preservação de microrganismos

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Técnicas de Preservação de Microrganismos
Lara Durães Sette
CBMAI-CPQBA/UNICAMP
lara@cpqba.unicamp.br
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Importância da preservação
armazenamento de culturas por longos períodos e utilização periódica para pesquisa e/ou produção
contaminação
perda de viabilidade
mutação (perda das características fisiológicas)
solução → metodologia de preservação de longa duração
diminuição do crescimento e das atividades metabólicas
crescimento em meio mínimo
resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura
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Importância da preservação
preservação a longo prazo 
evita problemas com o novo isolamento de microrganismos
economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo
importante função da coleção de culturas
pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação por períodos prolongados
garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza
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Escolha do método de preservação
pontos a serem considerados
manutenção da viabilidade: perda de células no processo de preservação e durante o armazenamento
manutenção das propriedades originais: perda de características de interesse científico ou industrial
pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo
custos de preservação e manutenção
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Escolha do método de preservação
tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento 
importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método
necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte
disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros
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Métodos de preservação
curto prazo
repique contínuo
médio prazo
preservação em óleo mineral
preservação em água
congelamento a -20°C
secagem em sílica, solo e papel de filtro
longo-termo
liofilização
congelamento a -80°C
criopreservação em nitrogênio líquido
Divisão de Recursos Microbianos - não existe um método universal para a preservação adequada a todos os microrganismos
variação de resposta aos diferentes métodos
balanço de vantagens e desvantagens	
Divisão de Recursos Microbianos - método escolhido deverá 
manter o maior número de células viáveis possível
evitar chances de contaminação
estar dentro do orçamento
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Repique contínuo
princípio
diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura)
fatores a serem considerados
meio adequado para manter a cultura
temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses
freqüência entre as transferências: determinação empírica
minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes
examinar a pureza em cada transferência
conservar em duplicata
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Repique contínuo
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Repique contínuo
vantagens
baixo custo
não requer equipamentos especializados
o manuseio é simples
desvantagens
riscos de contaminação e possível perda da linhagem
perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade
seleção de células atípicas (variantes ou mutantes)
supervisão especializada
mão-de-obra
espaço relativamente grande para a armazenamento
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Preservação em óleo mineral e em água
princípio
diminuição da atividade metabólica 
fatores a serem considerado (Castellani)
espessura do ágar
número de blocos na água
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Preservação em óleo mineral
Preservação em óleo
armazenamento em geladeira
vantagens
 ↓ custo de equipamento
 evita contaminação por ácaros
desvantagens
 necessidade de mais transferências
 até que a cultura revigore
 requer espaço para amazenamento
	
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Preservação em água (Castellani)
Blocos de ágar de 4-6 mm3
10-15 mL água destilada esterilizada
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Preservação em água
vantagens
 boa taxa de viabilidade
 evita contaminação por ácaros
desvantagens
 limitado a organismos que
 aderem ao ágar (Castellani)
 dificuldade da retirada dos cubos
 na reativação (Castellani)
 crescimento durante a estocagem
 requer espaço p/ amazenamento
 riscos de contaminação
	
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Secagem
princípio
diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira
fatores a serem considerados
tipo de célula
idade da cultura
concentração celular
condições de estocagem
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Secagem em sílica e em solo
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Secagem em papel de filtro
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Secagem
vantagens
simples e de baixo custo
não requer equipamento especial
estabilidade elevada
ácaros não sobrevivem
desavantagens
métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados
risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo
papel: poucos dados sobre o sucesso do método
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Liofilização
princípio
remoção da água por sublimação
fatores a serem considerados
tipo de células
idade da cultura
concentração celular
agentes crioprotetor
condições de estocagem
método de reidratação
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Liofilização
agentes crioprotetores
reduzem danos durante o congelamento e descongelamento
estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem
leite desnatado (skim milk) 10%
leite desnatado 10% + inositol 5%
sacarose 7% + peptona 7%
inositol 5% em soro de sangue de cavalo
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Liofilização
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Liofilização - reativação
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Liofilização
vantagens
vedação total da amostra
longa viabilidade
estabilidade elevada em muitas espécies
produção em larga escala
não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz)
fácil distribuição e transporte
desvantagens
muitas espécies não sobrevivem ao processo
viabilidade ocasionalmente insatisfatória
mão-de-obra especializada
requer equipamentos sofisticado
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Congelamento em ultrafreezer
princípio
indução da dormência do microrganismo
armazenamento a - 80˚C
fatores a serem considerados
tipo de microrganismo
idade da cultura
concentração celular
agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração maior)
condições de estocagem
método de descongelamento
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Congelamento
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Congelamento em ultrafreezer
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Congelamento em nitrogênio líquido
princípio 
indução da dormência do microrganismo
armazenamento a - 196˚C
fatores a serem considerados
tipo de microrganismo
idade da cultura
concentração celular
agente crioprotetor
condições de estocagem
método de descongelamento
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Congelamento em nitrogênio líquido
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Congelamento em nitrogênio líquido
vantagens
condições estáveis por longos períodos
vedação completa, evitando contaminação
utilização para esporulados e não esporulados
desvantagens
viabilidade ocasionalmente insatisfatória
requer equipamento sofisticado
suprimento contínuo de N2
boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento
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Controle de qualidade de preservação
contagem de população viável antes e após preservação
determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no protocolo utilizado
aplicável a métodos de médio e longo-termo
imprescindível para garantia de preservação
de longo-termo
pureza
logo após o processamento do lote
	
viabilidade
primeira pós: até um mês após o processamento
segunda pós em diante: anualmente
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Controle de qualidade de preservação
 
	 Suspensão de células em crioprotetor
no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL