FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRIA

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FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRIA/ABSORCIOMETRIA 
 
Qualquer técnica que utilize luz para medir concentrações de espécies químicas é 
chamada de espectrofotometria. Um procedimento baseado na absorção da luz visível é chamado 
de colorimetria. A luz visível (o tipo de radiação eletromagnética que podemos enxergar) 
representa apenas uma parte muito pequena do espectro eletromagnético-380 a 780 nm (1 nm = 
10-9 m). 
A variação de cor de um sistema, com a modificação da concentração de um certo 
componente, constitui a base da análise colorimétrica. A cor é provocada pela formação de um 
composto corado, resultante da adição de um reagente apropriado ou pode ser intrínseca ao 
constituinte analisado. 
 
Absorção de luz 
Quando uma molécula absorve um fóton, a energia da molécula aumenta e ela é 
promovida a um estado excitado mais energético. Por outro lado, quando a molécula emite um 
fóton, sua energia diminui de uma quantidade igual à energia do fóton. O estado de menor 
energia de uma molécula é chamado de estado fundamental. A luz visível e a radiação 
ultravioleta causam a transferência de elétrons para orbitais de maior energia. Em uma transição 
eletrônica, um elétron de um orbital molecular se move para outro orbital, causando um 
aumento ou uma diminuição simultânea na energia associada à molécula. Os orbitais 
moleculares descrevem a distribuição de elétrons em uma molécula, assim como os orbitais 
atômicos descrevem a distribuição dos elétrons em um átomo. 
 Quando a luz é absorvida por uma amostra, a energia radiante do feixe de luz diminui. A 
energia radiante, P, é a energia por segundo por unidade de área do feixe de luz. Uma 
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experiência rudimentar de espectrofotometria é vista na Figura 1. A luz passa por um 
monocromador (um prisma, ou uma rede de difração, ou mesmo um filtro) para selecionarmos 
um determinado comprimento de onda. A luz com um único comprimento de onda é denominada 
monocromática, que significa “de uma só cor”. A luz monocromática, com uma energia 
radiante Po, atinge uma solução absorvente de espessura de b cm e de concentração igual a c 
mols L-1. Em virtude das interações entre os fótons e as partículas absorventes, a potência 
radiante do feixe decresce de Po a P. A transmitância T da solução é a fração da radiação 
incidente transmitida pela solução (equação 1). A transmitância é freqüentemente expressa como 
uma porcentagem denominada porcentagem de transmitância. A absorbância A de uma solução 
𝑇 = 
𝑃
𝑃𝑜
 (1) 
 
Figura 1. Atenuação de um feixe de radiação por uma solução absorvente. A seta larga 
representando o feixe incidente significa maior potência que aquela transmitida pela solução. 
 
está relacionada com a transmitância de forma logarítmica, como mostra a equação 3. 
𝐴 = − log 𝑇 = 𝑙𝑜𝑔
𝑃𝑜
𝑃
 (3) 
3 
 
Observe que quando a A de uma solução aumenta, a T diminui. 
 Ordinariamente, a transmitância e a absorbância, como definidas nas equações 2 e 3 e 
descrita pela Figura 1 , não podem ser medidas como mostrado, considerando-se que a solução a 
ser estudada deva estar contida em algum tipo de recipiente (célula ou cubeta). Perdas por 
reflexão ou espalhamento podem ocorrer nas paredes das células, como pode ser observado na 
Figura 2. Essas perdas podem ser substanciais. Por exemplo, cerca de 8,5% de um feixe de luz 
amarela são perdidos por reflexão quando este passa por uma célula de vidro. A luz pode 
também ser espalhada em todas as direções a partir da superfície de moléculas grandes ou de 
partículas (como poeira) presentes no solvente, e esse espalhamento pode causar uma atenuação 
adicional do feixe quando este passa através da solução. 
 Para compensar esses efeitos, a potência do feixe, transmitida através de uma célula com 
a solução do analito, é comparada com a potência que atravessa uma célula idêntica contendo 
somente o solvente ou o branco dos reagentes. Os termos Po e P vão daqui para frente se referir à 
potência de um feixe que tenha passado por uma célula contendo o branco (solvente) e o analito, 
respectivamente. 
 
Lei de Beer 
De acordo com a lei de Lambert-Beer ou simplesmente lei de Beer, a absorbância é 
diretamente proporcional à concentração de uma espécie absorvente c e ao caminho óptico b do 
meio absorvente, como expresso pela equação 4, daí a importância dessa grandeza. 
𝐴 = − log 𝑇 = 𝑙𝑜𝑔
𝑃𝑜
𝑃
= 𝑎𝑏𝑐 (4) 
A absorbância é uma grandeza adimensional, mas algumas pessoas escrevem “unidades de 
absorbância” depois do valor da absorbância. Aqui, a é a constante de proporcionalidade 
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Figura 2. Perdas por reflexão e espalhamento com uma solução contida em uma célula de vidro 
típica. As perdas por reflexão podem ocorrer em todas as interfaces entre os diferentes materiais. 
Nesse exemplo, a luz passa pelas seguintes fronteiras, ar-vidro, vidro-solução, solução-vidro e 
vidro-ar. 
 
denominada absortividade. Ela é uma constante característica da espécie absorvente. Se c tiver 
unidades de g L-1 e b, as unidades de cm, a absortividade terá as unidades de L g-1 cm-1. Quando 
expressarmos a concentração na equação 4 em mols L-1 e b em cm , a constante de 
proporcionalidade é chamada absortividade molar, à qual é dado o símbolo especial, . Assim, 
A = bc (5) 
Em que  possui as unidades de L mol-1 cm-1. Quanto maior a absortividade molar, maior a 
absorbância. 
 A transmitância tem uma relação logarítmica com a concentração porque em cada porção 
infinitesimal do volume total, a diminuição na energia é proporcional à energia incidente 
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naquela seção. Quando a luz passa pela amostra, a perda de energia em cada camada sucessiva 
diminui, pois a magnitude da energia incidente que alcança cada camada está diminuindo. 
 A parte de uma molécula responsável pela absorção de luz é chamada de cromóforo. 
Qualquer substância que absorva luz visível parece colorida quando a luz branca é transmitida 
através dela ou é refletida a partir dela. A luz branca natural ou artificial (luz poli ou 
heterocromática) contém todas as freqüências do espectro visível (Tabela 1), ou seja, todas as 
cores fundamentais. Isso pode ser observado fazendo-se a luz branca atravessar um prisma de 
vidro ou de quartzo. A substância absorve determinados comprimentos de onda da luz branca, e 
nossos olhos detectam os comprimentos de onda que não são absorvidos. A cor observada é 
conhecida como a cor complementar da cor absorvida. Assim, por que uma solução vermelha é 
vermelha? Uma solução contendo Fe(SCN)2+ é vermelha porque absorve o verde da radiação 
branca que penetra no frasco e transmite o componente vermelho de forma inalterada (Figura 3). 
Assim, em uma determinação colorimétrica de ferro baseada no seu complexo com tiocianato, 
 
Tabela 1. Cores da luz visível 
 
 
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Figura 3. A cor de uma solução. A luz branca de uma lâmpada ou do sol atinge a solução de 
Fe(SCN)2+.O espectro de absorção mostra um máximo de absorbância na faixa de 460-500 nm. 
A cor complementar vermelha é transmitida. 
 
o máximo de variação na absorbância com a concentração ocorre com a radiação verde; a 
variação da absorbância com a radiação vermelha é desprezível. Em geral, a radiaçãoempregada 
em uma análise colorimétrica deve ser a cor complementar da solução do analito. Cores 
complementares são aquelas que, quando sobrepostas, dão a sensação de branco ou branco 
acinzentado; elas apresentam o máximo de absorção mútua, e o seu emprego é crucial para a 
perfeita observância da lei de Beer. A Tabela 1 mostra essa relação para várias partes do espectro 
visível. 
 
Termos empregados na espectrometria de absorção 
Além dos termos que temos introduzido para descrever a absorção de energia radiante, 
você pode encontrar outros termos na literatura ou associados a instrumentos antigos. 
 
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Medição da Absorbância 
Os requisitos essenciais para um espectrofotômetro (um instrumento para medir a 
absorbância da luz) são apresentados na Figura 4. A luz proveniente de uma fonte com emissão 
espectral contínua passa por um monocromador, que seleciona uma estreita faixa de 
comprimento de onda do feixe incidente. Essa luz “monocromática” passa pela amostra de 
caminho óptico b, e a energia radiante da luz emergente é medida. Enfim, o uso de radiação 
incidente com comprimento de onda correspondente ao da cor da solução de amostra é 
fundamental para o sucesso das determinações espectrofotométricas/colorimétricas. Caso o 
método analítico não especifique essa condição, um gráfico envolvendo medidas de absorbância 
em diferentes comprimentos de onda (espectro de absorção) permite identificá-la, já que ao 
maior valor de absorbância corresponde o comprimento de onda de cor complementar à cor da 
solução de amostra. 
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Figura 4. Diagrama esquemático de um experimento espectrofotométrico de feixe simples. 
 
Quando a lei de Beer falha 
A lei de Beer estabelece que a absorbância é proporcional à concentração da espécie 
absorvente. Ela se aplica para a maioria das substâncias quando a radiação é monocromática e as 
soluções a serem estudadas estão suficientemente diluídas ( 0,01 mol L-1). 
 Em soluções concentradas, as moléculas do soluto influenciam umas as outras devido à 
sua proximidade. Quando as moléculas do soluto ficam muito perto umas das outras, suas 
propriedades (incluindo a absortividade molar) sofrem ligeiras modificações. 
 Se a molécula absorvente participa de um equilíbrio químico dependente da 
concentração, a absortividade muda de acordo com a concentração e a lei de Beer não é 
observada. 
 Para uma análise espectrofotométrica, normalmente escolhemos o comprimento de onda 
onde ocorre a absorbância máxima por dois motivos: 1. A sensibilidade da análise é maior na 
região correspondente à absorbância máxima (ou seja, conseguimos um máximo de resposta para 
uma dada concentração de analito); 2. A curva na região correspondente ao máximo tem sua 
forma relativamente achatada, o que leva a uma variação pequena na absorbância. A lei de Beer 
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é obedecida quando a absorbância é constante dentro da faixa de comprimento de onda 
selecionada (Figura 5). 
 
 
Figura 5. No espectro de absorção da figura acima, a absortividade do analito é praticamente 
constante sobre a banda A da fonte. Observe no gráfico da lei de Beer na figura acima que o uso 
da banda A estabelece uma relação linear. No espectro, a banda B coincide com uma região 
sobre a qual a absortividade do analito se altera. 
 
Curvas de referência ou curvas padrão 
Ao usarmos a espectrofotometria ou a colorimetria com técnica analítica para uma 
determinada espécie química usando um determinado equipamento, deve-se considerar que a 
absortividade (a) e o caminho óptico (b) da expressão matemática da lei de Beer tornam-se 
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constantes. Trata-se de uma determinada espécie química sob análise, portanto a é uma 
constante, num equipamento específico, com seu conjunto de cubetas e por isso b também é 
constante. Então, na expressão matemática da lei de Beer (expressão 4): 
A = abc =K1K2c (6) 
ou seja: 
A = kc (7) 
A expressão 7 é a equação de uma reta que passa pela origem dos eixos cartesianos de um 
sistema de coordenadas formado pela concentração da solução (c) na abscissa, e pela 
absorbância (A) na ordenada. Verifica-se então que a absorbância é uma grandeza direta e 
linearmente proporcional à concentração da espécie química. Os erros experimentais 
indeterminados, porém, exigem a introdução de outra constante na expressão 7 na forma de uma 
parcela aditiva que procura controlar esses erros; então: 
A = kc  A = K0 + K1c (8) 
A expressão 8 continua sendo a equação de uma reta só que não mais partindo da origem 
dos eixos cartesianos, mas de um valor constante K0, chamado de coeficiente linear da reta, e se 
refere ao ponto em que a mesma corta o eixo das ordenadas; a outra constante, k1, é chamada de 
coeficiente angula da reta, e diz respeito à tangente do ângulo que a mesma faz com o eixo das 
abscissas. 
As constantes k0 e k1 são obtidas experimentalmente. Soluções de concentrações 
exatamente conhecidas do analito, chamadas de soluções de referência ou soluções padrão, são 
submetidas à espectrofotometria/colorimetria, chegando-se aos valores experimentais respectivos 
das absorbâncias. A posse de no mínimo três pares de dados experimentais, concentração do 
analito (X), e absorbância (Y), permite que estimemos os valores de k0 e k1 pelo método 
estatístico dos mínimos quadrados, e através das expressões: 
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𝑘0 = 
(∑ 𝑌) (∑ 𝑋2) − (∑ 𝑋) (∑ 𝑋𝑌)
 
𝑁 ∑ 𝑋2−(∑ 𝑋)
2 (9) 
𝑘1 = 
𝑁 ∑ 𝑋𝑌 ∑ − (∑ 𝑋) (∑ 𝑌)
 
𝑁 ∑ 𝑋2−(∑ 𝑋)
2
 
 (10) 
𝑟 = 
𝑁 ∑ 𝑋𝑌 ∑ − (∑ 𝑋) (∑ 𝑌)
 
√[𝑁 ∑ 𝑋2−(∑ 𝑋)
2] [𝑁 ∑ 𝑌2−(∑ 𝑌)
2] 
 (11) 
 
Os valores de k0 e k1 assim obtidos caracterizam um ajuste da reta aos dados 
experimentais gerados. A qualidade desse ajuste pode ser estimada por um terceiro parâmetro da 
reta, o coeficiente de correlação linear, r, que pode ser calculado por meio da expressão 11. 
Quanto mais próximo de 1, mais perfeito é o ajuste, ou melhor a adequação dos pontos à uma 
reta. 
 Finalmente, de posse das estimativas dos parâmetros k0 e k1, pode-se chegar à 
concentração do analito numa amostra qualquer, pela simples medida da absorbância da sua 
solução e aplicação dessa absorbância às expressões 12 ou 13 
A = k0 + K1c (12) 
Sendo: 
c = (A - K0)/k1 (13)