Microbiologia Clínica - Métodos Utilizados na Preservação de Microrganismos

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Métodos Utilizados na Preservação de Microrganismos – Aspectos Teóricos
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MÉTODOS UTILIZADOS NA PRESERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS – 
ASPECTOS TEÓRICOS
MICROBIOLOGIA CLÍNICA
Procedimentos Laboratoriais: da requisição do exame à análise microbiológica
Requisição do exame: pedido médico propriamente dito. 
Manutenção e Estoque de Culturas
Uma vez obtida uma cultura satisfatória, ela deve ser mantida pura e viável.
• Transferir periodicamente a cultura em um meio de cultura adequado.
• Incubar até que a cultura atinja a fase máxima de crescimento.
• Estocar em temperatura apropriada para impedir maior crescimento.
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A cultura é preparada usualmente a partir de uma cultura anterior ou originalmente 
do estoque.
Ao cultivar a cultura desejada, procura-se obter uma cultura que contenha somente o 
microrganismo desejado, um número uniforme da população, que seja viável e que 
apresente resistência a condições desfavoráveis.
O sucesso no preparo da cultura está também relacionado com o preparo e esteriliza-
ção do meio de cultura, da inoculação e do tempo e temperatura (ótimas para aquela 
espécie) de incubação. 
Pureza das culturas
• Exame microscópico: a contaminação é indicada por morfotintorialidades diferentes.
• Semeadura em meio nutritivo: permite o crescimento de contaminantes.
• Testes bioquímicos: provas para presença de substâncias produzidas por con-
taminantes.
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Viabilidade das culturas
Taxa de crescimento e atividade metabólica.
Deterioração das culturas pode resultar:
• Manuseio incorreto;
• Cultivo inadequado;
• Transferências frequentes;
• Meio de cultura impróprio;
• Mutação/ataque da bactéria por bacteriófago.
FATORES QUE AFETAM A CONSERVAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
A conservação de microrganismos depende da manipulação de fatores ambientais de 
forma a retardar o crescimento.
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Método de cultivo
• Temperatura: influencia a eficiência do método. Baixas temperaturas retardam as rea-
ções químicas, a ação das enzimas, e atrasam ou inibem o crescimento dos microrga-
nismos. Quanto mais baixa a temperatura mais lenta serão as reações químicas, as 
ações enzimáticas e o crescimento microbiano.
• Composição do meio: afeta a resistência da célula.
 – Meio pobre: recomenda-se para evitar o crescimento acelerado e geração de mutan-
tes indesejáveis. É um sinal para o metabolismo da célula reorganizar a estocagem 
de energia.
 – Meio rico: recomenda-se devido à percentagem de células viáveis ser maior em rela-
ção ao meio pobre.
• pH: afeta a resistência da célula. Há um pH ótimo para toda cultura e o crescimento da 
célula pode ser inibido se este fator não for adequado. 
Idade da cultura
Afeta a viabilidade de recuperação pós-estocagem.
Fase ideal: início da fase estacionária de crescimento (microrganismos são mais resis-
tentes ao congelamento ou desidratação no fim do crescimento logarítmico ou no início da 
fase estacionária).
Condição fisiológica
• Culturas produtoras de esporos possuem melhores resultados de viabilidade em todos 
os métodos de conservação.
• Procariotos são mais resistentes que os eucariotos.
• Gram-positivas mais resistentes que Gram-negativas.
Concentração da cultura até o momento da conservação
• Concentração inicial de 108–1.010 células/ml.
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MANUTENÇÃO E ESTOQUE DE CULTURAS
Estoque das culturas
O estoque de culturas deve ser preparado de modo que as culturas sejam armazenadas 
e preservadas por um longo período sem transferência.
Tais culturas tendem a permanecerem estáveis e são utilizadas como fonte de cultura 
caso a cultura ativa seja perdida e/ou deteriorada. 
Métodos:
• Repique contínuo;
• Liofilização (freeze drying);
• Refrigeração em nitrogênio líquido;
• Refrigeração em ultrafreezer;
• Vedação com parafina ou camada de óleo mineral em ágar inclinado.
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ministrado na videoaula. Não recomendamos a substituição do estudo em vídeo pela leitura exclu-
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Métodos Utilizados na Preservação de Microrganismos - Aspectos Teóricos II
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MÉTODOS UTILIZADOS NA PRESERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS - 
ASPECTOS TEÓRICOS II
1. CONSERVAÇÃO A CURTO PRAZO
Repique contínuo:
Transferência de células para uma placa de Petri com meio sólido. Pode ser feito em 
tubos de ensaio com meio inclinado.
Período: de 30 dias, e até alguns anos em alguns casos. Em média leveduras são con-
servadas de 1 a 3 meses e bactérias podem variar de 5 a 12 meses.
Temperatura de armazenamento: 3 a 5ºC (geladeira).
Transferidas periodicamente para meios de preparo recente em intervalos de tempo vari-
áveis, de acordo com o microrganismo.
Repiques frequentes podem levar mutações espontâneas ou contaminações, levando à 
perda do microrganismo.
2. CONSERVAÇÃO A MÉDIO PRAZO
Preservação em óleo mineral:
Aplicação de uma camada de óleo mineral estéril de 1 cm de altura sobre uma cultura 
de microrganismos em estado sólido ou líquido. Previne a desidratação do meio de cultura e 
limita a quantidade de oxigênio disponível para o microrganismo. 
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Os óleos devem ser viscosos e menos densos que a água para que não parem no fundo 
da cultura líquida. Os mais recomendados são a parafina e a vaselina.
Hipobiose (baixa atividade metabólica): ocorre devido a limitação de oxigênio disponível 
pela camada de óleo, causando uma diminuição no crescimento e no metabolismo.
Período: 1 a 7 anos para bactérias e leveduras.
Temperatura de armazenamento: 4 a 20º C (geladeira).
Baixo custo, porém necessidade de vários repiques posteriores, após a drenagem total 
da camada de óleo e espaço para armazenamento.
3. CONSERVAÇÃO A MÉDIO PRAZO
Método de Castellani:
Preservação em água estéril ou em solução salina.
Uma suspensão de células ou um bloco de ágar contendo uma cultura jovem do micror-
ganismo é adicionado a uma solução de água estéril, e conservado a baixas temperaturas 
ou temperatura ambiente.
Hipobiose (baixa atividade metabólica): ocorre devido à falta de fontes nutritivas. 
Período: 1 a 2 anos.
Temperatura de armazenamento: 12 a 24º C (ar refrigerado).
Baixo custo, armazenamento em ambiente, porém existem problemas quanto a contami-
nações por outros microrganismos e a instabilidade genética da população.
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4. CONSERVAÇÃO A MÉDIO PRAZO
Congelamento comum:
Utilização de freezers comuns para congelamento da amostra.
O freezer do tipo “frost-free” (livre de gelo) não deve ser utilizado, pois neles ocorrem flu-
tuações de temperatura que destroem os microrganismos.
Anabiose (inatividade metabólica): atingida pela diminuição do metabolismo e formação 
de estado latente da célula devido à falta de fontes nutritivas.
Período: 1 a 2 anos.
Temperatura de armazenamento: -4 a -20ºC.
Não há necessidade de equipamentos caros nem de preparos da amostra, porém pode 
ocorrer a danificação de algumas células durante o congelamento.
5. CONSERVAÇÃO A MÉDIO PRAZO
Secagem:
Suspensão do microrganismo derramada sobre carregadores com grande superfície e 
capacidade de absorver parte da umidade. Serão secos à temperatura ambiente ou aqueci-
mento de 36-40ºC.
Tipos de carregadores: areia, lama, solo, carvão ativado, grãos de trigo, esferas de 
vidro, grânulos gelatinosos ou sintéticos, papel-filtro, ou na presença de composto hidrofílico 
como a sílica-gel e o peróxido de fósforo. 
Anabiose (inatividade metabólica): atingida pela diminuição do metabolismo por desse-
cação e conservação em geladeira.
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Período: 5 anos.
Temperatura de armazenamento: temperatura ambiente ou em refrigerador.
Simples, baixo custo, não há necessidade de equipamentos caros nem de preparos da 
amostra, porém há dificuldade de perceber contaminações.
6. CONSERVAÇÃO A LONGO PRAZO
Liofilização ou “freeze-drying”:
Estabilização da cultura de modo a não mais permitir atividade biológica ou rea-
ções químicas.
Suspensão bacteriana em um coloide. O material líquido é congelado em ampolas, e 
conectado em bomba a vácuo acoplada a um sistema coletor de vapores da água. A umi-
dade presente é reduzida por sublimação (primeira etapa de dessecação) e por dessorção 
(segunda etapa de dessecação).
Anabiose (inatividade metabólica): atingida pela diminuição do metabolismo e formação 
de estado latente da célula devido à falta de água (removida por sublimação).
Período: 17 a 20 anos.
Temperatura de armazenamento: ambiente ou refrigerador.
Longa viabilidade, porém requer equipamento sofisticado.
7. CONSERVAÇÃO A LONGO PRAZO
Congelamento em ultra freezer:
A cultura deve ser primeiramente cultivada até a metade ou final da fase logarítmica. 
Após, centrifuga-se o meio de cultivo para recuperar as células. 
As células precipitadas são ressuspendidas em solução de criopreservante (como glice-
rol 10% v/v) e estocadas em vials criogênicos ou ampolas. O material é então congelado, 
numa taxa de resfriamento de 1 a 2ºC por minuto.
Anabiose (inatividade metabólica): atingida pela indução de dormência celular
Período: 10 a 20 anos.
Temperatura de armazenamento: -60 a -80ºC.
Conservação a longo prazo
Congelamento em nitrogênio líquido:
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Coleta dos microrganismos das culturas em ágar. Suspensão com crio protetor transfe-
rida para ampolas de vidro esterilizadas e resfriada lentamente até -20ºC em ultra freezer. 
Faz a transferência para congelador de nitrogênio líquido, assim resfriar a amostra rapida-
mente até -196ºC.
Alternativa para microrganismos que não podem ser mantidos liofilizados (preservar a 
capacidade proliferativa e a viabilidade celulares).
Anabiose (inatividade metabólica): atingida pela indução de dormência celular.
Período: 10 a 20 anos.
Temperatura de armazenamento: -19ºC.
Crio-protetores
Os agentes crio-protetores são aditivos usados durante a conservação de microrganis-
mos a baixas temperaturas. Confere estabilidade ao microrganismo e aumenta a taxa de 
sobrevivência das células ao processo de congelamento.
Dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, soro de sangue, soro de albumina, leite desnatado, 
extrato de levedura, sacarose, entre outros. 
A maioria dos criopreservantes é altamente hidrofílica devido à presença de grupos quí-
micos que formam pontes de hidrogênio com a água. Faz com que a membrana das células 
se torne mais plástica. Se ligam à água intracelular prevenindo excessiva desidratação, redu-
zindo a toxicidade de sais, diminuindo o estresse hiper osmótico, e prevenindo a formação 
de grandes cristais de gelo.
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ANÁLISES CLÍNICAS
Estoque das culturas
 
Revitalização dos microrganismos conservados
A restauração das culturas após a conservação depende do método utilizado e do tipo de 
microrganismo.
Realizar testes para determinar qual o método de revitalização da cepa é mais adequado.
Ressuspender a amostra no meio de cultura utilizado no crescimento.
A concentração celular do material preservado dependerá da taxa de sobrevivência das 
células ao processo. Concentração inadequada de células para a recuperação pode gerar 
um crescimento excessivo.
Adição de água destilada em amostras liofilizadas pode resultar em choque osmótico. 
Usar o meio de cultivo ou soluções isotônicas para evitar esse problema. 
Deve-se verificar, após a recuperação da amostra, a pureza da cultura.30m
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MÉTODOS UTILIZADOS NA PRESERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS - 
QUESTÕES
1. (UFSC/2019/UFSC/TÉCNICO DE LABORATÓRIO/BIOLOGIA) Sobre a preservação de 
materiais biológicos a longo prazo, assinale a alternativa correta.
a. A criopreservação compreende a manutenção de materiais a temperaturas baixas (de 
-20ºC a -80ºC em freezers) e ultrabaixas (de -150 °C a -196 °C em contêineres de ni-
trogênio líquido).
b. A repicagem contínua ou periódica de células ou microrganismos promove a manu-
tenção constante de estoque desses materiais biológicos, garantindo a longevidade 
das amostras.
c. O congelamento com temperaturas até -4ºC é amplamente utilizado e é muito eficaz, 
sendo esse método, apesar de oneroso, utilizado em qualquer material biológico.
d. A liofilização consiste na manutenção de amostras de material biológico imersas em 
água ultrapura (Milli-Q) em locais com luz infravermelha por aproximadamente 24 ho-
ras. Após esse período, as amostras ficam preservadas por até dois anos em tempera-
tura ambiente.
COMENTÁRIO
Métodos de preservação a longo prazo:
• Liofilização;
• Congelamento no ultra-freezer;
• Nitrogênio líquido. 
2. (CESPE/2014/INPI/PESQUISADOR EM PROPRIEDADE INDUSTRIAL) “A partir de um 
material microbiológico coletado na Antártica, pesquisadores buscam desenvolver um 
novo espessante para sorvetes à base de uma proteína com ação anticongelante prove-
niente de uma das cepas bacterianas que foram isoladas”. Folha de S.Paulo. Caderno 
Ciência. 26/6/2009 (com adaptações).
Julgue o item que se segue, relativo às informações do fragmento de texto acima e à meto-
dologia adequada ao manuseio e à armazenagem dosmicrorganismos nele mencionados.
A médio prazo, a técnica de repique contínuo seria a única eficaz para a manutenção e 
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para a preservação de cepas bacterianas provenientes da Antártica, visto que essas bac-
térias possuem propriedades anticongelantes.
COMENTÁRIO
A técnica de repique contínuo é uma técnica de conservação de curto prazo (aproximadamente 
30 dias).
3. Liquid-drying é um método de preservação de microrganismos baseado no congelamen-
to e posterior liofilização.
COMENTÁRIO
Liofilização: freezing-drying.
4. (FUNDEP/GESTÃO DE CONCURSOS/2017/UFVJM/MG/TÉCNICO DE LABORATÓRIO/
BIOLOGIA) Considere que um pesquisador precisa manter suas culturas de Escherichia 
coli sempre vivas e ativas em um experimento de curta duração. Assinale a alternativa 
que apresenta corretamente o método indicado para a manutenção dessas culturas.
a. Secagem em sílica.
b. Repique contínuo.
c. Liofilização.
d. Criopreservação em NL2.
COMENTÁRIO
a. Médio prazo.
b. Curta duração.
c. Longo prazo.
d. Longo prazo. 
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Métodos Utilizados na Preservação de Microrganismos - Questões
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5. (FGV/2010/FIOCRUZ/TECNOLOGISTA EM SAÚDE/BACTERIOLOGIA DA PRODU-
ÇÃO) A preservação a curto e a longo prazo de microrganismos para estudos futuros é 
uma tradição na microbiologia. As coleções de cultura de microrganismos são recursos 
valiosos para estudos sobre a diversidade e a evolução microbianas, investigações epi-
demiológicas, além de propostas educacionais. Existem vários métodos de preservação 
de microrganismos e um estoque efetivo é aquele capaz de manter um organismo viável, 
livre de contaminação e sem alterações fenotípicas ou genotípicas. Sobre os métodos de 
preservação de bactérias em microbiologia, assinale a alternativa correta.
a. No método de preservação com óleo mineral, um inóculo do microrganismo deve ser 
semeado em ágar inclinado e, após o crescimento, uma camada de 1 a 2 cm de óleo 
mineral deve ser adicionada. Diferentemente do método de subcultivo em meios fres-
cos, o método com óleo mineral dispensa a realização de repique contínuo.
b. Microrganismos podem sofrer danos durante o congelamento, a estocagem e o des-
congelamento. Dessa forma, agentes crioprotetores são frequentemente adicionados 
nas suspensões de cultura. Um importante agente crioprotetor é o glicerol, adicionado 
na concentração de 10%.
c. Dentre os métodos de preservação, o subcultivo em meios frescos e o método de 
preservação com óleo mineral preservam bactérias por curtos períodos, enquanto o 
método de secagem, o congelamento a – 20ºC e o congelamento a – 70ºC preservam 
por períodos mais longos.
d. O método mais simples e muito usado em bactérias de manutenção de microrganismos 
viáveis a curto prazo, é o subcultivo em meios frescos. É um método simples que pre-
serva as características fenotípicas da cepa por mais de uma semana.
COMENTÁRIO
a. Exige diversos repiques contínuos.
c. Óleo mineral / secagem /congelamento a – 20º: médio prazo. Congelamento a – 70º é 
longo prazo.
d. Risco de mutação. 
6. (IF/TO/2016/TÉCNICO DE LABORATÓRIO/FITOSSANIDADE) É considerada como for-
ma de armazenamento de microrganismos por longos períodos:
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a. Liofilização.
b. Armazenamento em água.
c. Repicagens periódicas.
d. Método de Castellani.
COMENTÁRIO
a. Longo prazo.
b. Médio Prazo.
c. Curto prazo.
d. Médio Prazo.
7. (FGV/2010/FIOCRUZ/TECNOLOGISTA EM SAÚDE/PRODUÇÃO DE VACINAS VIRAIS) 
Sobre criopreservação e armazenamento de linhagens celulares, analise as afirmati-
vas a seguir.
I – Quando uma célula é exposta a baixas temperaturas, geralmente acontece formação 
de cristais de gelo podendo romper a membrana celular e acarretar na morte da célula.
II – Para que as células sejam protegidas do processo de congelamento e descongela-
mento devem ser tratadas com um agente crioprotetor como o EDTA.
III – O armazenamento em nitrogênio líquido é uma forma de estocar células de modo a 
preservar a capacidade proliferativa e a viabilidade celulares.
Assinale:
a. Se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
b. Se somente as afirmativas I e III estiverem corretas.
c. Se somente as afirmativas II e III estiverem corretas.
d. Se somente a afirmativa III estiver correta.
e. Se todas as afirmativas estiverem corretas.
COMENTÁRIO
I – Motivo para se utilizar o crio preservador.
II – EDTA não é o mais indicado.
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III – Vantagem do armazenamento em nitrogênio líquido.
8. (FGV/2010/FIOCRUZ/TECNOLOGISTA EM SAÚDE/MANUTENÇÃO DE COLEÇÕES 
BIOLÓGICAS EM SAÚDE) É recomendado que cada estirpe em uma coleção de micro-
-organismos seja mantida por, pelo menos, dois procedimentos diferentes. Pelo menos um 
desses procedimentos deve ser por liofilização ou criopreservação pois esses métodos:
a. Ocupam menos espaço físico na coleção.
b. São propícios para a identificação posterior por técnicas moleculares.
c. Podem ser feitos em duplicata e guardados em lugares diferentes.
d. Minimizam o risco de modificação genética do material.
e. São mais baratos para a instituição.
COMENTÁRIO
Em liofilização e métodos que usam temperaturas baixas, a principal característica é a 
instabilidade genética.
9. (CS/UFG/2017/ASSISTENTE DE LABORATÓRIO) Os equipamentos utilizados na pre-
servação de microrganismos em laboratório são:
a. Liofilizador, forno Pasteur e estufa.
b. Freezer, forno de micro-ondas e liofilizador.
c. Câmara de Newbauer, vórtex e geladeira.
d. Geladeira, freezer e câmara com nitrogênio líquido.
COMENTÁRIO
a. Forno Pasteur é utilizado para esterilizar.
b. Não se fala em micro-ondas.
c. Câmara de Newbauer é utilizado para fazer contagem de células.
GABARITO
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