20211028_102532_Aula2-ExtraçãoacnucleicoseEletroforese

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Extração de Ácidos nucléicos 
Eletroforese 
Disciplina: Diagnóstico Molecular
6° período - Farmácia
Professora: Patrícia de Almeida Machado
Quais amostras podem ser utilizadas para a realização da PCR? 
O que pesquisar/diagnosticar através da PCR??
DNA ou RNA
Extração de Ácidos Nucléicos (DNA ou RNA)
Antes da realização de qualquer etapa utilizando ácidos nucléicos, é necessário que ocorra a extração dos mesmos a partir das amostras em que haja suspeita de infecção por algum patógeno,
Para que técnicas de biologia molecular, como a PCR, sejam eficazes, é fundamental que ocorra previamente uma extração de qualidade,
Independente do protocolo utilizado, todos devem conter as seguintes etapas: lise celular, desproteinização e concentração do ácido nucléico.
1) Lise celular
Extração de Ácidos Nucléicos
Tem o objetivo de se obter todo o seu conteúdo presente dentro da célula, 
Diferentes detergentes (SDS - dodecil sulfato de sódio ou CTAB - brometo de cetiltrimetilamônio) são utilizados para solubilizarem os lipídeos presentes nas membranas plasmáticas, 
O uso de agentes quelantes de cátions divalentes (principalmente Ca+2 e Mg+2), como o EDTA, é necessário para inibir a ação de DNases (enzimas que degradam DNA) e RNases (enzimas que degradam RNA) que utilizam esses cátions como cofatores.
2) Desproteinização
Extração de Ácidos Nucléicos
Processo para a separação dos ácidos nucléicos a partir das proteínas, lipídeos e restos celulares, 
É realizada pela adição de solventes orgânicos, seguida de centrifugação onde haverá a distinção entre a fase orgânica e a fase aquosa,
Os solventes mais comuns são: Trizol® (fenol acrescido de guanidina), fenol e clorofórmio, 
Os solventes promovem a desnaturação das proteínas que ficam reservadas na fase orgânica, enquanto o DNA e o RNA permanecem na fase aquosa.
DNA e RNA 
Geralmente feito através da adição de álcool seguido de centrifugação, 
O sobrenadante é descartado e o precipitado deverá ser seco e, posteriormente, ressuspenso em tampão adequado livre de DNAse ou RNAse para que não haja degradação do material extraído.
3) Concentração do ácido nucléico
Extração de Ácidos Nucléicos
OBS: Ao se trabalhar com RNA, muitos cuidados devem ser tomados para que não haja a degradação do mesmo. As mãos, a pele, os cabelos, superfícies de laboratório e até mesmo a respiração, são fontes de RNAses exógenas. Dessa forma, é necessário utilizar utensílios especificamente determinados para o trabalho com RNA, além de uma higienização adequada do local de trabalho onde ocorrerá a extração. 
Após a extração do material genético (DNA ou RNA) e amplificação do mesmo através da PCR, como fazer a leitura dos produtos da PCR?
Eletroforese
Técnica simples e rápida usada para a separação, visualização, detecção e purificação de fragmentos de RNA, DNA, proteínas e enzimas, 
Consiste na migração desses produtos em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico (migração em virtude de sua massa e carga),
As amostras de DNA ou RNA são aplicadas em um gel de agarose ou de poliacrilamida e submetidas a um campo elétrico,
Ao final do processo, as cadeias de DNA e RNA estarão próximas ao polo positivo, pois tem carga negativa,
Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma distância maior ficando mais próximas do polo positivo.
Eletroforese
Preparo do gel de agarose
Pesagem da agarose
Adição da agarose em balão volumétrico contendo 100 mL de TBE 1X (Tris borato EDTA) e homogeneizar
Microondas por 5 min.
Solução translúcida e sem bolhas
Despejar em cubas-molde
Colocar o pentes que servirão como molde para produzir as cavidades (poços) no gel
Eletroforese
Eletroforese
Eletroforese - Revelação
Gel de agarose: coloração com brometo de etídeo  se intercala entre as bases nitrogenadas dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta (260-360nm), fluoresce na faixa do vermelho (590nm); tb pode revelar com GelRed® (é também um composto de etídeo, mas com toxicidade menor do que o brometo de etídeo e também cora melhor),
A intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. 
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Gel de Poliacrilamida:
 O gel deve ser imerso na solução e deve-se agitar.
10 minutos numa solução de ácido acético  fixar,
3 minutos em água destilada,
10 minutos numa solução de nitrato de prata (este composto escurece quando oxidado pelo revelador),
30 segundos por 2 vezes em água destilada,
revelador (solução de carbonato de sódio com tiosulfato de sódio), até aparecerem as bandas do DNA.
Eletroforese - Revelação
 A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular.