Imunocitoquímica e Cultura de Células

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Ciências	Biomédicas,	Turma	3	
																																																																																																																																												Dezembro	2017	
	
BIOLOGIA	MOLECULAR	E	CELULAR	
	
IMUNOCITOQUÍMICA	
Identificação	do	citoesqueleto	de	células	em	cultura		
	
Trabalho	realizado	por:																																														Docentes:	
Ana	Beatriz	Ribeiro	–	a26445																													Carla	Pinto	
Luís	Coelho	–	a23111																																											Graça	Casal	
Vanessa	Santos	–	a26526	
Justine	Karam	–	a26305	
	
	 2	
Índice	
Imunocitoquímica	................................................................................................................................	4	
Cultura	celular	..........................................................................................................................................	6	
Microscopia	..............................................................................................................................................	7	
Citoesqueleto...........................................................................................................................................9	
Materiais	e	reagentes.............................................................................................................................10	
Métodos.................................................................................................................................................12	
Resultados/Discussão.............................................................................................................................14	
Bibliografia.............................................................................................................................................15	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
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Sumário	
	
Este relatório tem como objetivo expor os princípios gerais da imunocitoquímica e da microscopia de fluorescência 
convencional para identificação do citoesqueleto em células de cultura, bem como adquirir um conhecimento mais 
vasto sobre a deteção de proteínas recorrendo ao manuseamento de anticorpos específicos e saber avaliar ou 
expressar uma conclusão relativamente aos diferentes aspetos e dinâmicas que os microtúbulos apresentam e 
reorganização a nível do ciclo celular. 
 
Assim, ao longo do mesmo serão abordados conceitos como cultura de células, vantagens e desvantagens da mesma, 
incluindo tipos de culturas, citoesqueleto e microtúbulos. Será também feita uma comparação entre o microscópio ótico 
(microscopia de luz) e o microscópio de fluorescência, dando especial ênfase a este último por ter sido o usado no 
trabalho. Terminaremos com discussão dos resultados observados. 
 
 
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
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Imunocitoquímica 
O que é? 
A técnica de Imunocitoquímica é a aplicação de métodos e técnicas imunológicas ao estudo de células e tecidos. 
Esta técnica baseia-se numa reação antigénio-anticorpo. A análise em imunocitoquímica é feita em culturas de células 
ou células com a matriz extracelular removida. Para a identificação de uma proteína (antigénio) especifica, um 
determinado anticorpo reconhecerá um determinado domínio. Os anticorpos usados podem estar acoplados a uma 
enzima e o sinal ser revelado pela microscopia de luz ou acoplados a um fluorocromo e, neste caso, o sinal é observado 
recorrendo a um microscópio de fluorescência (caso dos anticorpos usados no trabalho). 
Existem anticorpos monoclonais, quando se produz apenas um tipo de anticorpo contra apenas uma região do 
antigénio, sendo estes os anticorpos mais específicos e anticorpos policlonais, quando temos anticorpos diferentes 
para uma mesma proteína e que se ligam a diferentes zonas da mesma. 
 
 
Figura	1	–	Anticorpos	monoclonais 
 
Figura	2	–	Anticorpos	policlonais 
Anticorpo	
Uma	única	zona	de	
ligação	
Múltiplas	zonas	de	ligação	
	
	 5	
Cultura	celular	
 
O	que	é?	
Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as 
caraterísticas próprias. Podem fazer-se culturas a partir de tecidos humanos, animais e vegetais. 
A cultura de tecidos implica a prévia desagregação (mecânica ou enzimática) do tecido original e em que as células 
são cultivadas numa camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	
	 6	
Cultura	celular	
 
Vantagens	
ü Possibilidade de estudar fenómenos, inacessíveis em tecidos intactos; 
ü Controlo das condições ambientais; 
ü Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caraterizadas; 
ü Economia de reagentes, tempo, etc.; 
ü Conhecimento de comportamento e função de uma população isolada de células. 
 
Desvantagens	
v Gasto elevado de material; 
v Condição de crescimento da cultura; 
v Instabilidade de cultura celular; 
v Perda de caraterísticas; 
v Dificuldade de extrapolação para o modelo de organismo intacto. 
 
Limitações	
Ø Necessidade de operadores experientes; 
Ø Perda de caraterísticas fenotípicas; 
Ø Necessidade do uso de marcadores devido à perda de caraterísticas fenotípicas; 
Ø Instabilidade das células. 
 
 
 
 
	
	 7	
 
 
Microscopia	
 
De	luz		
O microscópio ótico ou de luz é constituído por uma fonte de luz visível que é capaz de atravessar uma amostra e a 
imagem é captada/ampliada por um sistema de lentes. 
 
 
Figura	3	–	Microscópio	ótico 
 
	
	
	
	 8	
	
Microscopia	
De	fluorescência	
O microscópio de fluorescência é utilizado na observação de células vivas que apresentam proteínas/substâncias 
fluorescentes ou que através de uma adição de substâncias marcadas com fluorocromos possibilitam obter uma 
imagem que é o resultado de uma emissão secundária das moléculas fluorescentes. A utilização de filtros permite 
isolar diferentes comprimentos de onda emitidos, baseando-se assim a microscopia de fluorescência na propriedade 
que algumas substâncias possuem de emitirem fluorescência após absorverem energia ultravioleta. 
 
 
Figura	4	–	Microscópio	de	fluorescência	
	
	
	
	
	
	
	
	 9	
	
	
Citoesqueleto	
 
Microtúbulos	
O citoesqueleto é uma rede dinâmica, interdependente e altamente complexa de sistemas de filamentos de natureza 
proteica. 
Nas células eucariotas distinguem-se como exemplo desses sistemas de filamentos de natureza proteica os 
microtúbulos, os microfilamentos e os filamentos intermédios, mas daremos especial ênfase aos microtúbulos pois 
foram os que observámos em células quer na interfase quer na fase mitótica, no microscópio de fluorescência. 
Os microtúbulos são estruturas tubulares com cerca de 25nm de diâmetro, constituídos pela polimerização de um 
heterodímero de tubulina alfa e tubulina ß, originando uma parede constituída por 13 proto filamentos alinhados 
longitudinalmente. 
Apresentam duas extremidades, extremidade [+] e extremidade [-], onde as extremidades [+] apontam para a periferia 
celular e as [-] partem do centro organizador de microtúbulos (MTOC), que corresponde ao centrossoma. 
O centrossoma encontra-se adjacente ao núcleo, perto do centro das células interfásicas. 
O estudo de microtúbulos in vitro a partir de tubulina purificada levou à identificação das MAPs (proteínas de 
microtúbulos associados), que tanto têm um papel estrutural como de proteínas motoras,em que as cinesinas 
possibilitam o movimento em direção à extremidade [+] e as dineínas citoplasmáticas em direção à extremidade [-]. 
Adicionadas a soluções purificadas de tubulina, a maioria das MAPs baixam a concentração crítica necessária à 
formação dos microtúbulos, favorecem o seu crescimento e diminuem a sua taxa de dissociação. 
Os microtúbulos e as suas proteínas associadas estão envolvidos em fenómenos essenciais ao correto funcionamento 
celular, caso do tráfego intracitoplasmático de vesiculas e organitos durante a interfase, na construção do fuso mitótico 
e movimentação dos cromossomas no mesmo, das propriedades migratórias das células e da criação e manutenção 
de domínios intracitoplasmáticos diferenciados. 
 
 
 
	
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Materiais	e	reagentes	
Materiais	utilizados	
q Lamela com 6 poços; 
 
q Paraformaldeído (PFA) a 2%; 
q PBS (phosphate bovine sérum – Solução salina 
tamponada com fosfato); 
q 0,1% Triton-100; 
q Pinça; 
q Parafilme; 
q FBS (fetal bovine sérum) 
q Pipeta automática; 
q Papel de alumínio; 
q Caixa de cultura; 
q Falcon; 
q Anticorpo (mouse anti-α tubulina); 
q Anticorpo (anti mouse 488nm ); 
q Fluoresceína; 
q Vectashield; 
q DAPI; 
q Microscópio de fluorescência; 
q Filtro para a fluoresceína; 
q Cultura de células (humanas) – HeLa. 
 
 
 
 
Figura	5	–	Pipeta	automática 
	
Figura	6	-	Falcon 
	
	
	 11	
Métodos	
 
Método	direto	
Procedimento em que existe incubação direta das células com anticorpos conjugados com marcadores fluorescentes. 
Este método tem como desvantagem a pouca amplificação do sinal. 
 
 
Figura	5	–	Método	direto	
	
	
	
	
	
	
	
	 12	
Métodos	
Método	indireto	
Inicialmente, incubam-se as células ou as secções do material com anticorpos primários não marcados, produzidos 
num dado animal X. Posteriormente, incuba-se o material com anticorpos secundários marcados, produzidos noutro 
animal Y. 
Este método é mais sensível na deteção de antigénios na medida em que o anti corpo secundário amplifica o resultado 
final, fazendo com que a marcação seja mais intensa e, automaticamente, mais fácil a sua deteção ao microscópio de 
fluorescência. 
 
 
Figura	6	–	Método	indireto 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	
	 13	
Resultados	/	Discussão	
 
 
Os microtúbulos, quando vistos ao microscópio de fluorescência, apresentam-se marcados de verde fluorescente. O 
DNA, por sua vez, apresenta-se de azul. 
 
 
Figura	7	–Microtúbulos	e	DNA	em	microscopia	de	fluorescência	
Levaram-se células de HeLa a observar ao microscópio de fluorescência e que, através da técnica de 
imunofluorescência indireta, nos foi possível identificar algumas células em interfase e outras nas fases da mitose, 
respetivamente a fase de prófase, de metáfase e de anáfase e de telófase. 
Numa primeira visualização, observaram-se em células em interfase, como apresentamos a seguir: 
 
 
 
 
 
Figura	8	–	Célula	em	interfase	em	microscopia	de	fluorescência	
	
	
	
	
	 14	
Seguidamente, observaram-se células em vários estadios da mitose, respetivamente em profase, metafase, anafase e 
telofase, como se pode verificar nos acetatos.	
	
	
	
	
	
Figura	9	–	Célula	em	prófase	em	microscopia	de	fluorescência	
	
	
	
	
	
	
Figura	10	–	Célula	em	metáfase	em	microscopia	de	fluorescência	
	
	
	
	
	
Figura	11	–	Célula	em	anáfase	em	microscopia	de	fluorescência	
	
	
	
	
	
	
Figura	12	–	Célula	em	telófase	em	microscopia	de	fluorescência	
 
	
	 15	
 
Bibliografia	
	
Azevedo C.; Sunkel C.; Biologia Celular e Molecular, Nº 5, pp. (287-299) 
	
http://www.academia.edu/6550387/Princ%C3%ADpios_b%C3%A1sicos_de_Imunocitoqu%C3%ADmica 
http://knoow.net/cienciasexactas/quimica/imunocitoquimica/ 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3201116/ 
https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/newsletters-and-journals/bioprobes-journal-of-cell-biology-
applications/bioprobes-issues-2011/bioprobes-66-october-2011/guide-to-immunocytochemistry.html 
https://www.proteinatlas.org/learn/method/immunocytochemistry 
https://www.usbio.net/protocols/immunocytochemistry 
https://www.innovabiosciences.com/blog/immunofluorescence-immunocytochemistry/ 
http://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence 
https://biotium.com/support/tech-tips/tech-tip-combined-direct-and-indirect-immunofluorescence-using-primary-
antibodies-from-the-same-host/ 
http://www.microscopemaster.com/immunofluorescence-microscopy.html 
https://elearning.cespu.pt/ensino/pluginfile.php/202659/mod_resource/content/1/PL9%20BMC%20-
%20Imunocitoqu%C3%ADmica.pdf 
https://www.passeidireto.com/arquivo/18484611/trabalho-tecnicas-citoquimicas-e-imunocitoquimicas 
https://pt.slideshare.net/labimuno/imunohistoquimica 
https://pathologika.com/imuno-histoquimica/metodos-imunohistoquimicos/