Técnicas de Preservação de Microrganismos

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16/11/2015 
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Técnicas de Preservação de 
Microrganismos 
Lara Durães Sette 
CBMAI-CPQBA/UNICAMP 
lara@cpqba.unicamp.br 
Importância da preservação 
 armazenamento de culturas por longos períodos e 
utilização periódica para pesquisa e/ou produção 
– contaminação 
– perda de viabilidade 
– mutação (perda das características fisiológicas) 
 
 solução → metodologia de preservação de longa duração 
– diminuição do crescimento e das atividades metabólicas 
 crescimento em meio mínimo 
 resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura 
 
Importância da preservação 
 
 preservação a longo prazo 
– evita problemas com o novo isolamento de microrganismos 
– economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo 
 
 
 importante função da coleção de culturas 
– pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação 
por períodos prolongados 
– garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza 
 
 
 
 
Escolha do método de preservação 
 pontos a serem considerados 
 
– manutenção da viabilidade: perda de células no processo de 
preservação e durante o armazenamento 
 
– manutenção das propriedades originais: perda de características 
de interesse científico ou industrial 
 
– pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo 
 
– custos de preservação e manutenção 
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Escolha do método de preservação 
– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente 
e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento 
 
– importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas 
com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método 
 
– necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades 
adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para 
embalagem de envio e condições de transporte 
 
– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e 
financeiros 
 
 
Métodos de preservação 
 curto prazo 
– repique contínuo 
 
 médio prazo 
– preservação em óleo mineral 
– preservação em água 
– congelamento a -20°C 
– secagem em sílica, solo e papel de filtro 
 
 longo-termo 
– liofilização 
– congelamento a -80°C 
– criopreservação em nitrogênio líquido 
 princípio 
– diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura) 
 
 fatores a serem considerados 
– meio adequado para manter a cultura 
– temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; 
geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses 
– freqüência entre as transferências: determinação empírica 
 minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes 
 examinar a pureza em cada transferência 
 conservar em duplicata 
Repique contínuo Repique contínuo 
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 vantagens 
– baixo custo 
– não requer equipamentos especializados 
– o manuseio é simples 
 
 desvantagens 
– riscos de contaminação e possível perda da linhagem 
– perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade 
– seleção de células atípicas (variantes ou mutantes) 
– supervisão especializada 
– mão-de-obra 
– espaço relativamente grande para a armazenamento 
Repique contínuo 
 
 princípio 
– diminuição da atividade metabólica 
 
 fatores a serem considerado (Castellani) 
– espessura do ágar 
– número de blocos na água 
Preservação em óleo mineral e em água 
Preservação em óleo mineral 
Preservação em óleo 
armazenamento em geladeira 
vantagens 
- ↓ custo de equipamento 
- evita contaminação por ácaros 
 
desvantagens 
- necessidade de mais transferências 
 até que a cultura revigore 
- requer espaço para amazenamento 
 
Preservação em água (Castellani) 
Geladeira 
Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada 
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Preservação em água 
vantagens 
- boa taxa de viabilidade 
- evita contaminação por ácaros 
 
desvantagens 
- limitado a organismos que 
 aderem ao ágar (Castellani) 
- dificuldade da retirada dos cubos 
 na reativação (Castellani) 
- crescimento durante a estocagem 
- requer espaço p/ amazenamento 
- riscos de contaminação 
 
 
Preservação em água 
armazenamento em geladeira 
Secagem 
 
 princípio 
– diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira 
 
 fatores a serem considerados 
– tipo de célula 
– idade da cultura 
– concentração celular 
– condições de estocagem 
 
Secagem em sílica e em solo Secagem em papel de filtro 
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Secagem 
 vantagens 
– simples e de baixo custo 
– não requer equipamento especial 
– estabilidade elevada 
– ácaros não sobrevivem 
 
 desavantagens 
– métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados 
– risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo 
– papel: poucos dados sobre o sucesso do método 
Liofilização 
 princípio 
– remoção da água por sublimação 
 
 fatores a serem considerados 
– tipo de células 
– idade da cultura 
– concentração celular 
– agentes crioprotetor 
– condições de estocagem 
– método de reidratação 
 
Liofilização 
 
 agentes crioprotetores 
– reduzem danos durante o congelamento e descongelamento 
– estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem 
 
 leite desnatado (skim milk) 10% 
 leite desnatado 10% + inositol 5% 
 sacarose 7% + peptona 7% 
 inositol 5% em soro de sangue de cavalo 
 
Liofilização 
3 mL 
Skim Milk 
Cultura pura 0,2 mL 
 na ampola 
Maçarico Liofilizador 
Maçarico 
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Liofilização - reativação Liofilização 
 vantagens 
– vedação total da amostra 
– longa viabilidade 
– estabilidade elevada em muitas espécies 
– produção em larga escala 
– não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz) 
– fácil distribuição e transporte 
 
 desvantagens 
– muitas espécies não sobrevivem ao processo 
– viabilidade ocasionalmente insatisfatória 
– mão-de-obra especializada 
– requer equipamentos sofisticado 
Congelamento em ultrafreezer 
 princípio 
– indução da dormência do microrganismo 
– armazenamento a - 80˚C 
 
 fatores a serem considerados 
– tipo de microrganismo 
– idade da cultura 
– concentração celular 
– agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração 
maior) 
– condições de estocagem 
– método de descongelamento 
Congelamento 
10 mL 
Fungos filamentosos não 
esporulados 
Bactérias, arqueas e leveduras 
Fungos filamentosos esporulados 
7 mL 
1 mL 
1 mL 1 mL 
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Congelamento em ultrafreezer Congelamento em nitrogênio líquido 
 princípio 
– indução da dormência do microrganismo 
– armazenamento a - 196˚C 
 
 fatores a serem considerados 
– tipo de microrganismo 
– idade da cultura 
– concentração celular 
– agente crioprotetor 
– condições de estocagem 
– método de descongelamento 
Congelamento em nitrogênio líquido Congelamento em nitrogênio líquido 
 vantagens 
– condições estáveis por longos períodos 
– vedação completa, evitando contaminação 
– utilização para esporulados e não esporulados 
 
 desvantagens 
– viabilidade ocasionalmente insatisfatória 
– requer equipamento sofisticado 
– suprimento contínuo de N2 
– boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento 
 
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Controle de qualidade de preservação 
 
 contagem de população viável antes e após preservação 
– determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no 
protocolo utilizado 
– aplicável a métodos de médio e longo-termo 
– imprescindível para garantia de preservação de longo-termo 
 
 pureza 
– logo após o processamento do lote 
 
 viabilidade 
– primeira pós: até um mês após o processamento 
– segunda pós em diante: anualmente 
 
Controle de qualidade de preservação 
 
 
 
 Suspensão de 
células em 
crioprotetor 
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 
(10-8) (10-6) (10-4) (10-2) 
9,9 mL água 
+ 0,1% ágar 
10-2 10-4 
10-8 10-6 
no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x(fator de diluição) UFC/mL