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HPV - PAPILOMA VÍRUS 
 
As células da pele e mucosa sob ação do HPV sofrem modificações se 
multiplicando mais, ficando abauladas, com citoplasma cheio de 
vacúolos e o núcleo fica deformado e jogado para a periferia da célula. 
Essas alterações nas células externamente são observadas como uma 
elevação da pele ou mucosa ou seja as verrugas. 
 
A respeito da infecção por HPV, algumas características são observadas, 
como por exemplo, a alteração na queratinização das células, do tecido 
vaginal, mais profundas (disceratose), sendo classificada em 
paraqueratose ou hiperqueratose. 
 
A disceratose (considerada critério de detecção clássica para o cancer cervicovaginal, junto com coilocitose) 
apresenta células espalhadas ou em grupos tridimensionais que demonstram pleomorfismo celular (formas caudadas 
ou alongadas) e/ou aumento de tamanho e atipia nuclear, freqüentemente, hipercromasia nuclear, sendo o citoplasma 
fortemente eosinofílico. 
 
A paraqueratose é a ceratinização anormal do epitélio escamoso com persistência dos núcleos celulares nas células 
superficiais (IMPORTANTE PARA DIAGNÓSTICO DE LSIL). 
Aspectos citológicos: retenção do núcleo nas células córneas, caracterizando processo incompleto de queratinização 
das células superficiais. Presença de células escamosas habitualmente pequenas, redondas ou poligonais, com um 
citoplasma denso eosinofílico (acidofílico), e um núcleo persistente, mais ou menos picnótico. Este padrão associa-se 
freqüentemente à condições inflamatórias. 
Podem ocorrer células escamosas maiores, semelhantes a escamas superficiais, com citoplasma queratinizado e um 
núcleo persistente. Nesta situação, se estas células estão agrupadas ou se tornam alongadas, ou se os núcleos estão 
aumentados, pode existir uma lesão intra-epitelial. 
 
A hiperqueratose é o espessamento da camada mais superficial da pele, 
por estarem carregadas de queratina, visando aumentar a resistência da 
pele (calo). Nos esfregaços, a hiperqueratose é representada por escamas 
anucleadas em número variável. Elas são intensamente eosinofílicas ou 
orangeofílicas, às vezes exibindo uma área clara em substituição ao 
núcleo perdido, os chamados núcleos fantasmas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Como o exame do papanicolaou ainda é bastante falho para detecção da extensão da lesão e profundidade, é utilizado 
métodos de rastreio por biologia molecular. 
 
A captura híbrida para detecção de HPV é um exame de biologia molecular altamente sensível capaz de detectar 18 
dos aproximadamente 30 tipos de HPV que mais comumente infectam o trato anogenital. O grupo A possui sondas 
para os HPVs de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44), e o grupo B, sondas para os HPVs de intermediário/alto risco (16, 18, 
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68). Sua sensibilidade é de 1pg/ml de DNA-HPV, equivalente a 0,1 cópia de 
vírus/célula. Por essa sensibilidade, os estudos têm mostrado estreita relação entre os resultados e a evolução clínica. 
Os tipos detectados pela metodologia representam 95% dos vírus que infectam o trato anogenital. Todos os testes de 
captura híbrida são, ao mesmo tempo, qualitativos e quantitativos. 
 
Porém, o grande fator limitante das metodologias moleculares é o elevado custo, tornando-as inviáveis para o exame 
de grandes populações em programas de saúde governamentais ou até mesmo como procedimento rotineiro em 
serviços de saúde privados, apesar de alguns autores proporem o teste de DNA para HPV como um complemento para 
a triagem citológica. Estes métodos, para a realidade de países em desenvolvimento, são ainda reservados para casos 
específicos como: confirmação diagnóstica, resultados conflitantes, genotipagem viral e casos duvidosos à citologia. 
 
 
A hibridação in situ estuda o padrão de expressão de um gene, se está ativo ou não no tecido, emparelhando 2 
cadeias complementares de ácido nucléico permitindo a visualização de determinada sequência (híbridos: DNA/DNA, 
RNA/RNA, DNA/RNA, sendo o RNA/RNA o mais estável por possuir a temperatura de denaturação superior ao 
restante). 
 
PASSO A PASSO: 
 
1- Colheita do material biológico (tomando cuidado com as RNases) 
Queremos detectar o mRNA (instável). 
 
2- Fixação e lavagem 
Fixador de proteínas e mRNA + Lavagem com detergente(tampão). 
 
3- Desidratação (facultativo) 
Caso vá guardar a amostra por um longo período (metanol). 
 
4- Permeabilização e fixação 
Caso tenha sido desidratado, hidratar novamente. 
Proteinase K (proteolítica para permeabilização). 
Lavagem com tampão. 
Pós fixação. 
 
5- Hibridação in situ 
Adiciona a sonda + modulação da temperatura (de acordo com a sonda). 
 
6- Lavagem pós hibridação 
Uso dos tampões. 
 
7- Preparo da detecção imuno-histoquímica 
Utiliza tampão blocking, para minimizar as ligações inespecíficas. 
 
8- Detecção da sonda imuno-histoquímica 
Adição da molécula anti-DiG conjugado com fosfatase alcalina + lavagem com lampão alcalino (revelação). 
 
9- Revelação 
Colocar em BM Purple (coloração) no escuro até ficar roxo, tirar o BMPurple e lavar com tampão. 
 
 
A FISH tem quatro procedimentos básicos: 
1) fixação e permeabilização da amostra 
2) hibridização 
3) lavagem para remoção das sondas em excesso 
4) detecção pela microscopia fluorescente 
 
Antes da hibridização, as amostras contendo os micro-organismos são fixadas para proteger o RNA da degradação de 
RNAses endógenas e permeabilizadas para permitir que as sondas penetrem na célula. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Associado aos anticorpos monoclonais, 
detectando DNA-HPV.