Tecnologia do DNA recombinante

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Tecnologia do DNA recombinante
Conjunto de técnicas que permite identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. 
Tecnologia do DNA recombinante ou
Engenharia Genética
Watson e Crick (1953): estrutura do DNA, 
 replicação semi-conservativa
Arber (1962): replicação de bacteriófagos dependia da bactéria infectada 
Bactérias que permitiam a replicação do vírus
Bactérias que NÃO permitiam a replicação do vírus
Nucleases que degradam DNA estranho
Enzimas de Restrição
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Nathans & Smith (1975): purificação das endonucleases 
 de restrição.
São proteínas que atuam como tesouras químicas cortando DNA em seqüências específicas.
Seqüência palíndrômicas constituídas de 4 a 8 pb
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Tipos de extremidades formadas após digestão
Extremidades cegas
Extremidades coesivas
Nomenclatura: abreviação do nome do qual a enzima foi isolada
- 1ª letra: maiúscula representa o gênero
 duas outras letras representam a espécie
 outras letras indicam linhagem bacteriana
algarismos romanos indicam a ordem da descoberta 
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Exemplos de enzimas de restrição
Microorganismo
Enzima
Sítio de 
reconhecimento
Tipo de 
Terminação 
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Eletroforese em gel: permite a migração das moléculas de 
 acordo com seu tamanho e sua carga
 elétrica.
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Eletroforese em gel
8
Eletroforese em gel
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Em 1973: possibilidade de recombinação de moléculas de 
 DNA de diferentes organismo.
Enzimas de
 restrição
Ligase
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Bibliotecas Moleculares: conjunto de todos os genes de uma 
 determinada espécie armazenados 
 na forma de moléculas de DNA 
 recombinante.
Biblioteca genômicas
Biblioteca cDNA
Estudar a estrutra dos genes
(introns e éxons)
Expressão dos genes
Biblioteca genômicas: conjunto de clones obtidos do
 DNA genômico de um organismo
Estudos genômicos
Biblioteca cDNA: coleção de cDNAs obtidos da clonagem de regiões que são 
expressas no genoma
(RNAm).
Extração de 
RNA total
Purificação 
do RNAm
Síntese do cDNA 
Degradação do RNA 
Síntese da dupla fita de DNA 
pela DNA polimerase 
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PCR 
( Reação em cadeia da polimerase)
Amplificação de seqüências específicas de DNA
Criada em 1980 por Kary Mullis (Prêmio Nobel em Química)
Detecção da presença de bactérias, vírus e protozoários
Medicina Genômica (Medicina Preditiva/Doenças Genéticas) 
Diagnóstico Pré-Natal 
 Determinação de Paternidade pelo DNA 
 DNA forense 
Ampla utilização
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Baseada no mecanismo de replicação do DNA
 Fita de DNA (molde)
nucleotídeos
 DNA polimerase ( Taq DNA polimerase)
 primers ( iniciadores)
 Termociclador ( permite rápidas variações de temperatura)
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PCR 
1ª etapa: desnaturação
(temperatura a 95ºC)
2ª etapa: anelamento
(temperatura a 55ºC)
3ª etapa: elongação
(temperatura a 72ºC)
 25 a 30 ciclos
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Teste de paternidade
PM M F P1 P2
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Análise forense
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Biblioteca genômica
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Biblioteca genômica
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Teste de paternidade