RELATÓRIO 3 DE ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

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RELATÓRIO DE ANÁLISES TOXICOLÓGICAS
Caroline Rosa Pereira 						Farmácia, Turma 2 
Thaís Prado de Oliveira
Maria Thereza Homem 
Determinação de Ácido delta-aminolevulínico
 
Introdução
O chumbo foi um dos primeiros metais que o homem aprendeu a usar. Por ser utilizado de forma tão intensiva e por tão longo tempo, a história de sua intoxicação é extensa. Os casos atuais de intoxicação são em geral, mais brandos do que os de 50 anos atrás. Os casos de toxicidade resultam tanto da exposição ambiental quanto da industrial. É considerado uma doença crônica, às vezes com episódios sintomáticos agudos que levam ao efeito crônico irreversível. Seus compostos inorgânicos apresentam duas vias de absorção: 1. Respiratória: importante via na exposição ocupacional. 2. Digestiva: rota predominante. Após a absorção, é distribuído pelo sangue, inicialmente nos tecidos moles, principalmente no epitélio tubular dos rins e fígado, onde parte é excretada na bile, outra é armazenada e uma terceira penetra na circulação na forma de fosfato de chumbo. Com o tempo, é redistribuído e depositado nos ossos (95%), dentes e cabelo, provavelmente por seguir as rotas metabólicas do cálcio.
Finalidade da Análise
O chumbo detém grande afinidade por radicais sulfidrila, o que lhe confere capacidade de interferir com grande número de sistemas enzimáticos. Um dos seus efeitos mais estudados é a capacidade de interferir com a biossíntese do heme, particularmente inibindo as atividades da ALA-D e da ferroquelatase. A ferroquelatase é uma enzima mitocondrial que se incumbe da parte final da formação do heme, que é a incorporação do ferro a protoporfirina IX. Por sua vez, a ALA-D é uma enzima citoplasmática da biossíntese, que é a formação do porfobilinogênio a partir de duas moléculas de ácido delta-aminolevulinico. Da inibição da ALA-D é inversamente proporcional a concentração de chumbo no sangue a partir de 10 ug/dL, embora, aparentemente, não haja uma concentração limiar de chumbo para a inibição da enzima. A determinação da atividade da ALA-D permite a verificação de efeito associado ao chumbo em níveis de exposição inferiores aos limites para o indicador biológico da exposição ocupacional, e, dos efeitos mensuráveis para o chumbo, representa o de maior especificidade e maior sensibilidade. 
A técnica fundamenta-se em determinar a concentração ácido delta-aminolevulínico (ALA) na urina, pois este é um biomarcador de exposição ao chumbo e o mais aceito para avaliar exposições biológicas ao metal. 
Fundamento da técnica
A alteração bioquímica produzida pelo chumbo, ou seja, a inibição da ALA-D pode ser quantificada através da condensação do ALA com uma molécula de acetoacetato de etila formando um complexo ALA-pirrol. Esse complexo é extraído com acetato de etila e colocado para reagir com Reativo Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldeído) formando um complexo de coloração rosa chamado ALA-pirrol-PABA, em seguida, quantificado por espectrofotometria visível no comprimento de onda de 553 nm.
Procedimento
4.1 Amostra
 Amostra de urina 3°
 (tubo A3)
 
 A3 I REF I
1mL de urina do tubo A3 1mL de urina do tubo A3
+ 1mL de tampão acetato + 1mL de tampão acetato
Adicionar 200µL (0,2mL) Banho fervente por 10 min
 Acetoacetato de etila
 Agitar por 5s
Formação do Complexo
ALA-pirrol
Banho fervente por 10 min
Esfriar com água da torneira
Adicionar 3mL Acetato de etila
Centrifugar por 3 min para
separação da fase orgânica
Retirar 2mL da fase orgânica
(superior) e transferir para outros
dois tubos A3 II e REF II
 
		 A3 II REF II		
 
			 A3 II				REF II
		Adicionar 2mL do Adicionar 2mL do
	 Reagente Ehrlich Reagente Ehrlich
	 Aguardar 10 min Aguardar 10 min
	 Transferir para Cubeta Transferir para Cubeta 
 de vidro de vidro
 Realizar leitura ƛ=553 nm Zerar (espectrofotômetro)
		Anotar valor da Absorbância	Realizar leitura ƛ=553 nm
 Anotar valor da Absorbância
4.2 Padrão
 B I 2 I	 5 I 	 10 I 	 20 I 	 30 I
 	 
 1mL 0,96mL(960µL) 0,90mL(900µL) 0,80mL(800µL) 0,60mL(600µL) 0,40mL(400µL) de água de água de água de água de água de água
	 +0,04 (40µL) +0,1mL(100µL) +0,2 (200µL) +0,4mL (400µL) +0,6mL (600µL
 de padrão de padrão de padrão de padrão de padrão
Adicionar 1mL de tampão acetato
Adicionar 200µL(0,2mL)
Acetoacetato de etila
Agitar por 5 segundos
Formação do Complexo
ALA-pirrol
Banho fervente por 10 min
Esfriar com água da torneira
Adicionar 3mL Acetato de etila
Centrifugar por 3 min para
separação da fase orgânica
Retirar 2mL da fase orgânica
(superior) e transferir para outros
tubos
 B II 2 II	 5 II 	 10 II 	 20 II 	 30 II
 	 
 B II 2 II	 5 II 	 10 II 	 20 II 	 30 II
 	 
Adicionar 2mL do
Reagente Ehrlich
Aguardar 10 min
Transferir para Cubeta
de vidro
Zerar com B II (espectrofotômetro)
Transferiu cada amostra para Cubeta
de vidro e realizou-se a leitura =553 nm para cada uma
Anotar valores das Absorbâncias
Resultados 
	Concentração (mg/L)
	Absorbância 1
	Absorbância 2
	0
	0
	0
	02
	0,040
	0,148
	05
	0,066
	0,300
	10
	0,844
	0,774
	20
	1,626
	1,496
	30
	1,955
	0,972
Para a plotagem do gráfico e realização da curva com melhor resultado, foram utilizados os valores da absorbância 2, sendo que o valor da concentração de 30mg/L foi descartado para obter-se um R² de valor considerával. 
Gráfico: Curva de Calibração Absorbância x Concentração (mg/L)
Cálculos para determinação do ALA
Abs da amostra 3 = 0,840
y = 0,0758x – 0,0173
0,840 = 0,0758x - 0,0173
0,0758x = - 0,0173 – 0,840
x = 11,310 mg/L
Cálculos para determinação de creatinina
Amostra 3 
 11,310 mg ALA/L 1,5 g/L creatinina
 x 	1 g/L creatinina
x= 7,54 mg ALA/ g creatinina
VR ALA= 4,5 mg ALA/ g creatinina
VR CREATININA= 0,3 g/L a 3,0 g/L
IBMP= 10 mg ALA/ g creatinina
Conclusão
 O valor de referência de acordo com a legislação é VR creatinina 0,3 g/L a 3 g/L, o índice biológico máximo permitido (IBMP) determina um valor máximo 10 mg ALA/g creatinina no qual se supõe que valores acima disso, é necessário acompanhamento médico,já o VR ALA o máximo é 4,5mg/g de creatinina. De acordo com os resultados obtidos pode se afirmar que o indivíduo da amostra 3 não foi exposto ao metal, uma vez que o valor de ALA está abaixo tanto para o valor de referência creatinina quanto para o IBMP, para valor de referência ALA, está acima do VR , indicando que o mesmo foi exposto, porém isso pode não acarretar danos expressivos no organismo, depende de cada indivíduo. 
Bibliografia
MOREAU, R. L. M.; SIQUEIRA, M. E. P. B. Toxicologia Analítica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010.