Cromatografia Liquida

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE 
ALTA EFICIÊNCIA 
 
Prof. Dr. José Eduardo Gonçalves 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA -(CLAE) 
 
 É uma técnica cromatográfica que utiliza como FM um 
líquido e equipamentos sofisticados para separar os 
componentes de uma amostra pela interação com a FE e a 
FM. 
 
Utiliza-se colunas metálicas e FM pressurizada, obtida 
com auxílio de bombas de alta pressão, para permitir uma 
vazão mais rápida da FM. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA -(CLAE) 
 
É também conhecida como HPLC, ou de Alta Velocidade, 
ou de Alta Pressão ou de Alto Desempenho ou, ainda, de 
Alta Performance. Do Inglês HPLC – High Performance 
Liquid Chromatography. 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - 
CLAE (HPLC) 
Equipamento Básico 
EQUIPAMENTO COMERCIAL 
CROMATOGRAFIA LIQUIDA 
 
Esquema de um equipamento completo para CLAE 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
 
 
 Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? 
 
 Qualquer substancia que puder ser dissolvida 
(solúvel) no líquido ela poderá ser “carreada” pelo 
mesmo. 
 
 Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com 
massa molar de 32 ate 4.000.000. 
 
FORMA GERAL: 
 CL é aplicável para separação e análise de misturas 
cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há 
limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Aplicações 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Partes do Equipamento 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Fase Móvel - Solventes 
DEVE TER ALTO GRAU DE PUREZA. 
 As impurezas da fase móvel podem absorver e 
diminuir a sensibilidade do detector. 
 
DISSOLVER A AMOSTRA SEM DECOMPOR SEUS 
COMPONENTES. 
 O solvente da amostra, normalmente, é a própria FM 
ou um dos seus componentes. 
 
TER POLARIDADE E VISCOSIDADE ADEQUADAS. 
 
NÃO DEGRADAR A FASE ESTACIONÁRIA. 
 Não utilizar fases móveis agressivas. 
 
SER COMPATÍVEL COM O DETECTOR UTILIZADO. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Fase Móvel - Água 
ÁGUA MONO-DESTILADA E DEIONIZADA COMUM SÃO 
INADEQUADAS. 
 Contaminação de orgânicos voláteis e de orgânicos 
da resina 
 
ÁGUA DEVE SER GRAU HPLC . 
 Purificada com resinas de troca iônica, carvão 
ativado, filtros de membrana (livre de bactérias). Produzida 
no momento de uso pois é facilmente recontaminável. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Fase Móvel 
Filtração da Fase Móvel 
 Essencial. 
 
Degaseificação da Fase Móvel 
 Indispensável para o bom funcionamento do sistema. 
 Garante: 
 Reprodutibilidade da vazão: retira ar 
dissolvido na FM e evita bolhas na bomba; 
 Estabilidade na linha de base: bolhas no detector 
causam instabilidade da linha de base; 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Partes do Equipamento 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Bombas de Alta Pressão 
 Têm por finalidade enviar um fluxo constante e 
reprodutível de FM para o sistema cromatográfico. 
 
Requisitos: 
1. Ser de material inerte; 
2. Devem gerar altas pressões: 0,01 a 35 MPa (para 
análises). 
3. Versatilidade: permitir eluição por gradiente 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Eluição 
 Solvente puros ou misturas de solventes de acordo 
com a polaridade requerida na separação. 
 
Eluição isocrática: 
• Quando a separação feita utilizando um único solvente de 
composição constante. 
 
 
Eluição com gradiente: 
• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que 
diferem bastante entre si em polaridade. 
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes 
é variada de modo programado, de forma contínua ou em 
passos. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Partes do Equipamento 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Injetores Manuais 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Sobrecarga de Volume da Amostra 
 Para aproveitar de todos o pratos que uma 
coluna possui, não se deve injetar um volume 
maior que 1 % do volume da coluna vazia. 
 
Vmáximo (μL) =  (raio)
2(comprimento)(0,01) 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Partes do Equipamento 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Colunas 
•Remoção de material particulado 
•Contaminantes do solvente 
•Contaminantes da amostra 
•Saturar a FM com a FE 
Pre-coluna 
Aumenta a vida útil da coluna 
COLUNAS TÍPICAS 
•Material: aço inox 
•Comprimento: 10 a 30 cm 
•Diâmetro: 4 a 10 mm 
•FE: Partículas de 5 a 10 μm 
•Eficiência: 5 mil a 25 mil 
pratos/coluna 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Colunas 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Condicionamento da Coluna 
 Necessário para que haja um perfeito equilíbrio da 
FM e da FE. 
 
 
 Coluna nova: 4 – 8 horas. 
 Coluna parada há alguns dias: 2 horas. 
 Coluna de uso diário: 15 minutos. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Fase Estacionária 
Basicamente são dois tipos de FE: 
Pelicular: 
 Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, 
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 μm, 
recoberto com uma camada fina e porosa de: 
 • Sílica 
 • Alumina 
 • Resina de poliestireno-divinil-benzeno 
 • Resina trocadora de íons 
 
Partícula porosa: 
 Consiste de micro-partículas porosas com diâmetros 
de 3 a 10 μm. As partículas são constituídas dos mesmos 
materiais do recobrimento pelicular. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Cromatografia Líquida com Fase Ligada 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Fases Estacionárias Quimicamente Ligadas 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Reação Siloxano 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Fases Móveis 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
HPLC – Fase Reversa 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Partes do Equipamento 
 Dispositivos que examinam continuamente o 
material eluído, gerando sinal quando da passagem de 
substâncias. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Detectores 
Ideal: 
cada substância 
separada aparece 
como um PICO no 
cromatograma. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Detectores 
Absorção: 
 Fotométrico: λ fixo. 
 Espectrofotométrico: λ variável. 
 Espectrofotométrico por arranjo de diodos. 
 
Índice de Refração 
Fluorescência 
Espalhamento de Luz 
Espectrometria de Massas 
Dicroísmo Circular 
Eletroquímico 
 
 70 % de análises publicadas utilizam CLAE com 
detectores UV/Vis 
 Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como 
um gás ideal e não contribui para o processo de 
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a 
FE com os componentes da amostra. 
 
 
 Isto torna o desenvolvimento dos métodos em 
CLAE um tanto mais complexo que na CG. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Vantagens 
FE é utilizada várias vezes. 
Versatilidade: único requisito é a solubilidade da 
amostra na FM. 
Tempo reduzido de análise. 
 Alta resolução. 
 Boa para análise qualitativa: 
 Parâmetros para identificação: tR, espectro de 
absorção no UV (detector de arranjo de diodos), espectro 
de massas 
 Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%. 
 Boa detectabilidade: 
 Absorção UV-Vis de  variável: 10-10 g; 
 Fluorescência: 10-12 g. 
 Automação. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Desvantagens 
Alto custo do equipamento. 
Alto custo de manutenção do equipamento. 
Não existe um detector universal com boa 
detectabilidade e baixo custo: 
 Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), 
pouco estável. 
 Espectrômetro de massas: ~ US$ 150.000 
Experiência do operador. 
• Lavar um sistema com tampão usando orgânico puro: precipitação. 
• Injetar amostras que podem precipitar na fase móvel: testar 
miscibilidade. 
• Usar HCl, H2SO4 ou CCl3 degradado emsistema de aço inox: 
corrosão do sistema. 
• Deixar a bomba trabalhar seca: danificação dos selos. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Dicas do que não fazer em CLAE! 
• Usar fita de Teflon para vedar conexões: sem efeito e pode causar 
entupimento. 
• Deixar o sistema parado com fase móvel contendo tampão ou 
ácidos/bases fortes: cristalização = danificação dos selos da bomba, 
injetor, entupimento do detector. 
• PERDER A PACIÊNCIA!!!! 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Dicas do que não fazer em CLAE! 
1 - CAROL H. COLLINS, GILBERTO L. BRAGA, PIERINA S. 
BONATO (coordenadores), Fundamentos de 
Cromatografia, Editora da Unicamp, Campinas, 2006. 
 
2 - L.R. SNYDER, J. J. KIRKLAND, J. L. GLAJCH, Practical 
HPLC Method Development, 2º ed., John Wiley & Sons, 
1997. 
 
3 - V.R. MEYER, Practical High-Performance Liquid 
Chromatography, 4o ed., John Wiley & Sons, 2004. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Referências Bibliográficas 
4 - D. A. SKOOG, F. J. HOLLER, T. A. NIEMAN, Princípios 
de Análise Instrumental, 5° ed., Bookman, 2002. 
 
5 - F.R. de AQUINO NETO, D.S.S. NUNES, Cromatografia 
Princípios Básicos e Técnicas Afins, Interciência, Rio de 
Janeiro, RJ, 2003. 
 
6 - D. C. HARRIS. Análise Química Quantitativa, LTC, Rio 
de Janeiro, 2005. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA – CLAE 
Referências Bibliográficas