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147 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 A tecnologia do DNA recombinante trans- formou a maneira como a pesquisa biológica Ø realizada nos dias de hoje. Este conjunto de tØc- nicas, desenvolvido em meados de 1970, teve um marco importante com o descobrimento de dois tipos de enzimas, que permitiram a clonagem do DNA. As do primeiro tipo sªo as chamadas enzi- mas de restriçªo, que clivam a dupla-hØlice do DNA em sítios específicos, gerando um conjun- to característico e reprodutível de fragmentos, permitindo o isolamento de seqüŒncias de DNA de interesse.Um outro tipo de enzima, a DNA ligase, Ø capaz de ligar os fragmentos de DNA, por exemplo, a uma molØcula replicante de DNA, ou vetor, produzindo o DNA recombinante. Este DNA recombinante pode ser introduzido em cØlulas apropriadas, normalmente, bactØrias ou vírus, por serem altamente replicativos. O isola- mento e a identificaçªo dos descendentes de uma œnica cØlula portadora de um mesmo DNA re- combinante desejado, isto Ø, um clone, permi- tem nªo só a obtençªo de quantidades ilimitadas da determinada proteína, como tambØm o seu seqüenciamento nucleotídico e deduçªo dos ami- noÆcidos constituintes. Assim, qualquer segmen- to de DNA clonado pode ser reinserido em vetores, e estes transformados em cØlulas, e tes- tados para atividade biológica. DNA Recombinante Este grupo de tØcnicas, coletivamente cha- mado de tecnologia do DNA recombinante, tornou-se a abordagem dominante no estudo de muitos processos biológicos. Neste capítu- lo, abordaremos vÆrias tØcnicas que compıem a tecnologia do DNA recombinante. O poder e o sucesso desta nova tecnologia trouxeram muitos benefícios prÆticos, particularmente na Medicina. ENZIMAS DE RESTRI˙ˆO As enzimas de restriçªo sªo endonucleases encontradas em bactØrias, e seu papel biológi- co Ø proteger o genoma bacteriano de possíveis vírus invasores, clivando qualquer DNA exó- geno. O DNA da própria bactØria nªo Ø reco- nhecido por essas enzimas porque esses sítios se encontram metilados. Estas enzimas sªo al- tamente específicas e reconhecem de quatro a oito nucleotídeos de ambas as fitas do DNA. Algumas endonucleases de restriçªo produzem quebras assimØtricas, originando caudas cur- tas de DNA fita-simples nas duas extremida- des. Estes terminais sªo conhecidos como terminais coesivos, uma vez que cada cauda sim- ples fita pode formar pares complementares Leny Toma Yara M. Michelacci Helena B. Nader MarimØlia Porcionatto Lœcia O. Sampaio 148 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 com a outra cauda produzida pela mesma en- zima. Outras enzimas, ainda, geram terminais retos ou cegos (Fig. 12.1). A DNA-ligase res- taura ligaçıes fosfodiØsteres de ambos os ter- minais. Mais de 90 endonucleases de restriçªo jÆ foram identificadas, purificadas, e estªo hoje dis- poníveis comercialmente. Seus nomes consistem em abreviaçıes de trŒs letras do organismo do qual foi isolado (por exemplo, Eco, para Esche- richia coli, Hin para Haemophilus influenza, Hae para Haemophilus aegyptius) seguido da desig- naçªo da linhagem (se necessÆrio) e uma nume- raçªo romana (para distinguir diferentes enzi- mas de um mesmo organismo). Exemplos sªo dados na Tabela 12.1. A disponibilidade dessas enzimas possibili- tou a construçªo de mapas de restriçªo, onde os fragmentos gerados podem ser agora separados em gel de agarose, e corados com brometo de etídio. As bandas visualizadas com uma fonte de luz UV podem ser fotografadas (Fig. 12.2). A migraçªo relativa no gel, comparado a padrıes de peso molecular, refletem o tamanho dos frag- A) Produçªo de terminais cegos -N-N-A-G-C-T-N-N- Alu I -N-N-A-G C-T-N-N- -N-N-T-C-G-A-N-N- -N-N-T-C G-A-N-N- terminal cego B) Produçªo de terminais coesivos -N-N-G-A-A-T-T-C-N-N- Eco RI -N-N-G A-A-T-T-C-N-N- -N-N-C-T-T-A-A-G-N-N- -N-N-C-T-T-A-A G-N-N- terminal coesivo N, representa qualquer base. Fig. 12.1 Formaçªo de terminais coesivos e cegos pela clivagem de diferentes enzimas de restriçªo. Tabela 12.1 Sítios de Reconhecimento de Algumas Enzimas de Restriçªo Enzima Fonte Sítio de Reconhecimento Terminais Coesivos e Cegos Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC Coesivo Eco RI Escherichia coli RY 13 GAATTC Coesivo Hind III Haemophilus influenza Rd AAGCTT Coesivo Hae III Haemophilus aegyptius GGCC Cego Hpa I Haemophilus parainfluenzae GTTAAC Cego Hpa II Haemophilus parainfluenzae CCGG Coesivo Mbo I Moraxella bovis GATC Coesivo Taq I Thermus aquaticus TCGA Coesivo Not I Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC Coesivo Sfi I Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC Coesivo N, representa qualquer base. 149 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 mentos. Ainda, a digestªo incompleta em tem- pos variÆveis permite a deduçªo da organizaçªo relativa desses fragmentos na molØcula de DNA como um todo. PLASM˝DEOS Plasmídeos sªo pequenas molØculas de DNA dupla fita, circulares, de ocorrŒncia natural em bactØrias, que podem replicar independentemen- te, sem estar associados a cromossomos. Nor- malmente carregam genes para inativaçªo de antibióticos, produçªo de toxinas e degradaçªo de produtos naturais. Algumas características fundamentais sªo requeridas para que os plas- mídeos sejam utilizados como vetores: 1) ori- gem de replicaçªo (seqüŒncia de DNA que auxilia a replicaçªo da molØcula de DNA, atravØs de in- teraçıes com a DNA polimerase da cØlula hos- pedeira); 2) genes que conferem resistŒncia a antibióticos, assim a bactØria que carrega o plas- mídeo pode ser selecionado (por exemplo, re- sistŒncia a ampicilina, tetraciclina); 3) poli-linker ou seqüŒncias de sítios de clonagem mœltiplas, sªo seqüŒncias sintØticas, adicionadas aos plas- mídeos naturais, e que contŒm uma cópia de diversos sítios de restriçªo diferentes (Fig. 12.3). Plasmídeos, em geral, consistem em apenas 2 a 4kb de DNA, tamanho este que facilita a anÆlise do fragmento de DNA inserido. Para ser clonado num plasmídeo, um fragmento do in- serto Ø ligado a um sítio de restriçªo apropria- do no vetor e a molØcula recombinante Ø usada para transformar E.coli. Colônias resistentes ao antibiótico, que contŒm DNA plasmidial, sªo selecionadas. Tais bactØrias contendo plasmí- deo recombinante sªo colocadas para crescer em grandes quantidades e seu DNA extraído (Fig. 12.4). As molØculas plasmidiais, que nor- malmente se apresentam em centenas de cópias por cØlula, podem ser separadas do DNA cro- mossômico bacteriano; o resultado Ø um DNA plasmidial purificado, que Ø apropriado para anÆlise do inserto clonado. Fig. 12.2 Visualizaçªo de bandas de DNA em eletrofo- rese em gel de agarose por coloraçªo com brometo de etídio e iluminaçªo ultravioleta. VETORES Sªo definidos como vetores molØculas de DNA que podem replicar quando introduzidos a uma cØlula hospedeira, como as cØlulas bacte- rianas ou leveduras, e do qual possam ser isola- dos posteriormente. A clonagem de fragmentos de DNA em vetores por meio de enzimas de res- triçªo e DNA-ligase, conforme descrito aqui, possibilita a propagaçªo do fragmento clonado juntamente com o vetor. Como as bactØrias e leveduras crescem facilmente no laboratório, enormes quantidades das seqüŒncias de DNA desejadas sªo obtidas concomitantemente. Ve- tores com alta capacidade de clonagem tŒm sido desenvolvidos nos œltimos anos (Tabela 12.2). No entanto, cada um deles apresenta suas van- tagens e tambØm limitaçıes. Tabela 12.2 Vetores mais Utilizados em Clonagem Molecular Vetor Hospedeiro Tipo de Clonagem Tamanho do Inseto Plasmídeo BactØria Genômica. cDNA 5-10kb Bacteriófago lambda BactØria Genômica.cDNA < 20kb Cosmídeos BactØria Genômica < 50kb Cromossomosartificiais Levedura Genômica 100-1.000kb Bandas de DNA fluorescentes LUZ UV 150 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 Fig. 12.3 Um plasmídeo típico. Em alguns plasmídeos o poli-linker estÆ localizado dentro do fragmento do gene lac Z de E. coli, que codifica b -galactosidase. O poli-linker nªo interfere na síntese da enzima ativa. Quando E. coli sªo cresci- das em presença de X-gal, um composto incolor, a clivagem de X-gal pela enzima produz um produto insolœvel azul. Assim, colônias de E. coli com plasmídeos que nªo tŒm inserto de DNA externo no poli-linker sªo azuis. Contudo, a inserçªo de DNA no poli-linker interfere ou termina a janela de leitura do gene lac Z; galactosidase nªo Ø produzida e o plasmídeo resultante produz colônias incolores que, assim, distinguem-se das outras na placa de Ægar. Fig. 12.4 Etapas bÆsicas da clonagem em plasmídeos. BACTERIÓFAGO LAMBDA O fago lambda Ø um vírus bacteriano de DNA dupla fita, com cerca de 45kb. É o vetor ideal para insertos de DNA de aproximadamente 15kb de comprimento. A clonagem de grandes fragmentos de DNA em fago Ø possível pelo fato de um segmento de 15-25kb do DNA do fago poder ser substituído, sem comprometer sua re- plicaçªo em E. coli. O empacotamento do DNA do fago na partícula viral Ø limitado pelo seu comprimento total, que deve ser de aproxima- damente 50kb. A estrutura do fago Ø muito simples, con- sistindo em DNA, ou ocasionalmente RNA, que carrega genes para a replicaçªo, rodeado por uma capa de proteçªo ou capsídeo, com- posto por molØculas protØicas. O processo de infecçªo ocorre em trŒs eta- pas, mostradas na Fig. 12.5: 1) O fago adere na superfície da bactØria e injeta seu DNA cromossomal dentro da cØ- lula. Amp R Hi nd II I Sp h I Ps t I Sa l I Xb a I Ba m H I Kp n I Sm a I Sa c I Ec o RI Poli-linker Promotor Iac Iac Z Ori DNA recombinante + + Plasmídeo Inserto BactériaTransformação da bactéria Multiplicação do DNA recombinante Divisão de célula hospedeira Colônias bacterianas crescendo em meio sólido 151 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 2) O DNA do fago Ø replicado, geralmente com enzimas específicas, codificadas por genes presentes no cromossomo do fago. 3) Outros genes do fago direcionam a síntese de proteínas componentes do capsídeo, e novas partículas de fago sªo montadas e li- beradas da bactØria. O fago lambda pode replicar atravØs de duas vias, uma lítica e outra chamada lisogŒnica. Via Lítica Alguns tipos de fagos possuem o ciclo infectivo completo bastante rÆpido, possivel- mente em menos de 20 minutos. Este tipo de infecçªo rÆpida Ø chamada ciclo lítico, uma vez que a liberaçªo das novas partículas de fago estÆ associada à lise da cØlula bacteria- na. Um aspecto característico do ciclo de in- fecçªo lítico Ø que a replicaçªo do DNA do fago Ø seguida imediatamente da síntese das proteínas do capsídeo e o DNA do fago nªo Ø mantido na bactØria hospedeira numa con- diçªo estÆvel. A replicaçªo do DNA do fago lambda se dÆ atravØs de um mecanismo de círculo rolante onde as novas fitas vªo sendo continuamente desen- roladas da molØcula molde (template), gerando vÆrios genomas lambda linear unidos por sítios cos (coesivos) (Fig. 12.6). As seqüŒncias nu- cleotídicas dos sítios cos sªo reconhecidas por endonucleases específicas, que clivam o DNA, produzindo um genoma lambda completo e li- near. Portanto, durante a replicaçªo de seu DNA o fago lambda pode intercalar entre as formas linear e circular (Fig. 12.7). Ciclo LisogŒnico A infecçªo lisogŒnica Ø caracterizada pela in- tegraçªo do DNA do fago ao DNA cromosso- mal da bactØria, mantidas assim por milhares de divisıes celulares ou geraçıes. Algumas altera- çıes ambientais fazem com que o DNA do fago seja liberado do genoma da bactØria e o fago re- verte o ciclo lítico e lisa a cØlula. M13 FAGO FILAMENTOSO O fago filamentoso M13 possui um genoma muito menor e mais simples do que o fago, com Fig. 12.5 Processo de infecçªo, replicaçªo e lise da cØlula bacteriana por um bacteriófago. Partícula de fago DNA 1. O fago se liga à bactØria e injeta seu DNA Moléculas de DNA do fago 2. O DNA do fago Ø replicado Lise celular Componentes do capsídeo 3. Compronentes do capsídeo sªo sintetizados, novas partículas do fago sªo montadas e liberadas Novas partículas de fago 152 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 Fig. 12.6 Replicaçªo do DNA l atravØs do círculo rolante. Fig. 12.7 Formas linear e circular do DNA l. cerca de 6.407 nucleotídeos. É um DNA circu- lar, porØm simples fita, o que o distingue dos ou- tros fagos. O DNA do fago M13 Ø injetado em E. coli atravØs do pílus. Uma vez dentro da cØlula o DNA simples fita Ø usado como molde para sín- tese da fita complementar, resultando num DNA dupla fita. Este DNA nªo Ø incorporado no geno- ma bacteriano, mas replica atØ 100 cópias por cØlula. Quando a bactØria divide, cada filha rece- be cópias do genoma do fago, que continua a re- plicar, mantendo um nœmero determinado por cØlula. Novas partículas de fago sªo continuamen- te montadas e liberadas, com cerca de 1.000 no- vos fagos sendo produzidos durante cada geraçªo de uma cØlula infectada. Ao contrÆrio do fago lam- bda, o fago M13 nªo leva à lise e morte celular. Cos Cos Cos Cos Replicação por círculo rolante Clivagem pela endonuclease Componentes protéicos do capsídeo Endonuclease cliva no sítio cos Novas partículas de fago são montadas Terminal coesivo Sítio Cos Forma linear do DNA l Terminal coesivo Endonuclease GG G G G G G G G G G GGG GG G C C C C C C C C C C C CC C C C C A A T Forma circular do DNA l 153 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 O aspecto mais atraente do fago M13 como vetor de clonagem Ø que os genes clonados em M13 podem ser facilmente obtidos na forma de fita simples. Essa forma Ø requerida em diversas situaçıes ou tØcnicas, como seqüenciamento de DNA, mutagŒnese in vitro, ou mesmo, utilizado como molde na obtençªo de sondas radioativas. Outras conveniŒncias sªo o tamanho peque- no, que facilita sua manipulaçªo e tambØm o fato de que a forma replicativa dupla fita comporta- se como um plasmídeo, sendo facilmente obtido de uma cultura de E. coli, e pode ser reintrodu- zido por transfecçªo. COSM˝DEOS Sªo vetores sofisticados que reœnem carac- terísticas híbridas dos fagos lambda e plasmí- deos bacterianos. Possuem a capacidade de acomodar, ou empacotar grandes fragmentos de DNA e introduzi-los em cØlulas bacterianas. Infectam as bactØrias de maneira semelhante a de um vírus lambda, reassumem a forma circu- lar e replicam-se como um grande plasmídeo. Um cosmídeo possui um sítio cos, um mar- cador de seleçªo, como o gene de resistŒncia a um antibiótico e uma origem de replicaçªo. Os cosmídeos nªo produzem placas, mas formam colônias no meio de seleçªo, como um vetor plas- mideal. Podem abrigar insertos de atØ 50kb. CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS DE LEVEDURAS Cromossomos artificiais de leveduras (YACS, Yeast Artificial Chromosomes) sªo cromossomos lineares, normais em Saccharomyces cerevisae (levedura de padaria), utilizados como vetores para clonagem de fragmentos de DNA de atØ 1.000kb. Tal qual cromossomos normais, pos- suem centrômeros e telômeros, replicam-se e se- gregam-se no hospedeiro. CONSTRU˙ˆO DE BIBLIOTECAS Bibliotecas Genômicas Uma biblioteca genômica Ø um conjunto de clones recombinantes que contØm todo o DNA presente num organismo. Portanto, qualquer gene desejado pode ser selecionado a partir da biblioteca daquele organismo ou tecido. Um exemplo de construçªo de uma biblioteca de DNA genômico Ø mostrada na Fig. 12.8. DNAgenômico humano Ø parcialmente digerido com uma enzima de restriçªo, como Sau3A. Assim, fragmentos parcialmente clivados, com tamanho adequado para clonagem (~20 kb), sªo selecio- nados por gradiente de sacarose, ou qualquer outro mØtodo de fracionamento por tamanho. Estes fragmentos sªo, entªo, ligados a braços de bacteriófago lambda, previamente tratados com Sau3A ou Bgl II, que tambØm Ø Sau3A compatí- vel, de modo a complementar a extremidade Sau3A dos fragmentos de DNA humano. Após empacotamento in vitro em partículas infecciosas de bacteriófago lambda, a biblioteca estÆ pronta. Este conjunto de DNA recombinante serÆ sub- metido ao processo de clonagem, isto Ø, triagem do clone que contØm a seqüŒncia desejada. Bibliotecas de DNA Complementar (cDNA) Em eucariotos muitos genes sªo transcritos em RNAm somente em determinados tipos ce- lulares. As seqüŒncias específicas de DNA, ex- pressas como RNAm naquele tipo particular de cØlula, podem ser clonadas sintetizando-se có- pias de DNA a partir de RNAm isolado daquela cØlula e, entªo, clonando essas cópias de DNA em plasmídeos ou bacteriófago lambda. As có- pias de DNA a partir dos RNAm sªo chamados de DNA complementar (cDNA). As vantagens de se utilizar bibliotecas de cDNA sªo: 1. Representam apenas seqüŒncias codificado- ras, expressas como RNAm de um tipo ce- lular, com a vantagem de apresentar ausŒncia de íntrons presentes numa biblioteca de DNA genômico. 2. Uma segunda vantagem seria a possibilidade de enriquecer a biblioteca, utilizando teci- dos com alta expressªo e/ou expressªo sele- tiva da proteína de interesse. A primeira etapa na construçªo de uma bi- blioteca de cDNA consiste em isolar RNA total da cØlula ou tecido de interesse. Numa segun- da etapa, RNAm sªo separados dos outros RNAs ribossomais e transportadores, atravØs de uma característica presente nos RNAm de eu- 154 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 cariotos. Os RNAm de eucariotos possuem 50 a 250 resíduos de adenilato, chamado de cau- da de poli-A (Fig. 12.9). Esta cauda Ø capaz de parear pequenas seqüŒncias sintØticas de timi- dilato acopladas a uma matriz, em colunas cha- madas de oligo-dTs. Uma vez que os outros RNAs nªo se ligam à coluna, eles podem ser separados do RNAm, que por sua vez sªo re- cuperados por eluiçªo em tampªo com baixa concentraçªo de sal. A enzima transcriptase reversa, isolada de retrovírus, Ø utilizada para sintetizar uma fita de DNA complementar para cada RNAm, utilizan- do primers de oligo-dT, que se hibridizam com a cauda de poli-A no terminal 3. Uma vez que as fitas simples de cDNA sªo sintetizadas, os RNAm sªo removidos por trata- mento com Ælcali, que hidrolisa RNA, mas nªo DNA. Numa próxima etapa a DNA polimerase usa o cDNA simples fita como molde para sin- tetizar a fita complementar, produzindo, assim, uma dupla fita completa, correspondente a cada RNAm da preparaçªo original. Pequenos segmentos de DNA dupla fita, contendo sítios de restriçªo para enzimas de res- triçªo particulares sªo ligados a ambos termi- nais do cDNA dupla fita. Estes segmentos chamados ligantes sªo selados atravØs da DNA ligase de bacteriófago T4. Ligaçıes entre termi- nais cegos ou retos sªo menos eficientes que entre terminais coesivos, mas podem ser maxi- mizados com a adiçªo de altas concentraçıes desses ligantes na reaçªo de ligaçªo. O cDNA dupla fita resultante, contendo o ligante em am- bos terminais, sªo agora submetidos à digestªo com a enzima específica para o ligante, geran- do, assim, um cDNA com terminais coesivos. Este produto estÆ pronto para ser ligado a um vetor, seja um plasmídeo ou bacteriófago, pre- viamente tratado com a mesma enzima de restri- çªo. Os vetores recombinantes sªo entªo submetidos à eletroporaçªo em E. coli (inclusªo dos plasmídeos recombinantes na cØlula), ou empacotados in vitro em partículas virais in- fectivas para E. coli. O conjunto de clones re- combinantes daquele determinado tecido ou cØlula estÆ agora representado nessa biblioteca de plasmídeos ou fago lambda. Fig. 12.8 Construçªo de uma biblioteca de DNA genômico humano em fago lambda. Sítios Bam HI DNA genômico humano Braço esquerdo Braço direito Vetor l Digestão por Bam HI Fragmentos internos Remoção de fragmentos internos não essenciais à replicação do fago Braço Braço DNA ligase Braço esquerdo Braço direitoInserto Empacotamento in vitro no bacteriófago e infecção da E. coli Biblioteca de fragmentos de DNA humano Fragmentos de DNA com ~20kb após digestão parcial Digestão parcial com Sau 3A 155 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 Identificaçªo de Clones Específicos numa Biblioteca Genômica ou de cDNA Os mØtodos mais comuns de se identificar clones de interesse (screening) dentre os milhares numa biblioteca, consiste em hibridizaçªo com sondas radioativas de DNA ou RNA, ou ainda atravØs da identificaçªo da proteína expressa. Sondas de Oligonucleotídeos SintØticos No caso de uma biblioteca de fago lambda, E. coli sªo infectadas por vírions lambda recom- binantes, e imediatamente plaqueadas e imobili- zadas numa camada de Ægar nutritivo em placas de Petri. Placas formadas no Ægar (halo mais cla- ro), contendo vírions recombinantes sªo trans- feridos a membrana de nÆilon, como se fosse um mata-borrªo. Parte das partículas virais em cada placa adsorve na superfície da membrana, embora grande parte permaneça nas placas, na superfície do Ægar da placa de Petri. Desta ma- neira, uma rØplica da placa de Petri contendo clones de lambda individuais sªo reproduzidos na superfície da membrana. A placa de Petri origi- nal, contendo a coleçªo de clones lambda, Ø re- frigerada e guardada. A membrana Ø, entªo, in- cubada numa soluçªo alcalina, que desfaz os vírions, liberando e desnaturando o DNA encap- sulado. Este DNA Ø fixado à membrana por ex- posiçªo à luz UV atravØs de cross-linking, ou entªo desnaturado no forno por duas horas. A membrana Ø incubada com a sonda radioativa sob condiçıes especiais de hibridizaçªo. Son- das nªo hibridizadas sªo lavadas, e o filtro Ø sub- metido a auto-radiografia. A presença de um clone recombinante con- tendo DNA complementar à sonda irÆ aparecer como uma mancha escura no filme de raios X. A posiçªo dessa mancha no autoradiograma Ø co- localizada na placa de Petri original, e a placa identificada. As partículas virais da placa-mªe sªo reinfectadas em E. coli, e replaqueadas, atØ se- rem clonadas, isto Ø, esse processo se repete atØ a obtençªo de placas livre de contaminaçªo. Pro- cesso semelhante pode ser aplicado na identifi- caçªo de clones de interesse numa biblioteca construída em plasmídeos. Sondas oligonucleotídicas específicas para genes que codificam proteínas nªo tªo abundan- Fig. 12.9 SumÆrio do procedimento de construçªo do cDNA. 156 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 tes podem ser sintetizadas quimicamente, ba- seando-se na seqüŒncia de aminoÆcidos da pro- teína de interesse. Uma vez que primers contendo apenas 20 nucleotídeos sªo suficientes para a construçªo da sonda e para a identificaçªo dos clones, apenas uma parte da proteína necessita ser seqüenciada. Normalmente, a proteína de interesse precisa ser purificada, digerida com uma ou mais proteases, resultando em peptíde- os específicos. A seqüŒncia de aminoÆcidos ami- noterminal Ø determinado por degradaçªo seqüencial de Edman. Baseando-se no código genØtico, sondas de oligonucleotídeos codifican- do seqüŒncias peptídicas determinadas podem ser sintetizadas e marcadas radioativamente. Ao se escolher quais seqüŒncias peptídicas usar na construçªo dos primers de oligonucleotídeos, deve-se levar em consideraçªo a degeneraçªo do código genØtico. Assim, peptídeos contendo ar- ginina, leucina ou serina precisam ser evitados,se possível, uma vez que seis diferentes códons codificam para cada um desses aminoÆcidos. Clonagem em Vetores de Expressªo Clones de interesse tambØm podem ser iden- tificados atravØs da detecçªo de proteínas espe- cíficas. Para isso, vetores de clonagem especiais sªo utilizados, como vetores de expressªo lamb- da, na qual o DNA clonado Ø transcrito em RNAm, que por sua vez Ø traduzido na proteína em questªo. Um exemplo de vetor de expressªo Ø lamb- da gt11, concebido para expressar altos níveis da proteína beta-galactosidase de E. coli. O œnico sítio de restriçªo para EcoRI nesse vetor situa-se perto do terminal 3 do gene da galactosidase. Se um cDNA ou um fragmento de DNA genô- mico codificante de proteína for inserido nesse sítio de EcoRI na orientaçªo correta e no mes- mo sentido da janela de leitura, serÆ expresso como uma proteína fundida à galactosidase. Pla- cas resultantes da infecçªo com lambda gt11 re- combinante conterÆ altas concentraçıes de tal proteína fundida. Estas proteínas podem ser transferidas e fixadas a uma membrana de nÆi- lon ou nitrocelulose, que serÆ incubada com um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína de interesse. Lavando-se o filtro, remove-se an- ticorpos nªo ligados à proteína fundida ligada ao filtro. Os anticorpos ligados sªo detectados incubando-se o filtro com um segundo anticor- po radioativo que se liga ao primeiro anticorpo. Qualquer mancha que apareça no auto-radio- grama Ø utilizada para localizar placas na placa master original, contendo o gene de interesse. AN`LISE E SEQÜENCIAMENTO DO DNA CLONADO Uma vez que um cDNA ou fragmento de DNA genômico em particular foi clonado, ele pode ser excisado do vetor com a mesma enzi- ma utilizada para inseri-lo, ou com outras enzi- mas apropriadas. Assim, uma vez que o vetor foi dissociado do DNA clonado, ambos sªo separa- dos em eletroforese em gel de agarose, e o in- serto Ø eluído do gel, e agora estÆ pronto para ser introduzido num vetor conveniente para se- qüenciamento. MØtodo de Maxam-Gilbert O primeiro mØtodo de seqüenciamento foi desenvolvido por Allan M. Maxam e Walter Gil- bert no final de 1970. O mØtodo envolve cliva- gem química específica, após marcaçªo de um dos terminais com 32P. A polinucleotídeo quina- se catalisa a adiçªo de 32P à hidroxila terminal 5. O DNA marcado radioativamente Ø entªo cli- vado quimicamente em determinadas bases: 1. As purinas sªo destruídas pelo dimetilsulfa- to, que metila a guanina no N-7 e a adenina no N-3. A ligaçªo glicosídica de uma purina metilada Ø prontamente quebrada por aque- cimento em pH neutro, o que deixa o açœ- car sem a base. O aquecimento subseqüente em Ælcali leva à clivagem do arcabouço em G (clivagem só em guanina), enquanto o tra- tamento com Æcido diluído causa clivagem tanto em A quanto em G (clivagem tanto em adenina quanto em guanina). 2. A hidrazinólise cliva anØis de T e C, que Ø seguido do tratamento com piperidina, que remove ambas as bases modificadas (cliva- gem de timina e citosina). A hidrazinólise em presença de NaCl 2M poupa T, seguido de piperidina, que remove C (clivagem de citosina). Assim, o DNA pode ser clivado só em G, em A e G, em C e T, e só em C. Os fragmentos de 157 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 cada mistura sªo separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, que fracionam por tama- nho molecular. O gel Ø seco e submetido à auto- radiografia. Comparando-se as quatro colunas correspondentes, a seqüŒncia pode ser deduzi- da (Fig. 12.10). MØtodo do Dideoxi de Sanger Alguns anos mais tarde, Frederick Sanger e seus colaboradores desenvolveram um segundo mØtodo de seqüenciamento, que Ø hoje o mais utilizado. Este mØtodo envolve a utilizaçªo de 2,3-dideoxinucleosídeo trifosfato (ddNTPs) (Fig. 12.11), que nªo possui o grupo hidroxila 3, responsÆvel pela elongaçªo da cadeia; daí tambØm serem conhecidos como o mØtodo do dideoxi. Um DNA simples fita Ø hibridizado com um primer deoxinucleotídico sintØtico e marcado ra- dioativamente no terminal 5. O primer Ø alon- Fig. 12.10 Seqüenciamento de DNA pelo mØtodo de Maxam-Gilbert. 5’ GGCC Fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli GACT 5’ +[a –32P]dGTP +[a –32P]dCTP TUBO 2TUBO 1 GACT 5’ 3’5’ GGCC GACT 5’ 3’ 32p C5’ GGCC 3’3’32p G G A+G C+T C G A+G C+T C Eletroforese em gel de poliacrilamida G A+G C+T C CC+TA+GG TopoTopo Fundo Fundo Se qü ên cia G T C T A G C A A T G G A G A T C G T T A C Se qü ên cia c om pl em en ta r Auto-radiografia do gel 158 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 Fig. 12.11 Estrutura do deoxinucleosídeo trifosfato e dideoxinucleosídeo trifosfato. gado em quatro reaçıes separadas, contendo os quatro deoxinucleosídeos trifosfatos normais (dNTPs), mais um dos quatro dideoxinucleosí- deos trifosfato (ddNTPs), numa proporçªo de 100 para 1. Uma molØcula de ddNTP pode ser adicionada no lugar de um dNTP normal cor- respondente, mas quando isto ocorre a elonga- çªo da cadeia pÆra porque ddNTP nªo possui a hidroxila 3. Com o tempo, cada reaçªo conterÆ uma mistura de cadeias prematuramente termi- nadas a cada ocorrŒncia de um ddNTP. Cada mistura de reaçªo Ø submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida, e os diferentes fragmen- tos sªo detectados por auto-radiografia. A de- tecçªo de bandas no filme de raios X em cada uma das reaçıes permite ler diretamente a se- qüŒncia de bases no molde de DNA original (Fig. 12.12). Uma vez que a seqüŒncia de ba- ses daquele fragmento Ø determinado, primers de fragmentos coincidentes sªo deduzidos e sin- tetizados baseando-se nesta seqüŒncia, e assim utilizados para seqüenciar porçıes contínuas desconhecidas. MÉTODOS DE AN`LISE DO `CIDO NUCLÉICO TØcnica de Southern Blot Esta tØcnica foi desenvolvida por Edward Southern, cujo nome serviu de referŒncia tanto a Fig. 12.12 Seqüenciamento de DNA pelo mØtodo do didesoxinucleosídeo trifosfato de Sanger. este procedimento, quanto a outros derivados, por analogia ao nome, como northern e western blot. O mØtodo permite identificar fragmentos de res- triçªo de DNA específicos numa mistura com- plexa de fragmentos de restriçªo. O DNA de um organismo Ø digerido com uma enzima de restri- çªo e os fragmentos resultantes sªo separados por tamanho numa eletroforese em gel de agarose. O BaseBase CH2 O O O O O O O CH2 –O P P P–O –O O– O O O O O O –O P P P–O –O H H H H H H H H H OH HH O O Deoxinucleosídeo Trifosfato (dNTP) Dideoxinucleosídeo Trifosfato (ddNTP) DNA de interesse 5’ 3’ 35S 5’ “Primer universal” Mistura de reação DNA polimerase +ddGTP +dATP +dCTP +dTTP Fita molde 5’ 3’ C C C C 35S 5’ 35S 5’ 35S 5’ 35S 5’ G G G G Síntese de DNA (a) Bacteriófago M13 recombinante TUBO 1 ddG TUBO 2 ddC TUBO 3 ddA TUBO 4 ddT Topo Fundo Auto-radiografia do gel Seqüência Eletroforese em gel de poliacrilamida (b) Eletroforese em gel de poliacrilamida da mistura de reação C A G G T C T T G A C A C C G 159 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 DNA Ø desnaturado no gel em Ælcali, e transferi- do a uma membrana de nitrocelulose ou nÆilon por capilaridade (Fig. 12.13). Este procedimento preserva a distribuiçªo dos fragmentos no gel, criando uma rØplica do gel no filtro; esses frag- mentos de DNA sªo fixados na membrana por reaçªo cruzada em UV, ou ainda desnaturados sob calor. O filtro Ø incubado com uma soluçªo de hibridizaçªo, em condiçıes especiais, na pre- sença de sondas nucleotídicas radioativas, nor- malmente obtidas de fragmentos previamente clonados. Os fragmentos de DNA complementa- res à sonda hibridizam, e sªo co-localizadosno filtro atravØs de auto-radiografia. TØcnica de Northern Blot Esta tØcnica emprega o mesmo princípio de southern blot para separaçªo de RNA.Uma amos- Fig. 12.13 Aparato de transferŒncia de fragmentos de DNA por capilaridade. Fig. 12.14 Ciclo bÆsico do PCR. tra de RNA total ou de RNA mensageiro Ø des- naturado por tratamento com agentes como o formaldeído, que asseguram o RNA na forma linear, evitando formaçªo de pontes de hidrogŒ- nio entre as bases. Estes RNAs sªo tambØm se- parados em eletroforese em gel de agarose, transferidos a membrana de nitrocelulose ou nÆilon, e desnaturados ou fixados à membrana por UV. O filtro Ø exposto a sonda nucleotídica radioativa de DNA e bandas visualizadas por auto-radiografia. A intensidade das bandas ob- tidas sªo proporcionais à quantidade de RNA presente na mistura. Reaçªo em Cadeia da Polimerase (PCR) A tØcnica da reaçªo em cadeia da polimera- se (Polymerase Chain Reaction PCR) foi con- cebida por Kary Mullis e colaboradores em 1984, e desenvolvida na Cetus Corporation. A tØcnica Ø conceitualmente muito simples e mimetiza o processo natural de replicaçªo do DNA in vivo. Numa simples reaçªo, permite a amplificaçªo es- pecífica de segmentos de DNA raros ou em pe- quenas quantidades numa mistura de DNA, representando, assim, uma alternativa à clona- gem gŒnica. À mistura da reaçªo sªo adiciona- dos os seguintes componentes à seqüŒncia-alvo: 1) um par de primers flanqueando a seqüŒncia a ser amplificada, 2) todos os quatro desoxirribo- nucleotídeos trifosfatos (dNTPs), e 3) uma DNA polimerase termoestÆvel. O mØtodo baseia-se na repetiçªo de trŒs eta- pas (Fig. 12.14), todas conduzidas sucessiva- mente sob condiçıes controladas de diferentes temperaturas, mantidas em aparelhos específi- cos para esse fim: Papel Whatman Tampão Suporte Pilha de papel Membrana de nitrocelulose Gel 160 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 12 Fig. 12.15 Estrutura da molØcula de insulina. Etapa 1: a primeira etapa da reaçªo envolve a desnaturacªo do DNA a 94”C por 1 minuto. Esta temperatura permite a separaçªo das fitas duplas de DNA, tornando-as simples fita, pre- parando assim o DNA para a etapa seguinte de anelamento dos primers. Etapa 2: a segunda etapa do ciclo envolve o anelamento dos primers no terminal 3 do mol- de de DNA simples fita . Para isso a temperatura Ø diminuída para 50”C por 1 a 1.5 minutos. Etapa 3: a etapa de polimerizaçªo envolve a utilizaçªo da Taq polimerase que funciona efici- entemente entre 72-74”C (2 minutos), adicio- nando bases nucleotídicas complementares ao molde de DNA utilizado, iniciando a reaçªo a partir dos primers iniciadores. Assim, ciclos repetidos de desnaturaçªo, ane- lamento dos primers e polimerizaçªo amplificam rapidamente a seqüŒncia de interesse. A cada ci- clo o nœmero de cópias da seqüŒncia entre os sítios dos primers Ø dobrada; portanto, a seqüŒn- cia desejada aumenta exponecialmente. A tØcnica de PCR Ø tªo eficiente em amplifi- car seqüŒncias específicas, que DNA isolado de uma œnica cØlula humana pode ser analisada para mutaçıes associadas com vÆrias doenças genØ- ticas. Este procedimento permite a recuperaçªo e rÆpida amplificaçªo de seqüŒncias inteiras en- Tabela 12.3 Proteínas Humanas de Valor TerapŒutico e que sªo Comercialmente Produzidas pela Engenharia GenØtica Proteínas Valor TerapŒutico Fator VIII da Tratamento de hemofilia A coagulaçªo Insulina humana Tratamento de diabetes Interferon Agente anticâncer Tratamento de hepatite B Interleucina-2 Supressªo de doenças auto-imunes Aumento de sobrevida de transplantes cardíacos Eritropoietina Tratamento de anemia Hormônio do Tratamento de crescimento deficiŒncias do hormônio Ativador do Tratamento de trombose plasminogŒnio coronariana tecidual tre quaisquer dois terminais cujas seqüŒncias se- jam conhecidas; a seqüŒncia amplificada pode ser entªo ligadas a vetores de clonagem. Fragmentos de ~2kb ou menos podem ser amplificados efi- cientemente; no entanto, com o desenvolvimen- to de outras polimerases mais eficientes, este limite foi estendido. APLICA˙ÕES DA CLONAGEM G˚NICA A aplicaçªo mais bem-sucedida da clonagem gŒnica tem sido o desenvolvimento de proteínas animais em microorganismos transformados que sintetizam versıes recombinantes. Muitas pro- teínas de valor farmacŒutico sªo sintetizadas por animais em pequenas quantidades e sua purifi- caçªo Ø difícil e cara. A clonagem gŒnica oferece a possibilidade mais barata e reproduzível de pro- duzir estas proteínas atravØs do crescimento em larga escala de bactØrias recombinantes. Uma das primeiras proteínas humanas a se- rem clonadas foi a insulina em 1978. Quando o hormônio insulina nªo Ø sinteti- zado em quantidades suficientes pelas cØlulas beta das ilhotas de Langerhans no pâncreas, re- 161 DNA RECOMBINANTE Cap. 12 sulta em diabetes melito. A insulina controla os níveis de glicose no sangue, e sua deficiŒncia se manifesta como um complexo de sintomas, que pode levar à morte se nªo tratado. Felizmente, muitas formas de diabetes po- dem ser aliviadas por um programa contínuo de injeçıes de insulina, assim suplementando a quantidade limitada do hormônio sintetizado pelo pâncreas. A insulina utilizada no tratamen- to da diabetes tem sido obtida tradicionalmente de pâncreas bovino e suíno. Apesar de ela ser satisfatória, problemas podem surgir no uso con- tínuo. Um deles Ø que a pequena diferença entre a proteína humana e animal pode levar a efeitos colaterais desagradÆveis em alguns pacientes. Um segundo problema Ø que os procedimentos de pu- rificaçªo sªo difíceis e contaminantes, potencial- mente perigosos e nªo podem ser completamente removidos. O mØtodo mais satisfatório seria usar insulina humana para tratamento de diabetes, o que Ø obviamente impossível. Duas características da insulina humana fa- cilitaram sua produçªo recombinante em E. coli. Primeiramente, após a traduçªo ela nªo Ø modi- ficada pela adiçªo de açœcares, portanto, uma insulina recombinante sintetizada por bactØrias seria supostamente ativa. A outra vantagem Ø quanto ao tamanho da molØcula. A insulina Ø composta por dois polipeptídeos, um de 21 ami- noÆcidos (cadeia A) e outro de 30 aminoÆcidos (cadeia B). Em humanos, elas sªo sintetizadas como um precursor chamado preproinsulina, que contØm os segmentos A e B ligados por uma ter- ceira cadeia C, que Ø precedida por uma seqüŒn- cia líder. A seqüŒncia líder Ø removida após traduçªo e a cadeia C excisada, deixando os po- lipeptídeos A e B ligados um ao outro por pon- tes dissulfeto (Fig. 12.15). Dois plasmídeos recombinantes foram cons- truídos, um carregando o gene para a cadeia A e outro o gene para cadeia B. Em ambos os casos os genes foram inseridos ao lado e in frame do lac Z no vetor tipo pBR 322. Os genes da insu- lina estªo sob o controle do promotor forte lac, e sªo expressos como uma proteína fundida, consistindo em poucos aminoÆcidos de b -galac- tosidase seguido dos polipeptídeos A ou B. Os genes foram construídos de tal maneira que os segmentos de b -galactosidase e insulina estariam separados por um œnico resíduo de metionina, presente em ambas proteínas fundidas. Os poli- peptídeos poderiam assim, ser clivados do seg- mento de b -galactosidase por tratamento com brometo de cianogŒnio, que quebra proteínas nos resíduos de metioninas. As cadeias A e B purifi- cadas sªo fundidas uma a outra por formaçªo de pontes dissulfeto em tubo de ensaio. Na rea- lidade, na prÆtica esta œltima etapa mostrou-se ineficiente. Um aperfeiçoamento subseqüente foi sinte- tizar toda a proinsulina, com as cadeias A, B e C. Embora esta seja uma proposiçªo mais desa- fiadora, o pro-hormônio tem a vantagem de do- brar espontaneamente na posiçªo correta, que facilita a formaçªo de pontesdissulfeto. O seg- mento da cadeia C pode agora ser removido fa- cilmente por uma clivagem proteolítica. Existem proteínas para as quais os benefíci- os da clonagem gŒnica sªo óbvios. Entre elas incluem-se os interferons, que estªo presentes no corpo em quantidade tªo pequena, uma vez que sªo sintetizados em resposta a ataques vi- rais, e sua purificaçªo Ø quase impossível pelos meios convencionais. A clonagem gŒnica ofere- ceu o œnico meio viÆvel de obter grande quanti- dade dessas proteínas. Mais importante ainda, a clonagem gŒnica pôde fornecer preparaçıes ultrapuras das pro- teínas com problemas de contaminaçªo. Fator VIII, uma proteína da cascata da coagulaçªo do sangue, encontra-se deficiente na forma mais predominante de hemofilia, e era obtida de doa- dores de sangue humano. Sua purificaçªo en- volvia dificuldades em remover partículas virais, que podem estar presentes no sangue. Hepatite e HIV poderiam ser passados a hemofílicos via injeçıes de fator VIII. A obtençªo do fator VIII recombinante, livre de contaminaçıes, bem como outras proteínas listadas na Tabela 12.3, repre- senta hoje uma realizaçªo significante para a tec- nologia da clonagem gŒnica. BIBLIOGRAFIA 1. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Robrets K, Watson JD. Molecular Biology of the Cell. 2nd ed. New York: Garland Publishing, 1989. 2. Brown TA. Gene Cloning, an introduction. 2nd ed. England: Van Reinhold Co. Ltd, 1987. 3. Devlin TM. Textbook of Biochemistry with clinical correlations. 4th ed. New York: Wiley-Liss, Inc., 1997. 4. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 5. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA. 2nd ed. New York: W.H. Freeman and Co., 1992.
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